DE2519533A1 - Vincadiolin und verfahren zu seiner gewinnung - Google Patents

Description

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Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana/ V.St.A. Vincadiolin und Verfahren zu seiner Gewinnung

Einige natürlich vorkommende Alkaloide, die aus Vinca rosea (Wintergrün) gewonnen werden können, haben sich als wirksame Mittel für die Behandlung von experimentellen Tumoren bei Tieren erwiesen. Hierzu gehören Leurosin (US-PS 3 370 057) , Vincaleukoblastin (Vinblastin) - im folgenden als VLB be- . zeichnet - (US-PS 3 097 137), Leurosidin (Vinrosidin) und Leukocristin (VCR oder Vincristin) (beide in US-PS 3 205 220) . Zwei dieser Alkaloide, VLB und Vincristin, sind im Handel erhältliche Mittel für die Behandlung von malignen Erkrankungen, insbesondere von Leukämien und verwandten Krankheiten bei Menschen. Von diesen im Handel befindlichen Verbindungen ist Vincristin das am stärksten wirksame und wertvollste Mittel für die Behandlung von Leukämien, aber es ist auch dasjenige der cytostatisch wirkenden Alkaloide von Vinca rosea, das am wenigsten reichlich vorkommt.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Indol-Dihydroindol-Alkaloid, Vincadiolin, mit den im folgenden angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften. Vincadiolin ist eine hellbräunliche feste Substanz, die bei etwa 218 bis 22O,5 ⁰C (Zersetzung) schmilzt (nach Umkristallisieren aus Äther). Es hat die folgenden Pulverröntgenstrahlbeugungswerte bei Verwendung filtrierter Chromstrahlung; λ= 2,2896 A*.

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d in X -¹·'·¹-! d in

11,40	1O	4,17	1O
9,55	100 -1	3,99	60
8,87	90 -2	3,71	20
8,63	90 -2	3,64	15
7,78	05	3,44	1O B
7,57	60	3,19	20
7,21	5O	3,O5	5
6,00	40	2,85	20
5,88	40	2,78	10
5,58	70 -3	2,61	10
5,22	20	2,44	5 B
5,08	20	2,21	5 B
4,7O	50	2,O7	5
4,57	40	1,98	15
4,42	5	1,91	5
4,31	5

Das Infrarotspektrum von Vincadiolin zeigt Apsorptionsmaxima bei 348O cm (Indolwasserstoff) und bei"1745 und 1725 cm
(Estercarbonylgruppen). Das magnetische Kernresonanzspektrum (NMR-Spektrum) zeigt die folgenden charakteristischen Werte:

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<f H-Zuordnung

7,13 C-11¹, 12¹,

7,53 C-14¹

8,04 N bei 16'

3.60 Methylgruppe des Methylesters bei C-17*

6.61 C-14 6,O9 C-18

3,79 Methyl der C-16-Methoxylgruppe

2,7O N-Methyl

3,79 Methyl des C-3-Methylesters

9,77 OH am C-3

5,47 C-4

2,O9 Acetat an C-4

0,80 CH₃-CH₂ an C-5

5,85 C-6

5,29 C-7

2,63 C-19

3,84 C-3¹

0,91 CH₃-CH₂ an C-4¹

Die vorstehenden Zuordnungen beruhen auf folgender vorgeschlagener Struktur für Vincadiolin:

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CH₃

1 2

1 3

CHaO

Das Molekulargewicht von Vincadiolin beträgt 826 (m/e = 826, durch Massenspektroskopie) und stimmt mit folgender Bruttoformel überein:

^C46^H58^N4°1O·

Andere im Massenspektrograf vorhandene Massenionen sind zum Beispiel m/e =170 und 371. Die stereochemische Angabe an C-4' beruht darauf/ daß es nicht möglich war, ein Acetat herzustellen, was anzeigt, daß die Hydroxylgruppe ß-ständig ist (wie in VLB und Leukocristin). Die alphaständige Hydroxylgruppe am C-4¹ von Leurosidin bildet unter identischen Reaktion sbedingungen ohne weiteres ein Acetat. Die Hydroxylgruppe am C-3¹ bildet unter diesen Bedingungen jedoch ein Acetat, das sich durch Massenspektroskopie leicht nachweisen läßt. Ein magnetisches Kernresonanzspektruin dieses acylierten Produkts zeigt eine neue Bande bei cf~i,85, die der Acetatgruppe zuzuordnen ist, und eine Verschiebung für das C-3¹-Proton von cT3,84 nach cT4,48.

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Vincadiolin bildet mit nichttoxischen Mineralsäuren wie Schwefelsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure und Phosphorsäure pharmazeutisch annehmbare Salze. Durch Behandeln einer Lösung von Vincadiolin in wasserfreiem Äthanol mit 1-prozentiger äthanolischer Schwefelsäure erhält man Vincadiolinsulfat als amorphes Pulver.

Vincadiolin wird durch folgende Arbeitsweise gewonnen:

Blätter von Pflanzen, die rohe Vincaalkaloide enthalten, also von Catharanthus roseus (Vinca rosea), werden mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wie Benzol extrahiert. Das Benzol wird in Gegenwart von wässriger Weinsäure von dem Extrakt abdestilliert. Der erhaltene wässrig saure Extrakt wird durch Zugabe von Base auf einen pH-Wert von ¹^ 6 eingestellt. Stattdessen kann man die Blätter auch bei pH ~3 mit wässriger Säure in Berührung bringen und die erhaltene saure Schicht mit Benzol extrahieren. Die Benzolschicht wird abgetrennt und verworfen, und die wässrige Schicht wird wie oben auf pH <a 6 eingestellt. Die dimeren Alkaloide werden dann mit einem organischen Lösungsmittel, gewöhnlich Benzol, aus der wässrigen Schicht extrahiert. Gegebenenfalls können die extrahierten Alkaloide einer Gelexklusionsfiltrationsstufe unterworfen werden, wofür ein vernetztes Dextrangel (Sephadex G-25 F) und eine bewegliche Phase vom pH ~i3,O, O,1 m Ammoniunicitrat-Puffer verwendet wird. Während der Gelexklusions-

Chromatographie wird ein Druck von etwa 1 kg/cm angewandt. Bei dieser Arbeitsweise wird die Fraktion der dimeren Alkaloide, die Vincristin, Vinblastin, Des-N-methylvinblastin, Leuroformin, Leurosin und Vinrosidin enthält, zuerst eluiert. Die Extraktion der dimeren Alkaloide aus dem pH ~3-Puffer erfolgt durch Einstellen des pH-Werts mit einer Base und anschließendes Versetzen der erhaltenen wässrigen Lösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise wiederum Benzol. Durch Verdampfen des Benzols

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erhält man einen Rückstand, der in Äthanol gelöst werden kann, aus dem Leurosin direkt auskristallisiert. Die Leurosinkristalle werden durch Dekantieren abgetrennt, und die überstehende Flüssigkeit wird mit 3-prozentiger äthanolischer Schwefelsäure auf pH ~4,2 angesäuert, wodurch die noch vorhandenen dimeren Alkaloide in ihre Sulfatsalze übergeführt werden, die ausfallen. Die ausgefallenen Salze werden abgetrennt und in an sich bekannter Weise in die entsprechenden freien Alkaloidbasen übergeführt, beispielsweise durch Auflösen der Salze in Wasser, Einstellen des pH-Werts mit Ammoniumhydroxid auf 8,0 und Extrahieren der dimeren Alkaloide mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Methylenchlorid. Durch Abdampfen des Methylenchlorids erhält man die gemischten dimeren Alkaloide, die dann bei hohem Druck an Aluminiumoxid (Aktivität III) unter Verwendung von Äthylacetat-Methylenchlorid-Wasser (25 : 75 : 0,4) als Elutionsmittel chromatographiert werden.

Die angewandten Betriebsdrucke liegen im Bereich von 10 bis

2
25 kg/cm (150 - 350 psi) . Dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Hochdruckchromatographie sind die Geräte bekannt,

, 2

mit denen unter Drucken von 280 bis 350 kg/cm und möglicher-

2 weise sogar unter Drucken von 520 bis 56O kg/cm (7500 bis 8000 psi) gearbeitet werden kann. Alkaloidtrennungen verlaufen im allgemeinen bei den höheren Drucken mit besserer Wirksamkeit. Hochdruckchromatographieverfahren werden in Geräten aus korrosionsbeständigem Stahl durchgeführt, die mit druckbeständigen Verschlüssen ausgerüstet sind.

Bei dieser chromatographischen Arbeitsweise werden die Alkaloide in folgender Reihenfolge eluiert: restliches Leurosin, Vinblastin, Des-N-methylvinblastin, Vincristin und Vinrosidin. Die Identifizierung der dimeren Alkaloide in den Eluiermittelfraktionen erfolgt in allgemein bekannter Weise, beispielsweise durch Dünnschichtchromatographie.

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Nach Elution der bekannten Alkaloide verbleiben auf der Säule einige stärker polare dimere Alkaloide. Sie werden mit Methanol eltiiert und erneut chromatographiert, bis Vincadiolin als gesonderte Fraktion erhalten wird, die von anderen dimeren Alkaloiden der polaren Alkaloidfraktion praktisch frei ist.

Die Erfindung wird durch das folgende Ausführungsbeispiel weiter erläutert.

Beispiel Vincadiolin

1500 kg trockener Blätter von Catharanthus roseus werden fünfmal je eine Stunde extrahiert, wobei 28 Volumina Benzol, das durch Zugabe von 28 % (Gewicht/Volumen) Ammoniumhydroxid alkalisch gemacht worden ist, als Extraktionsmediura verwendet werden. Die Benzolextrakte werden von dem faserigen Material abdekantiert, vereinigt und filtriert. Das Filtrat wird über wässriger Weinsäurelösung verdampft, die dann filtriert wird. Das hierbei erhaltene Filtrat wird zweimal bei pH 3,1 mit gleichen Volumina Benzol extrahiert, und die Benzolextrakte werden abgetrennt und verworfen. Der pH-Wert des Filtrats wird dann durch Zugabe von konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 6,0 eingestellt. Die wässrige Phase von pH = 6,0 wird dreimal mit gleichen Volumina Benzol extrahiert. Die Benzolextrakte werden vereinigt und im Vakuum eingeengt und liefern einen Rückstand von 4695 g eines rohen Alkaloidgemisches (VRA). Dieses VRA wird in Äthanol gelöst, und die Lösung wird mit 3-prozentiger äthanolischer Schwefelsäure auf pH 4,2 eingestellt. Es bilden sich sofort die Sulfate der dimeren Alkaloide in Form von Nadeln, und zur vollständigen Kristallisation läßt man 2 Tage stehen. Die

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Kristalle werden dann abzentrifugiert, mit Äthanol gewaschen und getrocknet. Die Mischung der Sulfatsalze von Leurosidin, Vincadiolin, Vinblastin und Vincristin wird zusammen mit einer kleinen Menge Leurosinsulfat erhalten. Die Salze werden durch Auflösen in Wasser und Einstellen des pH-Werts der wässrigen Lösung mit 14 η Ammoniumhydroxid auf 8,0 in die entsprechenden freien Basen übergeführt, und die wasserunlöslichen Basen werden mit Methylenchlorid extrahiert. Der Methylenchloridextrakt wird filtriert, und das Lösungsmittel wird durch Eindampfen im Vakuum entfernt. Der erhaltene Rückstand wird an 15 kg Aluminiumoxid (Aktivität III bis IV, 200 m²/g) chromatographiert, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Wasser im Verhältnis 25 : 75 : 0,4 als Elutionsmittel verwendet wird. Die Chromatographie wird in einem Rohr aus korrosionsbeständigem Stahl mit den Abmes-

2 sungen 5 χ 730 cm bei einem Druck von 14 bis 28 kg/cm (200 - 400 psi) durchgeführt. Das Verhältnis von Aluminiumoxid zu Beschickung beträgt etwa 300 : 1. Das Eluat wird bei 280 m,u überwacht, und die Fraktionen werden aufgrund der im Ultraviolettprofil beobachteten Spitzen abgetrennt. Durch Dünnschichtchromatographie werden die Fraktionen identifiziert, die überwiegend Leurosin, Vinblastin, Des-N-methylvinblastin und Leukocristin enthalten. An dieser Säule werden drei Beschickungen von jeweils 50 g der rohen dimeren Alkaloide (die freien Basen aus dem VRA-SuIfat) chromatographiert, wobei die bekannten dimeren Alkaloide nacheinander eluiert werden. Die hinterbleibenden stärker polaren dimeren Alkaloide dieser drei Durchsätze werden dann mit Methanol eluiert. Es werden etwa 3,38 g rohe polare dimere Alkaloide erhalten. Diese Rohalkaloide werden erneut an 3,5 kg Aluminiumoxid (Aktivität III - IV) in einem 2,5 χ 730 cm-Rohr unter Verwendung von Äthylacetat/Wasser (98 : 1,8) als mobiler Phase chromatographiert. Das Verhältnis von Aluminiumoxid zu Beschickung beträgt etwa 1000 : 1, und die Chromatographie wird bei etwa 63 kg/cm (900 psi) durchgeführt. Das Eluat wird wie

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oben bei 280 m,u überwacht. Die auf diese Weise erhaltene vierte Fraktion, die 297 mg ausmacht, enthält Vincadiolin als hauptsächliches Alkaloid. Das Eluierungsmittel Wird verdampft, und der Rückstand wird aus Äther umkristallisiert, und man erhält gereinigtes Vincadiolin, das bei bis 220,5 ⁰C unter Zersetzung schmilzt.

Vincadiolin ist wie bereits erwähnt ein Antimitosemittel, das als Heilmittel mit tumcrhemmenden Eigenschaften verwendet werden kann. Dies ergibt sich aus seiner Fähigkeit, gezüchtete Zellen bei der Mitosephase (Metaphase) des Zellzyklus ohne sichtbaren Effekt auf andere Stufen des Zellzyklus zu hemmen. Die meisten der bekannten Indoldihydroindol-(Dimeren)-Alkaloide aus Vinca rosea mit tumorhemraenden Eigenschaften haben die Fähigkeit Metaphasenhemmung zu verursachen. Hierzu gehören vor allem Vincaleukoblastin (VLB), Vincristin und Leurosin. Monomere Vincaalkaloide besitzen keine Metaphasenhemmwirkung und sind nicht antimitotisch. Vincadiolin entfaltet seine Methaphasenhemm-

_2 wirkung bei Konzentrationen im Bereich von 2 χ 10 bis

—4
2 χ 10 mcg/ml, wie VLB und Vincristin.

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Claims (10)

Patentansprüche

1. Vincadiolin der Formel

CH₃

1

1 2

1 3

,CHs

CHaO

und seine pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze.

2. Ein Sulfat der Verbindung nach Anspruch 1

3. Vincadiolin, ein Indol-Dihydroindol mit folgenden Eigenschaften:

F. = 218 bis 220,5 °C (Zers.);

Pulverröntgenstrahlbeugungsdiagramm unter Verwendung von gefilterter Chromstrahlung, λ =2,2896 8,

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d in 8 1/I₁ -1 d in 8 1/I₁ 11,40 10 -2 4,17 10 9,55 100 3,99 60 8,87 9O 3,71 20 8,63 9O 3,64 15 7,78 5 3,44 10 B 7,57 6O 3,19 20 7,21 5O 3 ,05 5 6,00 40 —"^ 2,85 20 5,88 40 2,78 10 5,58 70 2,61 10 5,22 20 2,44 15 B 5,08 20 2,21 5 B 4,70 50 2,07 5 4,57 40 1,98 15 4,42 5 7 1,91 5 4,31 5 09 NMR-Spektrum, cTbei 7,13, ,53, 8,04, 3,60, 6 ,61, 6,09, 3,79, 2,70, 9 ,77, 5,47, 2, , 0,80, 5,85, 5,29 , 5,63, 3,84, 0,91;

Infrarot-Absorptionsmaxima bei 3480, 1745 und 1725 cm ; Molekulargewicht 826;

empirische Formel ^C46^H58^N4^lo ^un(* Massenionen, m/e = 826, 170, 371.

4. Verfahren zur Gewinnung des dimeren Indolalkaloide Vincadiolin nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen Vinca rosea-Extrakt dieses Alkaloids bereitet,

b) die bekannten Alkaloide von dem Extrakt abtrennt,

c) die hinterbleibenden Alkaloide durch Hochdruckchromatographie eluiert und

d) das praktisch reines Vincadiolin enthaltende Eluat isoliert.

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5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem das Sulfatsalz von Vincadiolin bildet.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Extrakt von Stufe a) durch Extrahieren des Alkaloids mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, Destillieren des Extrakts über wässriger Weinsäure, Abtrennen der wässrigen sauren Schicht von der organischen Schicht, Einstellen des pH-Werts der wässrigen Schicht auf pH y.6 und Extrahieren des Alkaloids in Form der freien Base mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel herstellt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Extrakt von Stufe a) durch Extrahieren des Alkaliods mit wässriger Säure bei pH ol3, Extrahieren der so erhaltenen sauren Lösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, Abtrennen der wässrig sauren Schicht von der organischen Schicht, Einstellen des pH-Werts der wässrigen Schicht auf pH -^ 6 und Extrahieren des Alkaloids in Form der freien Base mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel herstellt.

8. Verfahren nach Anspruch 4,6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die bekannten Alkaloide in Stufe b) von dem Extrakt durch Gelexklusionschromatographie unter Verwendung einer mobilen Phase bei pH ~3 mit wässrigem Puffer abtrennt, das dimere Alkaloid aus den wässrigen Puffereluatfraktionen, in denen es nach üblichen analytischen Arbeitsweisen nachgewiesen wird, mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, die Extrakte abtrennt, das Extraktionslösungsmittel von diesen Extrakten verdampft,

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das extrahierte Alkaloid in einem niederen Alkanol löst, das Alkaloid in das Sulfatsalz überführt und dieses Salz isoliert und das Sulfatsalz in die entsprechende freie Base überführt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkaloid in Form der freien Base durch Einstellen des pH-Werts des Filtrats durch Zugabe von äthanolischer Schwefelsäure auf pH ~4,2 in das Alkaloidsulfatsalz übergeführt und das so gebildete gefällte kristalline Sulfatsalz des dimeren Indolalkaloids abgetrennt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 4,6,7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hochdruckchromatographie in Stufe c)

im Bereich von 10 bis 350 kg/cm (150 - 5OOO psi) durchgeführt wird.

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