Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Vincristin mit verbesserter Ausbeute aus Pflanzenteilen von Vinca rosea L.
Das Vincristin ist ein ausserordentlich wichtiges Cytostatikum, welches auch bei akuter Leukämie im Kindesalter lebensrettend ist (Haggard, M.E.: Cancer Chemother. Reports, 52, 477/1968), ferner bewirkt seine Anwendung bei Erkrankungen mit harten Geschwulsten im Kindesalter in 60-65% der Fälle eine wesentliche Regression (Selavry, D., Holland, J.F., Wolmsn, I.J.: Cancer Chemother. Reports, 52 497/1968).
Es ist bekannt, dass das Vincristin ein dimeres Alkaloid von Vinca rosea L. ist, dessen Menge einige Zehntel Prozent der in der Pflanze enthaltenen Alkaloidgesamtmenge ausmacht, weswegen die aus der Pflanze herstellbare Vincristinmenge dem auftretenden Bedarf bei weitem nicht gerecht werden kann.
Nicht bekannt war bisher jedoch, dass das N-Desmethylvinblastin als dimeres Alkaloid ebenfalls in Vinca rosea L.
enthalten ist.
Die Herstellung des N-Desmethylvinylblastins wird im Beispiel 1 der US Patentschrift Nr. 3 354 163 beschrieben.
Nach dem Verfahren wird reines Vincristinsulfat in 0.1%iger wässeriger Schwefelsäure gelöst und die Lösung, deren pH-Wert 2,03 beträgt, 18 Stunden lang gesiedet. Die erhaltene klare Lösung wird mit konzentriertem Ammoniak alkalisch gemacht, mit Methylenchlorid extrahiert, das Extrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Methylenchlorid angefeuchtet und in Äther gelöst. Der unlösliche Anteil wird durch Zentrifugieren entfernt und die darüber stehende klare Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der trockene Rückstand beträgt 73% der als Ausgangsstoff eingesetzten Vincristinmenge. Der Trockenrückstand wird in Benzol gelöst, auf einer mit Aluminiumoxyd gefüllten Säule chromatographiert und mit einer Mischung von Benzol und Chloroform eluiert. Bei der chromatographischen Trennung werden zwei Komponenten gewonnen.
Die in grösserer Menge anfallende Komponente ist N-Desmethylvinblastin, die in geringerer Menge erhaltene Komponente das als Nebenprodukt anfallende Desacetyl-N-desmethylvinblastin. In dem Beispiel wird das Mengenverhältnis der beiden Komponenten nicht angegeben, es wird nur erwähnt, dass bei einem pH-Wert von unter 2 die Menge des Desacetylproduktes ansteigt, bei einem pH-Wert von über 2,5 die Umsetzung des Vincristins nicht vollständig ist. Im Beispiel 3 der erwähnten Patentschrift wird die Formylierung des N-Desmethylvinblastins mit Ameisensäure in Gegenwart von Essigsäureanhydrid erläutert. Auf diese Weise kann das durch die Dementylierung des Vincristins erhaltene N-Desmethylvinblastin mit ungefähr 50%-iger Ausbeute erneut zu Vincristin umgesetzt werden.
Im beschreibenden Teil der Patentschrift wird ferner erwähnt, dass das N-Desmethylvinblastin auch aus Vinblastin hergestellt werden kann, und zwar durch Demethylierung. die mit einem schwach oxydierenden System, zum Beispiel mittels biologischer Oxydation durch Wasserstoffperoxyd und Peroxydase-Enzym, durch- geführt wird. Bezüglich der Herstellung des N-Desmethylvinblastins aus Vinblastin wird jedoch über diese Feststellung hinaus keinerlei Unterweisung gegeben.
Der Nachteil des in der erwähnten Patentschrift erläuterten Verfahrens besteht darin, dass das wertvollste Alkaloid von Vinca rosea L., das Vincristin, nach seiner Reinherstellung mittels dieses komplizierten und deswegen ausserordentlich teuren Verfahrens zum N-Desmethylvinblastin abgebaut und aus diesem nur mit ungefähr 50%-iger Ausbeute zurückgewonnen werden kann.
Zur Herstellung von Vincristin ist weiterhin die US Patentschrift Nr. 3 205220 bekannt, nach der die getrocknete Vinca rosea L. nach einer sauren Vorbehandlung mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und nach einem Reinigungsvorgang, der in mehrfachem Umlösen mittels Wasser und organischem Lösungsmittel besteht, die Lösung zur Trockne eingedampft wird. Die auf diese Weise gewonnene, schwach basische Alkaloidfraktion von komplizierter Zusammensetzung, welche die dimeren Alkaloide alles in allem zu 1-2%, das gewünschte Vincristin nur zu einigen hundertstel Prozent enthält, wird durch Chromatographie aufgetrennt und das reine Vincristin auf diese Weise gewonnen.
Der Nachteil des Verfahrens besteht darin, dass zur Reinherstellung der wenigen hundertstel Prozent Vincristin die bei der Extraktion von Vinca rosea L. gewonnene, schwach basische Alkaloidfraktion von komplizierter Zusammensetzung zuerst chromatographiert und dann in Abhängigkeit vom pH-Gradienten extrahiert werden muss.
Es ist das Ziel der Erfindung, die Menge des aus Vinca rosea L. gewinnbaren Vincristins zu steigern und mittels Formylierung des durch eigene Versuche zum ersten Male isolierten natürlichen N-Desmethylvinblastins weiteres pharmazeutisch wertvolles Vincristin herzustellen.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass nach der ungarischen Patentschrift Nr. 160 967 die dimeren Alkaloide von Vinca rosea L. aus dem entsprechend gereinigten Extrakt durch Säure, zum Beispiel durch äthanolische Schwefelsäure, in Gestalt eines ungefähr 70% dimeres Alkaloid enthaltenden Säureadditionssalzes abgetrennt beziehungsweise im Extrakt angereichert werden können, und dass diese Mischung dimerer Alkaloide neben den Säureadditionssalzen von Vinblastin, Vinleurosin, Vincristin und anderer dimerer Alkaloide auch das in Vinca rosea L. bisher nicht bekannte, aus dem Pflanzenmaterial durch eigene Versuche zum ersten Male isolierte N-Desmethylvinblastin enthält.
Wenn also die ungefähr 70% dimere Alkaloide enthaltende Mischung von Säureadditionssalzen oder gegebenenfalls das aus dem Gemisch der Säureadditionssalze freigesetzte Gemisch dimerer Alkaloidbasen formyliert wird, so wird auch das in Vinca rosea L. vorkommende natürliche N-Desmethylvinblastin in Form von Vincristin gewonnen. Die Formylierung wird in an sich bekannter Weise, zum Beispiel mit Ameisensäure in Essigsäureanhydrid vorgenommen.
Die Erfindung ist also ein Verfahren zur Gewinnung von Vincristin mit verbesserter Ausbeute aus dem Extrakt von Vinca rosea L. und kann dadurch gekennzeichnet, werden, dass die aus Pflanzenteilen von Vinca rosea L. gewonnene und angereicherte, auch das natürliche N-Desmethylvinblastin enthaltende Mischung dimerer Alkaloide beziehungsweise die daraus gewonnene Mischung von Säureadditionssalzen formyliert, aus dem formylierten Gemisch das Vincristin in bekannter Weise gewonnen und gegebenenfalls zu einem Säureadditionssalz umgesetzt wird.
Zweckmässig wird dabei so vorgegangen, dass ein rohes Alkaloidsulfatgemisch, dessen Gewinnung in der ungarischen Patentschrift Nr. 160 967 beschrieben ist, in einem Gemisch aus Ameisensäure und Essigsäureanhydrid gelöst und das Reaktionsgemisch einige, zweckmässig 1-10 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen wird. Während dieser Zeitspanne geht die Formylierung des in der Alkaloidsulfatmischung vorliegenden N-Desmethylvinblastins zu Vincristin vor sich. Danach wird das Reaktionsgemisch unter Kühlung in das ungefähr 5-fache Volumen Wasser gegossen, wobei darauf zu achten ist, dass sich die Temperatur der wässerigen Lösung nicht über 10"C erhöht, sondern vorteilhaft 0-5"C beträgt.
Darauf folgend wird die saure Lösung, ebenfalls unter Kühlung, mit wässerigem Ammoniak auf pH 8,5-9,0 eingestellt, anschliessend mehrfach mit einem organischen Lösungsmittel, vorteilhaft mit Methylenchlorid, bis zur Abwesenheit von Alkaloiden extrahiert. Die beiden Pha sen werden voneinander getrennt, die organischen Phasen vereinigt, getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der sandfarbene Rückstand enthält das N-Desmethylvinblastin, das in der Ausgangsmischung der Alkaloidsulfate enthalten war, bereits in Form von Vincristin. Dieser sandfarbene Rückstand wird in einem Lösungsmittel, zweckmässig in Äthanol gelöst und mit 1 %-iger äthanolischer Schwefelsäure versetzt. Die Lösung wird einige Zeit stehen gelassen, wobei das Gemisch der formylierten Alkaloidsulfate auskristallisiert. Diese werden abfiltriert, gewaschen und getrocknet.
Die Auftrennung des in der beschriebenen Weise erhaltenen Sulfatgemisches der dimeren Alkaloide kann zum Beispiel in folgender Weise erfolgen: Die Substanz wird in einem 2:1 Gemisch von Methylenchlorid und Chloroform gelöst und auf einer mit teilweise desaktiviertem Aluminiumoxyd gefüllten Säule chromatographiert. Bei der chromatographischen Trennung wird das Sulfat gebunden, die Fraktionen des Eluates enthalten die getrennten dimeren Alkaloide in Form der freien Basen. Die Eluierung wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch durchgeführt wie weiter oben angegeben. Die erste Fraktion enthält Begleitalkaloide, die folgenden enthalten das Vinblastin und das eventuell vorhandene Vinleurosin. Darauf folgt die das Vincristin enthaltende Fraktion.
Die in den einzelnen Fraktionen gelöst enthaltenen dimeren Alkaloide werden mittels Papier- beziehungsweise Dünnschichtchromatographie identifiziert. Fraktionen, die identische dimere Alkaloide enthalten, werden vereinigt und unter schonenden Bedingungen, zweckmässig unter vermindertem Druck, eingedampft. Die voneinander abgetrennten, amorphen dimeren Alkaloidbasen werden in einem Lösungsmittel, zweckmässig in Äthanol, gelöst und mit I %-iger äthanolischer Schwefelsäure zu ihren Sulfaten umgesetzt. Das erhaltene Vincristinsulfat enthält dadurch nicht nur das in Vinca rosea L. vorkommende Vincristin, sondern ausserdem noch zusätzlich das durch Formylierung des in der Pflanze vorkommenden natürlichen N-Desmethylvinblastins gewonnene Vincristin.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass das nach der Formylierung erhaltene Gemisch dimerer Alkaloidbasen unmittelbar, also ohne Umsetzen zum Sulfat, aufgetrennt wird. In diesem Falle wird das Gemisch der dimeren Alkaloidbasen in Benzol gelöst und auf einer mit Benzol getränktes Aluminiumoxyd enthaltenden Säule chromatographiert. Zuerst wird mit Benzol eluiert, welches den grössten Teil der monomeren Begleitalkaloide herauslöst. Danach wird mit Benzol und Chloroform im Verhältnis 2:1 weiter eluiert und zum Schluss ein 1:1 Gemisch von Benzol und Chloroform angewendet. Die Aufarbeitung der Fraktionen erfolgt auf die weiter oben beschriebene Weise.
Das in Vinca rosea L. vorkommende natürliche N-Desmethylvinblastin kann zum Beispiel auf folgende Weise gewonnen werden: Das rohe Alkaloidsulfatgemisch, dessen Gewinnung in der ungarischen Patentschrift Nr. 160 967 beschrieben ist, wird in der ungefähr 40-fachen Menge Wasser gelöst, die wässerige Lösung mit Ammoniak auf einem pH Wert von 8,5-9,0 eingestellt und mit einem organischen Lösungsmittel, vorteilhaft mit Methylenchlorid, mehrmals bis zur Abwesenheit von Alkaloid extrahiert. Die Phasen werden voneinander getrennt, die organischen Phasen vereinigt, getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Auf diese Weise wird ein Gemisch amorpher dimerer Alkaloidbasen erhalten, welches in einem lmpolaren Lösungsmittel, zweckmässig in Benzol, gelöst und die Lösung auf einer mit Benzol angefeuchtetes Aluminiumoxyd enthaltenden Säule chromatographiert wird. Eluiert wird mit einem 3:1 Gemisch von Benzol und Chloroform. Es werden jeweils
Fraktionen von 100 ml aufgefangen und die in den einzel nen Fraktionen gelöst enthaltenen Alkaloide mit Dünn schicht- beziehungsweise Papierchromatographie identifiziert.
Die erste Fraktion enthält einen Teil der Begleitalkaloide und das Vinblastin, die folgenden enthalten das N-Desmethyl vinblastin, die darauf fogenden das Vincristin. Die Fraktio nen, die das N-Desmethylvinblastin enthalten, werden verei nigt und in schonender Weise, zweckmässig unter verminder tem Druck, zur Trockne eingedampft. Das N-Desmethylvin blastin wird in einem polaren Lösungsmittel, zweckmässig in Äthanol, gelöst und mit 10%-iger äthanolischer Schwefel säure zu N-Desmethylvinblastinsulfat umgesetzt. Die Lösung wird stehen gelassen, wobei das Produkt auskristallisiert.
Gegenüber den bisher bekannten Verfahren hat das erfindungsgemässe Verfahren den Vorteil, dass das in Vinca rosea L. vorkommende, natürliche N-Desmethylvinblastin, welches durch eigene Versuche zum ersten Mal erkannt und aus dem pflanzlichen Material isoliert wurde, unmittelbar zum Vincristin umgesetzt werden kann.
Der fortschrittliche Charakter des erfindungsgemässen
Verfahrens, verglichen mit den in der amerikanischen Pa tentschrift Nr. 3 205 220 und in der ungarischen Patentschrift
Nr. 160967 beschriebenen Methoden, geht aus der folgenden
Tabelle hervor. (Die in der Tabelle enthaltenen Angaben bezeichnen Vincristinrnengen, die aus Pflanzen identischer
Qualität gewonnen werden können
Vincristinsulfat mg/kg Pflanzen- material
US Patentschrift Nr. 3 205 220 4 ungarische Patentschrift Nr. 160 967 6,5 erfindungsgemässes Verfahren 10,8
Beispiel 1
3,85 g rohes Alkaloidsulfatgemisch, das nach dem Bei spiel 1 der ungarischen Patentschrift Nr. 160 967 gewonnen wurde, werden in einer Mischung aus 35 ml 98%-iger Amei sensäure und 5,75 ml Essigsäureanhydrid gelöst und bei Zim mertemperatur 5 Minuten stehen gelassen.
Danach wird die
Lösung in 150 ml Wasser von 0-5"C Temperatur gegossen und unter Kühlung mit ebenfalls gekühltem, konzentriertem wässerigen Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,5-9,0 einge stellt und mit 300 ml Methylenchlorid in mehreren Schritten bis zu negativer Alkaloidreaktion extrahiert. Die vereinigte und entwässerte Methylenchloridphase wird unter vermin dertem Druck zur Trockne eingedampft. Es werden 3,1 g eines sandfarbene, amorphen Gemisches von dimeren Alka loidbasen gewonnen, in dem das ursprünglich vorhandene
N-Desmethylvinblastin durch die Formylierung bereits als Vin cristin vorliegt. Das Gemisch wird in Äthanol gelöst und durch Zugabe von 1 %-iger äthanolischer Schwefelsäure das
Sulfatgemisch der dimeren Alkaloide abgetrennt. Es werden
2,46 g kristallines Sulfatgemisch der dimeren Alkaloide er halten.
Das kristalline Sulfatgemisch der dimeren Alkaloide wird in 20 ml Methylenchlorid-Chloroform-Gemisch im Verhält nis 2:1 gelöst und die Lösung auf einer 250 g mit Wasser teilweise desaktiviertes Aluminiumoxyd enthaltenden Säule chromatographiert, wodurch erstens die Sulfatgruppen ge bunden, zweitens die freien Alkaloidbasen getrennt werden.
Es wird mit einem Lösungsmittelgemisch der obigen Zusam mensetzung eluiert. Die dimeren Alkaloide werden in Form der freien Basen aus der Säule herausgelöst. Es werden Frak tionen von je 50 ml aufgefangen. Die Fraktionen 1-3 enthalten die Begleitalkaloide, die Fraktionen 4-9 das Vinblastin und das eventuell vorhandene Vinleurosin. Das Vincristin erscheint in der 9. Fraktion, seine Elution ist mit der le.
Fraktion beendet. Die das durch Papier- beziehungsweise Dünnschichtchromatographie identifizierte Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin enthaltenden Fraktionen werden getrennt bis zur Trockne eingedampft. Die erhaltenen amorphen dimeren Alkaloidbasen werden in der oben beschriebenen Weise zum Sulfat umgesetzt. Aus den Fraktionen 4-9 werden 2,0 g Vinblastinsulfat, aus den Fraktionen 9-18 0,25 g rohes Vincristinsulfat erhalten, welches aus einem 1:4 Gemisch von Methanol und Äthanol umkristallisiert wird.
[3D20 = +11.120 (c = 1; Wasser) RE = 0,30 (erscheint mit lebhaft blauer Farbe)
Die Verbindung wird mit Infrarotspektroskopie identifiziert. Bei 5,94 !St erscheint, verglichen mit dem IR-Spektrum des Vinblastins, eine ausgesprochen starke Absorptionsbande.
Die dünnschichtchromatographischen Untersuchungen werden mit dem Adsorbens Aluminiumoxyd G. Merck durchgeführt. Als Fliessmittel dient Chloroform, welches 0,5% Methanol enthält, entwickelt wird mit konzentrierter Phosphorsäure, die 1% Cerammoniumsulfat enthält.
Beispiel 2
Aus 3,1 g des nach Beispiel 1 gewonnenen sandfarbenen Gemisches amorpher dimerer Alkaloidbasen werden Vinblastin und Vincristin mittels Chromatographie abgetrennt.
Das Alkaloidbasengemisch wird in 15 ml Benzol gelöst und die Lösung auf einer Säule chromatographiert, die 150 g mit Benzol getränktes Aluminiumoxyd der Aktivität III enthält.
Zuerst wird mit 400 ml Benzol eluiert, wobei 50 ml-Fraktionen aufgefangen werden. Der grösste Teil der Begleitalkaloide wird durch das Benzol herausgelöst. Danach wird mit 450 ml eines Benzol-Chloroform-Gemisches im Verhältnis 2:1 weiter eluiert, wobei die noch verbliebenen monomeren Alkaloide und das nur in geringer Menge vorhandenen Vinleurosin herausgelöst werden. Durch Eluieren mit weiteren 450 ml 2:1 Benzol-Chloroform-Gemisch wird das Vinblastin erhalten. Zuletzt wird mit 1500 ml Benzol-Chloroform-Gemisch im Verhältnis 1:1 eluiert, wobei das noch am Adsorbens gebundene Vincristin herausgelöst wird. Die aufgrund von papier- beziehungsweise dünnschichtchromatographischen Untersuchungen getrennten Eluate werden zur Trockne eingedampft. Es werden 2,6 g amorphe Vinblastinbase erhalten, aus der auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise das Sulfat hergestellt wird.
Es werden 2,2 g kristallines Vinblastinsulfat erhalten.
Bei Eindampfen des Vincristin enthaltenden Eluates werden 0,32 g amorphe Vincristinbase erhalten, aus der nach Beispiel 1 das Sulfat hergestellt wird.
Ausbeute: 0,27 g rohes Vincristinsulfat
Ausbeute nach dem Umkristallisieren aus Methanol und Äthanol im Verhältnis 1:4. Es werden 0,21 g Vincristinsulfat erhalten. Die physikalischen Konstanten des Produktes sind mit den im Beispiel 1 angegebenen identisch.
Beispiel 3
Gewinnung von N-Desmethylvinblastin
6 g des rohen Sulfatgemisches dimerer Alkaloide, das nach der ungarischen Patentschrift Nr. 160 967 hergestellt wurde, werden in 100 ml Wasser gelöst, die wässerige Lösung mit verdünntem Ammoniak alkalisch gemacht und mit 3 x 100 ml Methylenchlorid bis zur Abwesenheit von Alkaloid extrahiert. Die beiden Phasen werden voneinander getrennt, die organischen Phasen vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Auf diese Weise werden 4,5 g amorphe dimere Alkaloidbase erhalten, die in 15 ml Benzol gelöst wird. Die Lösung wird chromatographiert, wobei als Adsorbens mit Benzol getränktes Aluminiumoxyd der Aktivität III verwendet wird. Die dimeren Alkaloide werden in folgender Weise eluiert: das Vinblastin wird mit 3600 ml einer 3:1 Benzol-Chloroform-Mischung herausgelöst.
Es werden Fraktionen von je 100 ml aufgefangen und die dimeren Alkaloide in den einzelnen Fraktionen mit Dünnschicht- beziehungsweise Papierchromatographie identifziert.
Die Fraktionen 1-9 enthalten einen Teil der Begleitalkaloide und das Vinblastin. Die Fraktionen 10-24 enthalten das N-Desmethylvinblastin. Die Fraktionen werden zur Trockne eingedampft, wobei ein trockener Rückstand von 0,35 g rohem N-Desmethylvinblastin erhalten wird.
Das N-Desmethylvinblastin wird in wasserfreiem Methanol gelöst und mit 1 %-iger ätherischer Schwefelsäure das N-Desmethylvinblastinsulfat abgetrennt. Dieses wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Es werden 0,26 g rohes N-Desmethylvinblastinsulfat erhalten, welches aus einem Gemisch von Methanol und Äthanol im Verhältnis 1:4 umkristallisiert wird.
Ausbeute: 0,24 g N-Desmethylvinblastinsulfat.
Aus dem erhaltenen Salz wird die N-Desmethylvinblastinbase freigesetzt. Die isolierte N-Desmethylvinblastinbase wurde durch folgende Angaben identifiziert.
[ JD'0 = + 15,80 (c = 1, Chloroform)
Schmelzpunkt: 210-2150C (Boetius)
UV-Absorptionsspektrum des N-Desmethylvinblastinsulfats:
E
211 46,504
258 11,300
286 10,740
294 9,965
310 4,995
Charakteristische Wellenlängen des IR-Spektrums von N-Desmethylvinblastin: 3560, 3440, 3000, 2956, 2940, 2930, 2870, 2830, 2785, 1740, 1620,1597, 1495, 1487, 1455, 1430, 1416, 1390, 1368, 1328, 1294, 1252,1235, 1195, 1164, 1140, 1126, 1112, 1075, 1060, 1035, 1006, 998, 975, 954, 915.
Bei der Chromatographie auf Aluminiumoxyd, Schicht D, unter Verwendung von Chloroform und Methanol im Verhältnis von 99,5:0,5 als Fliessmittel und bei Entwicklung durch Einsprühen mit konzentrierter Phosphorsäure, die 1 % Cerammoniumsulfat enthält, ist das N-Desmethylvinblastin durch einen bei Rf = 0,60 erscheinenden, erst orangefarbenen, später in lila übergehenden Fleck charakterisiert.
The invention relates to a process for the production of vincristine with improved yield from parts of plants of Vinca rosea L.
Vincristine is an extremely important cytostatic agent, which is also life-saving in acute leukemia in childhood (Haggard, ME: Cancer Chemother. Reports, 52, 477/1968); its use in diseases with hard tumors in childhood also causes 60-65% significant regression of the cases (Selavry, D., Holland, JF, Wolmsn, IJ: Cancer Chemother. Reports, 52 497/1968).
It is known that vincristine is a dimeric alkaloid of Vinca rosea L., the amount of which makes up a few tenths of a percent of the total amount of alkaloid contained in the plant, which is why the amount of vincristine that can be produced from the plant can by far not meet the requirements.
However, it was not previously known that N-desmethylvinblastine as a dimeric alkaloid is also found in Vinca rosea L.
is included.
The preparation of N-desmethylvinylblastine is described in Example 1 of US Pat. No. 3,354,163.
According to the method, pure vincristine sulphate is dissolved in 0.1% strength aqueous sulfuric acid and the solution, the pH of which is 2.03, is boiled for 18 hours. The clear solution obtained is made alkaline with concentrated ammonia, extracted with methylene chloride, the extract is evaporated to dryness in vacuo, the residue is moistened with methylene chloride and dissolved in ether. The insoluble fraction is removed by centrifugation and the clear solution above is evaporated to dryness in vacuo. The dry residue is 73% of the amount of vincristine used as the starting material. The dry residue is dissolved in benzene, chromatographed on a column filled with aluminum oxide and eluted with a mixture of benzene and chloroform. Two components are obtained in the chromatographic separation.
The component obtained in a larger amount is N-desmethylvinblastine, the component obtained in a smaller amount is the desacetyl-N-desmethylvinblastine obtained as a by-product. In the example, the quantitative ratio of the two components is not specified, it is only mentioned that at a pH below 2 the amount of deacetyl product increases, at a pH above 2.5 the conversion of the vincristine is not complete. In example 3 of the patent mentioned, the formylation of N-desmethylvinblastine with formic acid in the presence of acetic anhydride is illustrated. In this way, the N-desmethylvinblastine obtained by the dementylation of vincristine can be converted again into vincristine with a yield of approximately 50%.
In the descriptive part of the patent, it is also mentioned that N-desmethylvinblastine can also be produced from vinblastine, specifically by demethylation. which is carried out with a weakly oxidizing system, for example by means of biological oxidation by hydrogen peroxide and peroxidase enzyme. With regard to the production of N-desmethylvinblastine from vinblastine, however, no instruction is given beyond this statement.
The disadvantage of the process explained in the patent specification mentioned is that the most valuable alkaloid of Vinca rosea L., vincristine, is broken down into N-desmethylvinblastine after its pure production by means of this complicated and therefore extremely expensive process, and from this only about 50% - iger yield can be recovered.
For the production of vincristine, US Pat. No. 3,205220 is also known, according to which the dried Vinca rosea L. is extracted after an acidic pretreatment with an organic solvent and the solution after a cleaning process that consists of multiple redissolving with water and organic solvent is evaporated to dryness. The weakly basic alkaloid fraction of complex composition obtained in this way, which contains the dimeric alkaloids all in all 1-2%, the desired vincristine only a few hundredths of a percent, is separated by chromatography and the pure vincristine is obtained in this way.
The disadvantage of the process is that in order to purify the few hundredths of a percent of vincristine, the weakly basic alkaloid fraction of complicated composition obtained during the extraction of Vinca rosea L. must first be chromatographed and then extracted depending on the pH gradient.
The aim of the invention is to increase the amount of vincristine obtainable from Vinca rosea L. and to produce further pharmaceutically valuable vincristine by formylating the natural N-desmethylvinblastine isolated for the first time through our own experiments.
The invention is based on the knowledge that, according to Hungarian patent specification No. 160 967, the dimeric alkaloids of Vinca rosea L. are separated or separated from the correspondingly purified extract by acid, for example by ethanolic sulfuric acid, in the form of an acid addition salt containing approximately 70% dimeric alkaloid can be enriched in the extract, and that this mixture of dimeric alkaloids contains, in addition to the acid addition salts of vinblastine, vinleurosine, vincristine and other dimeric alkaloids, the N-desmethylvinblastine previously unknown in Vinca rosea L., which was isolated from the plant material for the first time through our own experiments .
If the mixture of acid addition salts containing approximately 70% dimeric alkaloids or, if appropriate, the mixture of dimeric alkaloid bases released from the mixture of acid addition salts is formylated, the natural N-desmethylvinblastine found in Vinca rosea L. is also obtained in the form of vincristine. The formylation is carried out in a manner known per se, for example with formic acid in acetic anhydride.
The invention is therefore a process for obtaining vincristine with improved yield from the extract of Vinca rosea L. and can be characterized in that the mixture obtained from plant parts of Vinca rosea L. and enriched, also containing the natural N-desmethylvinblastine, is dimeric Alkaloids or the mixture of acid addition salts obtained therefrom are formylated, the vincristine is obtained from the formylated mixture in a known manner and optionally converted to an acid addition salt.
It is expedient to proceed in such a way that a crude alkaloid sulphate mixture, the production of which is described in Hungarian patent specification No. 160 967, is dissolved in a mixture of formic acid and acetic anhydride and the reaction mixture is left to stand for a few, suitably 1-10 minutes at room temperature. During this period of time, the N-desmethylvinblastine present in the alkaloid sulfate mixture is formylated to vincristine. The reaction mixture is then poured into about 5 times the volume of water with cooling, whereby it must be ensured that the temperature of the aqueous solution does not rise above 10 "C, but is advantageously 0-5" C.
The acidic solution is then adjusted to pH 8.5-9.0 with aqueous ammonia, also with cooling, and then extracted several times with an organic solvent, advantageously with methylene chloride, until there are no alkaloids. The two phases are separated from one another, the organic phases are combined, dried and evaporated to dryness under reduced pressure. The sand-colored residue already contains the N-desmethylvinblastine, which was contained in the initial mixture of alkaloid sulfates, in the form of vincristine. This sand-colored residue is dissolved in a solvent, suitably in ethanol, and 1% ethanolic sulfuric acid is added. The solution is left to stand for some time, the mixture of the formylated alkaloid sulfates crystallizing out. These are filtered off, washed and dried.
The sulfate mixture of the dimeric alkaloids obtained in the manner described can be separated, for example, in the following manner: The substance is dissolved in a 2: 1 mixture of methylene chloride and chloroform and chromatographed on a column filled with partially deactivated aluminum oxide. During the chromatographic separation, the sulfate is bound, the fractions of the eluate contain the separated dimeric alkaloids in the form of the free bases. The elution is carried out with the same solvent mixture as indicated above. The first fraction contains accompanying alkaloids, the following ones contain vinblastine and any existing vinleurosine. This is followed by the fraction containing the vincristine.
The dimeric alkaloids contained in dissolved form in the individual fractions are identified using paper or thin-layer chromatography. Fractions which contain identical dimeric alkaloids are combined and evaporated under gentle conditions, advantageously under reduced pressure. The amorphous dimeric alkaloid bases separated from one another are dissolved in a solvent, suitably in ethanol, and reacted with 1% strength ethanolic sulfuric acid to form their sulfates. The vincristine sulphate obtained thus not only contains the vincristine occurring in Vinca rosea L., but also the vincristine obtained by formylating the natural N-desmethylvinblastine occurring in the plant.
A further embodiment of the process according to the invention consists in that the mixture of dimeric alkaloid bases obtained after the formylation is separated immediately, that is to say without conversion to the sulfate. In this case, the mixture of the dimeric alkaloid bases is dissolved in benzene and chromatographed on a column containing alumina soaked with benzene. First it is eluted with benzene, which dissolves most of the accompanying monomeric alkaloids. The elution is then continued with benzene and chloroform in a ratio of 2: 1 and finally a 1: 1 mixture of benzene and chloroform is used. The fractions are worked up in the manner described above.
The natural N-desmethylvinblastine occurring in Vinca rosea L. can be obtained, for example, in the following way: The raw alkaloid sulphate mixture, the production of which is described in Hungarian patent specification No. 160 967, is dissolved in about 40 times the amount of water that is aqueous The solution is adjusted to a pH of 8.5-9.0 with ammonia and extracted several times with an organic solvent, advantageously with methylene chloride, until there is no alkaloid. The phases are separated from one another, the organic phases are combined, dried and evaporated to dryness under reduced pressure.
In this way a mixture of amorphous dimeric alkaloid bases is obtained which is dissolved in an impolar solvent, suitably in benzene, and the solution is chromatographed on a column containing aluminum oxide moistened with benzene. It is eluted with a 3: 1 mixture of benzene and chloroform. There will be each
Fractions of 100 ml were collected and the alkaloids contained in dissolved form in the individual fractions were identified using thin-layer or paper chromatography.
The first fraction contains part of the accompanying alkaloids and vinblastine, the following fraction contains N-desmethyl vinblastine, the following fraction contains vincristine. The fractions containing the N-desmethylvinblastine are combined and gently evaporated to dryness, conveniently under reduced pressure. The N-desmethylvin blastine is dissolved in a polar solvent, conveniently in ethanol, and reacted with 10% ethanolic sulfuric acid to form N-desmethylvinblastine sulfate. The solution is left to stand, the product crystallizing out.
Compared to the previously known method, the method according to the invention has the advantage that the natural N-desmethylvinblastine occurring in Vinca rosea L., which was recognized for the first time through our own experiments and isolated from the plant material, can be converted directly to vincristine.
The progressive character of the inventive
Method compared with those in American Patent No. 3,205,220 and in Hungarian Patent
No. 160967 described methods, proceeds from the following
Table. (The data contained in the table denote amounts of vincristine that are more identical from plants
Quality can be gained
Vincristine sulfate mg / kg plant material
US Patent No. 3,205,220 4 Hungarian Patent No. 160 967 6.5 Process of the invention 10.8
example 1
3.85 g of crude alkaloid sulfate mixture, which was obtained according to the case of game 1 of Hungarian patent specification No. 160 967, are dissolved in a mixture of 35 ml of 98% formic acid and 5.75 ml of acetic anhydride and stand at room temperature for 5 minutes calmly.
Then the
The solution is poured into 150 ml of water at a temperature of 0-5 "C and, while cooling, is set to a pH of 8.5-9.0 with concentrated aqueous ammonia, which is also cooled, and with 300 ml of methylene chloride in several steps up to a negative alkaloid reaction The combined and dehydrated methylene chloride phase is evaporated to dryness under reduced pressure, giving 3.1 g of a sand-colored, amorphous mixture of dimeric alkali bases in which the originally present
N-desmethylvinblastine is already present as vin cristine due to the formylation. The mixture is dissolved in ethanol and the addition of 1% ethanolic sulfuric acid
Separated sulfate mixture of dimeric alkaloids. It will
2.46 g of crystalline sulfate mixture of the dimeric alkaloids he hold.
The crystalline sulfate mixture of the dimeric alkaloids is dissolved in 20 ml of methylene chloride-chloroform mixture in a ratio of 2: 1 and the solution is chromatographed on a column containing 250 g of aluminum oxide partially deactivated with water, whereby first the sulfate groups are bound, second the free alkaloid bases are separated will.
It is eluted with a mixed solvent of the above composition. The dimeric alkaloids are released from the column in the form of the free bases. Fractions of 50 ml each are collected. Fractions 1-3 contain the accompanying alkaloids, fractions 4-9 the vinblastine and any vinleurosine present. The vincristine appears in the 9th fraction, its elution is with the le.
Fraction ended. The fractions containing the vinblastine, vinleurosine and vincristine identified by paper or thin-layer chromatography are separately evaporated to dryness. The amorphous dimeric alkaloid bases obtained are converted to the sulfate in the manner described above. From fractions 4-9, 2.0 g of vinblastine sulfate are obtained, from fractions 9-18 0.25 g of crude vincristine sulfate, which is recrystallized from a 1: 4 mixture of methanol and ethanol.
[3D20 = +11.120 (c = 1; water) RE = 0.30 (appears with a vivid blue color)
The compound is identified using infrared spectroscopy. At 5.94! St, an extremely strong absorption band appears compared with the IR spectrum of vinblastine.
The thin-layer chromatographic investigations are carried out with the adsorbent aluminum oxide G. Merck. Chloroform, which contains 0.5% methanol, is used as the eluent. It is developed with concentrated phosphoric acid containing 1% ceric ammonium sulfate.
Example 2
Vinblastine and vincristine are separated off by means of chromatography from 3.1 g of the sand-colored mixture of amorphous dimeric alkaloid bases obtained according to Example 1.
The alkaloid base mixture is dissolved in 15 ml of benzene and the solution is chromatographed on a column which contains 150 g of aluminum oxide of activity III soaked with benzene.
It is eluted first with 400 ml of benzene, collecting 50 ml fractions. Most of the accompanying alkaloids are released by the benzene. The elution is then continued with 450 ml of a benzene-chloroform mixture in a ratio of 2: 1, the remaining monomeric alkaloids and the only small amount of vinleurosine being dissolved out. The vinblastine is obtained by eluting with a further 450 ml of a 2: 1 benzene-chloroform mixture. Finally, it is eluted with 1500 ml of a benzene-chloroform mixture in a ratio of 1: 1, the vincristine still bound to the adsorbent being dissolved out. The eluates separated on the basis of paper or thin-layer chromatographic investigations are evaporated to dryness. 2.6 g of amorphous vinblastine base are obtained, from which the sulfate is prepared in the manner described in Example 1.
2.2 g of crystalline vinblastine sulfate are obtained.
When the eluate containing vincristine is evaporated, 0.32 g of amorphous vincristine base is obtained, from which the sulfate is produced according to Example 1.
Yield: 0.27 g of crude vincristine sulfate
Yield after recrystallization from methanol and ethanol in a ratio of 1: 4. 0.21 g of vincristine sulfate are obtained. The physical constants of the product are identical to those given in Example 1.
Example 3
Obtaining N-desmethylvinblastine
6 g of the crude sulphate mixture of dimeric alkaloids, which was prepared according to Hungarian patent specification No. 160 967, are dissolved in 100 ml of water, the aqueous solution is made alkaline with dilute ammonia and extracted with 3 x 100 ml of methylene chloride until the alkaloid is absent. The two phases are separated from one another, the organic phases are combined and evaporated to dryness under reduced pressure. In this way 4.5 g of amorphous dimeric alkaloid base are obtained, which is dissolved in 15 ml of benzene. The solution is chromatographed using benzene-soaked aluminum oxide of activity III as adsorbent. The dimeric alkaloids are eluted in the following way: the vinblastine is dissolved out with 3600 ml of a 3: 1 benzene-chloroform mixture.
Fractions of 100 ml each are collected and the dimeric alkaloids in the individual fractions are identified using thin-layer or paper chromatography.
Fractions 1-9 contain some of the accompanying alkaloids and the vinblastine. Fractions 10-24 contain the N-desmethylvinblastine. The fractions are evaporated to dryness, a dry residue of 0.35 g of crude N-desmethylvinblastine being obtained.
The N-desmethylvinblastine is dissolved in anhydrous methanol and the N-desmethylvinblastine sulphate is separated off with 1% ethereal sulfuric acid. This is filtered off, washed and dried. 0.26 g of crude N-desmethylvinblastine sulfate are obtained, which is recrystallized from a mixture of methanol and ethanol in a ratio of 1: 4.
Yield: 0.24 g of N-desmethylvinblastine sulfate.
The N-desmethylvinblastine base is released from the salt obtained. The isolated N-desmethylvinblastine base was identified by the following information.
[JD'0 = + 15.80 (c = 1, chloroform)
Melting point: 210-2150C (Boetius)
UV absorption spectrum of N-desmethylvinblastine sulfate:
E.
211 46.504
258 11,300
286 10.740
294 9.965
310 4.995
Characteristic wavelengths of the IR spectrum of N-desmethylvinblastine: 3560, 3440, 3000, 2956, 2940, 2930, 2870, 2830, 2785, 1740, 1620, 1597, 1495, 1487, 1455, 1430, 1416, 1390, 1368, 1328 , 1294, 1252, 1235, 1195, 1164, 1140, 1126, 1112, 1075, 1060, 1035, 1006, 998, 975, 954, 915.
When chromatography on aluminum oxide, layer D, using chloroform and methanol in a ratio of 99.5: 0.5 as a mobile phase and when developing by spraying with concentrated phosphoric acid containing 1% ceric ammonium sulfate, the N-desmethylvinblastine is by one with Rf = 0.60 appearing, initially orange-colored, later turning purple.