Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Vincristin mit verbesserter Ausbeute aus Pflanzenteilen von Vinca rosea L.
Das Vincristin ist ein ausserordentlich wichtiges Cytostatikum, welches auch bei akuter Leukämie im Kindesalter lebensrettend ist (Haggard, M.E.: Cancer Chemother. Reports, 52, 477/1968), ferner bewirkt seine Anwendung bei Erkrankungen mit harten Geschwulsten im Kindesalter in 60-65% der Fälle eine wesentliche Regression (Selavry, D., Holland, J.F., Wolmsn, I.J.: Cancer Chemother. Reports, 52 497/1968).
Es ist bekannt, dass das Vincristin ein dimeres Alkaloid von Vinca rosea L. ist, dessen Menge einige Zehntel Prozent der in der Pflanze enthaltenen Alkaloidgesamtmenge ausmacht, weswegen die aus der Pflanze herstellbare Vincristinmenge dem auftretenden Bedarf bei weitem nicht gerecht werden kann.
Nicht bekannt war bisher jedoch, dass das N-Desmethylvinblastin als dimeres Alkaloid ebenfalls in Vinca rosea L.
enthalten ist.
Die Herstellung des N-Desmethylvinylblastins wird im Beispiel 1 der US Patentschrift Nr. 3 354 163 beschrieben.
Nach dem Verfahren wird reines Vincristinsulfat in 0.1%iger wässeriger Schwefelsäure gelöst und die Lösung, deren pH-Wert 2,03 beträgt, 18 Stunden lang gesiedet. Die erhaltene klare Lösung wird mit konzentriertem Ammoniak alkalisch gemacht, mit Methylenchlorid extrahiert, das Extrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Methylenchlorid angefeuchtet und in Äther gelöst. Der unlösliche Anteil wird durch Zentrifugieren entfernt und die darüber stehende klare Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der trockene Rückstand beträgt 73% der als Ausgangsstoff eingesetzten Vincristinmenge. Der Trockenrückstand wird in Benzol gelöst, auf einer mit Aluminiumoxyd gefüllten Säule chromatographiert und mit einer Mischung von Benzol und Chloroform eluiert. Bei der chromatographischen Trennung werden zwei Komponenten gewonnen.
Die in grösserer Menge anfallende Komponente ist N-Desmethylvinblastin, die in geringerer Menge erhaltene Komponente das als Nebenprodukt anfallende Desacetyl-N-desmethylvinblastin. In dem Beispiel wird das Mengenverhältnis der beiden Komponenten nicht angegeben, es wird nur erwähnt, dass bei einem pH-Wert von unter 2 die Menge des Desacetylproduktes ansteigt, bei einem pH-Wert von über 2,5 die Umsetzung des Vincristins nicht vollständig ist. Im Beispiel 3 der erwähnten Patentschrift wird die Formylierung des N-Desmethylvinblastins mit Ameisensäure in Gegenwart von Essigsäureanhydrid erläutert. Auf diese Weise kann das durch die Dementylierung des Vincristins erhaltene N-Desmethylvinblastin mit ungefähr 50%-iger Ausbeute erneut zu Vincristin umgesetzt werden.
Im beschreibenden Teil der Patentschrift wird ferner erwähnt, dass das N-Desmethylvinblastin auch aus Vinblastin hergestellt werden kann, und zwar durch Demethylierung. die mit einem schwach oxydierenden System, zum Beispiel mittels biologischer Oxydation durch Wasserstoffperoxyd und Peroxydase-Enzym, durch- geführt wird. Bezüglich der Herstellung des N-Desmethylvinblastins aus Vinblastin wird jedoch über diese Feststellung hinaus keinerlei Unterweisung gegeben.
Der Nachteil des in der erwähnten Patentschrift erläuterten Verfahrens besteht darin, dass das wertvollste Alkaloid von Vinca rosea L., das Vincristin, nach seiner Reinherstellung mittels dieses komplizierten und deswegen ausserordentlich teuren Verfahrens zum N-Desmethylvinblastin abgebaut und aus diesem nur mit ungefähr 50%-iger Ausbeute zurückgewonnen werden kann.
Zur Herstellung von Vincristin ist weiterhin die US Patentschrift Nr. 3 205220 bekannt, nach der die getrocknete Vinca rosea L. nach einer sauren Vorbehandlung mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und nach einem Reinigungsvorgang, der in mehrfachem Umlösen mittels Wasser und organischem Lösungsmittel besteht, die Lösung zur Trockne eingedampft wird. Die auf diese Weise gewonnene, schwach basische Alkaloidfraktion von komplizierter Zusammensetzung, welche die dimeren Alkaloide alles in allem zu 1-2%, das gewünschte Vincristin nur zu einigen hundertstel Prozent enthält, wird durch Chromatographie aufgetrennt und das reine Vincristin auf diese Weise gewonnen.
Der Nachteil des Verfahrens besteht darin, dass zur Reinherstellung der wenigen hundertstel Prozent Vincristin die bei der Extraktion von Vinca rosea L. gewonnene, schwach basische Alkaloidfraktion von komplizierter Zusammensetzung zuerst chromatographiert und dann in Abhängigkeit vom pH-Gradienten extrahiert werden muss.
Es ist das Ziel der Erfindung, die Menge des aus Vinca rosea L. gewinnbaren Vincristins zu steigern und mittels Formylierung des durch eigene Versuche zum ersten Male isolierten natürlichen N-Desmethylvinblastins weiteres pharmazeutisch wertvolles Vincristin herzustellen.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass nach der ungarischen Patentschrift Nr. 160 967 die dimeren Alkaloide von Vinca rosea L. aus dem entsprechend gereinigten Extrakt durch Säure, zum Beispiel durch äthanolische Schwefelsäure, in Gestalt eines ungefähr 70% dimeres Alkaloid enthaltenden Säureadditionssalzes abgetrennt beziehungsweise im Extrakt angereichert werden können, und dass diese Mischung dimerer Alkaloide neben den Säureadditionssalzen von Vinblastin, Vinleurosin, Vincristin und anderer dimerer Alkaloide auch das in Vinca rosea L. bisher nicht bekannte, aus dem Pflanzenmaterial durch eigene Versuche zum ersten Male isolierte N-Desmethylvinblastin enthält.
Wenn also die ungefähr 70% dimere Alkaloide enthaltende Mischung von Säureadditionssalzen oder gegebenenfalls das aus dem Gemisch der Säureadditionssalze freigesetzte Gemisch dimerer Alkaloidbasen formyliert wird, so wird auch das in Vinca rosea L. vorkommende natürliche N-Desmethylvinblastin in Form von Vincristin gewonnen. Die Formylierung wird in an sich bekannter Weise, zum Beispiel mit Ameisensäure in Essigsäureanhydrid vorgenommen.
Die Erfindung ist also ein Verfahren zur Gewinnung von Vincristin mit verbesserter Ausbeute aus dem Extrakt von Vinca rosea L. und kann dadurch gekennzeichnet, werden, dass die aus Pflanzenteilen von Vinca rosea L. gewonnene und angereicherte, auch das natürliche N-Desmethylvinblastin enthaltende Mischung dimerer Alkaloide beziehungsweise die daraus gewonnene Mischung von Säureadditionssalzen formyliert, aus dem formylierten Gemisch das Vincristin in bekannter Weise gewonnen und gegebenenfalls zu einem Säureadditionssalz umgesetzt wird.
Zweckmässig wird dabei so vorgegangen, dass ein rohes Alkaloidsulfatgemisch, dessen Gewinnung in der ungarischen Patentschrift Nr. 160 967 beschrieben ist, in einem Gemisch aus Ameisensäure und Essigsäureanhydrid gelöst und das Reaktionsgemisch einige, zweckmässig 1-10 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen wird. Während dieser Zeitspanne geht die Formylierung des in der Alkaloidsulfatmischung vorliegenden N-Desmethylvinblastins zu Vincristin vor sich. Danach wird das Reaktionsgemisch unter Kühlung in das ungefähr 5-fache Volumen Wasser gegossen, wobei darauf zu achten ist, dass sich die Temperatur der wässerigen Lösung nicht über 10"C erhöht, sondern vorteilhaft 0-5"C beträgt.
Darauf folgend wird die saure Lösung, ebenfalls unter Kühlung, mit wässerigem Ammoniak auf pH 8,5-9,0 eingestellt, anschliessend mehrfach mit einem organischen Lösungsmittel, vorteilhaft mit Methylenchlorid, bis zur Abwesenheit von Alkaloiden extrahiert. Die beiden Pha sen werden voneinander getrennt, die organischen Phasen vereinigt, getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der sandfarbene Rückstand enthält das N-Desmethylvinblastin, das in der Ausgangsmischung der Alkaloidsulfate enthalten war, bereits in Form von Vincristin. Dieser sandfarbene Rückstand wird in einem Lösungsmittel, zweckmässig in Äthanol gelöst und mit 1 %-iger äthanolischer Schwefelsäure versetzt. Die Lösung wird einige Zeit stehen gelassen, wobei das Gemisch der formylierten Alkaloidsulfate auskristallisiert. Diese werden abfiltriert, gewaschen und getrocknet.
Die Auftrennung des in der beschriebenen Weise erhaltenen Sulfatgemisches der dimeren Alkaloide kann zum Beispiel in folgender Weise erfolgen: Die Substanz wird in einem 2:1 Gemisch von Methylenchlorid und Chloroform gelöst und auf einer mit teilweise desaktiviertem Aluminiumoxyd gefüllten Säule chromatographiert. Bei der chromatographischen Trennung wird das Sulfat gebunden, die Fraktionen des Eluates enthalten die getrennten dimeren Alkaloide in Form der freien Basen. Die Eluierung wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch durchgeführt wie weiter oben angegeben. Die erste Fraktion enthält Begleitalkaloide, die folgenden enthalten das Vinblastin und das eventuell vorhandene Vinleurosin. Darauf folgt die das Vincristin enthaltende Fraktion.
Die in den einzelnen Fraktionen gelöst enthaltenen dimeren Alkaloide werden mittels Papier- beziehungsweise Dünnschichtchromatographie identifiziert. Fraktionen, die identische dimere Alkaloide enthalten, werden vereinigt und unter schonenden Bedingungen, zweckmässig unter vermindertem Druck, eingedampft. Die voneinander abgetrennten, amorphen dimeren Alkaloidbasen werden in einem Lösungsmittel, zweckmässig in Äthanol, gelöst und mit I %-iger äthanolischer Schwefelsäure zu ihren Sulfaten umgesetzt. Das erhaltene Vincristinsulfat enthält dadurch nicht nur das in Vinca rosea L. vorkommende Vincristin, sondern ausserdem noch zusätzlich das durch Formylierung des in der Pflanze vorkommenden natürlichen N-Desmethylvinblastins gewonnene Vincristin.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass das nach der Formylierung erhaltene Gemisch dimerer Alkaloidbasen unmittelbar, also ohne Umsetzen zum Sulfat, aufgetrennt wird. In diesem Falle wird das Gemisch der dimeren Alkaloidbasen in Benzol gelöst und auf einer mit Benzol getränktes Aluminiumoxyd enthaltenden Säule chromatographiert. Zuerst wird mit Benzol eluiert, welches den grössten Teil der monomeren Begleitalkaloide herauslöst. Danach wird mit Benzol und Chloroform im Verhältnis 2:1 weiter eluiert und zum Schluss ein 1:1 Gemisch von Benzol und Chloroform angewendet. Die Aufarbeitung der Fraktionen erfolgt auf die weiter oben beschriebene Weise.
Das in Vinca rosea L. vorkommende natürliche N-Desmethylvinblastin kann zum Beispiel auf folgende Weise gewonnen werden: Das rohe Alkaloidsulfatgemisch, dessen Gewinnung in der ungarischen Patentschrift Nr. 160 967 beschrieben ist, wird in der ungefähr 40-fachen Menge Wasser gelöst, die wässerige Lösung mit Ammoniak auf einem pH Wert von 8,5-9,0 eingestellt und mit einem organischen Lösungsmittel, vorteilhaft mit Methylenchlorid, mehrmals bis zur Abwesenheit von Alkaloid extrahiert. Die Phasen werden voneinander getrennt, die organischen Phasen vereinigt, getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Auf diese Weise wird ein Gemisch amorpher dimerer Alkaloidbasen erhalten, welches in einem lmpolaren Lösungsmittel, zweckmässig in Benzol, gelöst und die Lösung auf einer mit Benzol angefeuchtetes Aluminiumoxyd enthaltenden Säule chromatographiert wird. Eluiert wird mit einem 3:1 Gemisch von Benzol und Chloroform. Es werden jeweils
Fraktionen von 100 ml aufgefangen und die in den einzel nen Fraktionen gelöst enthaltenen Alkaloide mit Dünn schicht- beziehungsweise Papierchromatographie identifiziert.
Die erste Fraktion enthält einen Teil der Begleitalkaloide und das Vinblastin, die folgenden enthalten das N-Desmethyl vinblastin, die darauf fogenden das Vincristin. Die Fraktio nen, die das N-Desmethylvinblastin enthalten, werden verei nigt und in schonender Weise, zweckmässig unter verminder tem Druck, zur Trockne eingedampft. Das N-Desmethylvin blastin wird in einem polaren Lösungsmittel, zweckmässig in Äthanol, gelöst und mit 10%-iger äthanolischer Schwefel säure zu N-Desmethylvinblastinsulfat umgesetzt. Die Lösung wird stehen gelassen, wobei das Produkt auskristallisiert.
Gegenüber den bisher bekannten Verfahren hat das erfindungsgemässe Verfahren den Vorteil, dass das in Vinca rosea L. vorkommende, natürliche N-Desmethylvinblastin, welches durch eigene Versuche zum ersten Mal erkannt und aus dem pflanzlichen Material isoliert wurde, unmittelbar zum Vincristin umgesetzt werden kann.
Der fortschrittliche Charakter des erfindungsgemässen
Verfahrens, verglichen mit den in der amerikanischen Pa tentschrift Nr. 3 205 220 und in der ungarischen Patentschrift
Nr. 160967 beschriebenen Methoden, geht aus der folgenden
Tabelle hervor. (Die in der Tabelle enthaltenen Angaben bezeichnen Vincristinrnengen, die aus Pflanzen identischer
Qualität gewonnen werden können
Vincristinsulfat mg/kg Pflanzen- material
US Patentschrift Nr. 3 205 220 4 ungarische Patentschrift Nr. 160 967 6,5 erfindungsgemässes Verfahren 10,8
Beispiel 1
3,85 g rohes Alkaloidsulfatgemisch, das nach dem Bei spiel 1 der ungarischen Patentschrift Nr. 160 967 gewonnen wurde, werden in einer Mischung aus 35 ml 98%-iger Amei sensäure und 5,75 ml Essigsäureanhydrid gelöst und bei Zim mertemperatur 5 Minuten stehen gelassen.
Danach wird die
Lösung in 150 ml Wasser von 0-5"C Temperatur gegossen und unter Kühlung mit ebenfalls gekühltem, konzentriertem wässerigen Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,5-9,0 einge stellt und mit 300 ml Methylenchlorid in mehreren Schritten bis zu negativer Alkaloidreaktion extrahiert. Die vereinigte und entwässerte Methylenchloridphase wird unter vermin dertem Druck zur Trockne eingedampft. Es werden 3,1 g eines sandfarbene, amorphen Gemisches von dimeren Alka loidbasen gewonnen, in dem das ursprünglich vorhandene
N-Desmethylvinblastin durch die Formylierung bereits als Vin cristin vorliegt. Das Gemisch wird in Äthanol gelöst und durch Zugabe von 1 %-iger äthanolischer Schwefelsäure das
Sulfatgemisch der dimeren Alkaloide abgetrennt. Es werden
2,46 g kristallines Sulfatgemisch der dimeren Alkaloide er halten.
Das kristalline Sulfatgemisch der dimeren Alkaloide wird in 20 ml Methylenchlorid-Chloroform-Gemisch im Verhält nis 2:1 gelöst und die Lösung auf einer 250 g mit Wasser teilweise desaktiviertes Aluminiumoxyd enthaltenden Säule chromatographiert, wodurch erstens die Sulfatgruppen ge bunden, zweitens die freien Alkaloidbasen getrennt werden.
Es wird mit einem Lösungsmittelgemisch der obigen Zusam mensetzung eluiert. Die dimeren Alkaloide werden in Form der freien Basen aus der Säule herausgelöst. Es werden Frak tionen von je 50 ml aufgefangen. Die Fraktionen 1-3 enthalten die Begleitalkaloide, die Fraktionen 4-9 das Vinblastin und das eventuell vorhandene Vinleurosin. Das Vincristin erscheint in der 9. Fraktion, seine Elution ist mit der le.
Fraktion beendet. Die das durch Papier- beziehungsweise Dünnschichtchromatographie identifizierte Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin enthaltenden Fraktionen werden getrennt bis zur Trockne eingedampft. Die erhaltenen amorphen dimeren Alkaloidbasen werden in der oben beschriebenen Weise zum Sulfat umgesetzt. Aus den Fraktionen 4-9 werden 2,0 g Vinblastinsulfat, aus den Fraktionen 9-18 0,25 g rohes Vincristinsulfat erhalten, welches aus einem 1:4 Gemisch von Methanol und Äthanol umkristallisiert wird.
[3D20 = +11.120 (c = 1; Wasser) RE = 0,30 (erscheint mit lebhaft blauer Farbe)
Die Verbindung wird mit Infrarotspektroskopie identifiziert. Bei 5,94 !St erscheint, verglichen mit dem IR-Spektrum des Vinblastins, eine ausgesprochen starke Absorptionsbande.
Die dünnschichtchromatographischen Untersuchungen werden mit dem Adsorbens Aluminiumoxyd G. Merck durchgeführt. Als Fliessmittel dient Chloroform, welches 0,5% Methanol enthält, entwickelt wird mit konzentrierter Phosphorsäure, die 1% Cerammoniumsulfat enthält.
Beispiel 2
Aus 3,1 g des nach Beispiel 1 gewonnenen sandfarbenen Gemisches amorpher dimerer Alkaloidbasen werden Vinblastin und Vincristin mittels Chromatographie abgetrennt.
Das Alkaloidbasengemisch wird in 15 ml Benzol gelöst und die Lösung auf einer Säule chromatographiert, die 150 g mit Benzol getränktes Aluminiumoxyd der Aktivität III enthält.
Zuerst wird mit 400 ml Benzol eluiert, wobei 50 ml-Fraktionen aufgefangen werden. Der grösste Teil der Begleitalkaloide wird durch das Benzol herausgelöst. Danach wird mit 450 ml eines Benzol-Chloroform-Gemisches im Verhältnis 2:1 weiter eluiert, wobei die noch verbliebenen monomeren Alkaloide und das nur in geringer Menge vorhandenen Vinleurosin herausgelöst werden. Durch Eluieren mit weiteren 450 ml 2:1 Benzol-Chloroform-Gemisch wird das Vinblastin erhalten. Zuletzt wird mit 1500 ml Benzol-Chloroform-Gemisch im Verhältnis 1:1 eluiert, wobei das noch am Adsorbens gebundene Vincristin herausgelöst wird. Die aufgrund von papier- beziehungsweise dünnschichtchromatographischen Untersuchungen getrennten Eluate werden zur Trockne eingedampft. Es werden 2,6 g amorphe Vinblastinbase erhalten, aus der auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise das Sulfat hergestellt wird.
Es werden 2,2 g kristallines Vinblastinsulfat erhalten.
Bei Eindampfen des Vincristin enthaltenden Eluates werden 0,32 g amorphe Vincristinbase erhalten, aus der nach Beispiel 1 das Sulfat hergestellt wird.
Ausbeute: 0,27 g rohes Vincristinsulfat
Ausbeute nach dem Umkristallisieren aus Methanol und Äthanol im Verhältnis 1:4. Es werden 0,21 g Vincristinsulfat erhalten. Die physikalischen Konstanten des Produktes sind mit den im Beispiel 1 angegebenen identisch.
Beispiel 3
Gewinnung von N-Desmethylvinblastin
6 g des rohen Sulfatgemisches dimerer Alkaloide, das nach der ungarischen Patentschrift Nr. 160 967 hergestellt wurde, werden in 100 ml Wasser gelöst, die wässerige Lösung mit verdünntem Ammoniak alkalisch gemacht und mit 3 x 100 ml Methylenchlorid bis zur Abwesenheit von Alkaloid extrahiert. Die beiden Phasen werden voneinander getrennt, die organischen Phasen vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Auf diese Weise werden 4,5 g amorphe dimere Alkaloidbase erhalten, die in 15 ml Benzol gelöst wird. Die Lösung wird chromatographiert, wobei als Adsorbens mit Benzol getränktes Aluminiumoxyd der Aktivität III verwendet wird. Die dimeren Alkaloide werden in folgender Weise eluiert: das Vinblastin wird mit 3600 ml einer 3:1 Benzol-Chloroform-Mischung herausgelöst.
Es werden Fraktionen von je 100 ml aufgefangen und die dimeren Alkaloide in den einzelnen Fraktionen mit Dünnschicht- beziehungsweise Papierchromatographie identifziert.
Die Fraktionen 1-9 enthalten einen Teil der Begleitalkaloide und das Vinblastin. Die Fraktionen 10-24 enthalten das N-Desmethylvinblastin. Die Fraktionen werden zur Trockne eingedampft, wobei ein trockener Rückstand von 0,35 g rohem N-Desmethylvinblastin erhalten wird.
Das N-Desmethylvinblastin wird in wasserfreiem Methanol gelöst und mit 1 %-iger ätherischer Schwefelsäure das N-Desmethylvinblastinsulfat abgetrennt. Dieses wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Es werden 0,26 g rohes N-Desmethylvinblastinsulfat erhalten, welches aus einem Gemisch von Methanol und Äthanol im Verhältnis 1:4 umkristallisiert wird.
Ausbeute: 0,24 g N-Desmethylvinblastinsulfat.
Aus dem erhaltenen Salz wird die N-Desmethylvinblastinbase freigesetzt. Die isolierte N-Desmethylvinblastinbase wurde durch folgende Angaben identifiziert.
[ JD'0 = + 15,80 (c = 1, Chloroform)
Schmelzpunkt: 210-2150C (Boetius)
UV-Absorptionsspektrum des N-Desmethylvinblastinsulfats:
E
211 46,504
258 11,300
286 10,740
294 9,965
310 4,995
Charakteristische Wellenlängen des IR-Spektrums von N-Desmethylvinblastin: 3560, 3440, 3000, 2956, 2940, 2930, 2870, 2830, 2785, 1740, 1620,1597, 1495, 1487, 1455, 1430, 1416, 1390, 1368, 1328, 1294, 1252,1235, 1195, 1164, 1140, 1126, 1112, 1075, 1060, 1035, 1006, 998, 975, 954, 915.
Bei der Chromatographie auf Aluminiumoxyd, Schicht D, unter Verwendung von Chloroform und Methanol im Verhältnis von 99,5:0,5 als Fliessmittel und bei Entwicklung durch Einsprühen mit konzentrierter Phosphorsäure, die 1 % Cerammoniumsulfat enthält, ist das N-Desmethylvinblastin durch einen bei Rf = 0,60 erscheinenden, erst orangefarbenen, später in lila übergehenden Fleck charakterisiert.