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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues komplettes Verfahren zur
industriellen Herstellung von 5'-Noranhydrovinblastinditartrat
aus frischen Catharanthusblättern
und -trieben. Es umfasst die Extraktion von Alkaloiden aus der vorstehend
genannten Pflanze, aus der eine Mischung aus Vindolin und Catharanthin
isoliert wird. Man lässt
diese Mischung mittels einem Eisenion als Katalysator reagieren,
um Anhydrovinblastin zu erhalten, das für die Synthese von 5'-Noranhydrovinblastin
eingesetzt wird. Das letztere wird eingesetzt, um 5'-Noranhydrovinblastinditartrat
herzustellen, ein Bisindolalkaloid, von dem bekannt ist, dass es
Antitumorwirkungen aufweist und das bei der Chemotherapie von Lungenkrebs, Brustkrebs
und der Hodgkin-Krankheit eingesetzt wird.
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STAND DER
TECHNIK
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Vindolin
(3-Methoxycarbonyl-4-acetyloxy-6,7-didehydro-3-hydroxy-16-methoxy-1-methyl-aspidospermidin,
PM: 456,54) ist ein Dihydroindolalkaloid. Seine Formel ist in der 1 angegeben.
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Catharanthin
(18-Methoxycarbonyl-3,4-didehydro-ibogamin, PM: 336,43) ist ein
Indolalkaloid. Seine Formel ist in der 2 dargestellt.
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Anhydrovinblastin
(3',4'-Didehydro-4'-deoxy-vinblastin,
PM: 764,92) ist ein Bisindolalkaloid. Seine Formel ist in der 3 dargestellt.
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5'-Noranhydrovinblastinditartrat
(3',4'-Didehydro-4'-deoxy-C5'-nor-vinblastinditartrat,
PM: 1079,13) ist ein Bisindolalkaloid. Seine Formel ist in der 4 dargestellt.
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5'-Noranhydrovinblastin
weist eine ähnliche Struktur
wie Vinblastin auf. Der Unterschied besteht in einer Methylengruppe
weniger in der Catharanthinhälfte
und dem Vorliegen einer Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffen
3' und 4' aufgrund der Abwesenheit
eines Wassermoleküls.
5'-Noranhydrovinblastin
weist aufgrund seiner Antitumorwirkungen und seiner im Vergleich
zu Vinblastin verminderten Neurotoxizität eine besondere Bedeutung
auf. 5'-Noranhydrovinblastinditartrat
ist ein Salz, das für die
klinische Verabreichung des Arzneimittels angewendet wird.
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Vindolin
und Catharanthin sind pharmakologisch von Bedeutung, da sie die
Rohmaterialien für die
Semi-Synthese von Anhydrovinblastin darstellen, das als Rohmaterial
für die
Synthese von antitumoralen Bisindolalkaloiden wie Vinblastin und
5'-Noranhydrovinblastin
verwendet wird. Ferner kann Vinblastin auch zur Synthese von Vincristin
und Vindesin verwendet werden.
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Die
aus Vinca extrahierten natürlichen
dimeren Alkaloide – Vinblastin
und Vincristin – weisen
aufgrund ihres Mechanismus zur Blockierung des Zellcyclus in der
Phase M wirksame klinische antimitotische Effekte auf. Sie werden
zur Behandlung der Hodgkin-Krankheit und von Eierstockkrebs eingesetzt (Lhomme,
C., Rev. Prat. (France) 40, 1780 – 1781 (1990)). Trotz ihrer
Wirksamkeit wurden einige Nachteile bei ihrer Anwendung festgestellt,
wie die Kreuzresistenz (Maral, R., Bounut, C., Chenn, E. and Mathe,
G., Cancer Chemother. Pharmacol. 5 (3), 197–199 (1981)), und hohe Toxizitätswerte,
insbesondere im Hinblick auf die Neurotoxizität (Binet, S., Chaineau, E.,
Fellous. A., Lataste, H., Krikorian, A., Couzinier, J.P., Meininger,
V., Int. J. Cancer 46, 262–266
(1990)).
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Diese
Nebenwirkungen haben zu Forschungs- und Entwicklungstätigkeiten
geführt,
mit dem Ziel, Alkaloidanaloga zu synthetisieren, um ihre antimitotischen
Wirkungen beizubehalten, jedoch unter Erniedrigung ihrer Toxizitätslevels.
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Es
wurden eine große
Anzahl semi-synthetischer Nebenprodukte chemisch und pharmakologisch
untersucht und nur einige erreichten das Stadium klinischer Studien
[O. Van Tellingen, J. H. M. Sips, J. H. Beijnen, A. Bult and W.
J. Nooijen, Anticancer Research, 12, 1699–1716 (1992)].
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5'-Noranhydrovinblastin
stellt das wichtigste der Vinblastinanalog dar. Diese Verbindung
ist von großem
Interesse, da sie hohe Antitumoraktivitätswerte und geringe Neurotoxizitätswerte
mit weniger Nebenwirkungen als Vinblastin und Vincristin aufweist.
Ihre Wirkung gründet
sich auf einer starken Inhibierungsfähigkeit der Tubulinpolymerisation,
die zu einer Inhibierung der Bildung der achromatischen Spindel
führt,
die die Migration der Chromosomen während der Anaphase der Mitose
ermöglicht
(Fellous, A., Ohayon, R., Vacassin, T., Binet, S., Lataste, H.,
Krikorian, A., Couzinier, J. P., und Meininger, V., Semin. Oncol.
16, 9–14
(1989)).
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Die
Klimabedingungen und Bodenbedingungen der Entre Ríos Provinz
haben sich für
die Entwicklung des Anbaus von Apocynaceae-Pflanzen als geeignet
herausgestellt, insbesondere für
die Cantharanthusgattung, und vor allem der Spezies Catharanthus roseus,
Catharanthus ovalis und Catharanthus longifolius, und ganz besonders
Catharanthus roseus G. Don, früher
als Vinca rosea Linn bekannt („Index
Kewensis" Part IV,
Claredon Press, Oxford, England, 1895, Seite 1203).
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Ferner
gibt die landwirtschaftliche Praxis in Argentinien, in Kombination
mit der Entwicklung der pharmazeutischen Technologie, der Entwicklung
von Produkten den Vorrang, die aus lokal produzierten pflanzlichen
Rohmaterialien extrahiert werden und zur Wertsteigerung der nationalen
Wirtschaft beitragen. Die Abteilung für Forschung und Entwicklung der
Eriochem S. A. hat nach intensiver Forschung und Untersuchungen
in ihren industriellen Anlagen ein neues Verfahren entwickelt – die vorliegende
Erfindung. Dieses Verfahren ermöglicht
die Synthese von 5'-Noranhydrovin-blastinditartrat
in industriellem Maßstab
aus Rohmaterialien, die in der Provinz von Entre Ríos anwachsen.
Dessen Reinheit liegt bei über
99 % und es ist für
eine Verwendung in medizinischen Formulierungen zur Anwendung am
Menschen geeignet.
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Der
Stand der Technik ist reich an Veröffentlichungen über partielle
Verfahren wie die Extraktion von Vindolin und Catharanthin, unter
anderem in den Patenten FR 25 44 318,
US
41 72 007 , bei denen die isolierten und gereinigten monomeren
Alkaloide erhalten werden. Weitere Veröffentlichungen wie die Studien
von Pierre Potiers's
(Synthesis of Catharanthus Alkaloids, „Journal of Natural Products" V43, N1, Jan – Feb 1980),
die Patente
US 42 79 817 ,
US 43 07 100 ,
US 50 47 528 ,
FR 25 44 319 und verwandte Artikel
beschreiben die Synthese von intermediärem Anhydrovinblastin aus reinem
Vindolin und Catharanthin oder von Mischungen aus der Bildung des
Catharanthin-N-Oxids, gefolgt von der modifizierten Polonovsky-Reaktion. Ein weiteres
Syntheseverfahren, das von Mitsui Petrochemical Ind. Ltd. entwickelt worden
ist, verwendet reines Vindolin und Catharanthin als Ausgangsmaterialien
und das Anhydrovinblastin wird durch Oxidation mit Eisenkation erhalten (WO
88/02002,
EP 354 778 ).
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Das
Patent
US 43 07 100 beansprucht
das 5'-Noranhydrovinblastinmolekül mit N-Oxid
als eingesetztes Verfahren. Weitere Patente wie z. B.
US 52 20 016 erhalten 5'-Noranhydrovinblastin
aus einem Indol, wobei jede funktionelle Gruppe schrittweise synthetisiert
wird, bis die Totalsynthese des Moleküls erzielt worden ist.
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Der
Stand der Technik enthält
keine Informationen über
ein Verfahren, das Catharanthusspezies als Ausgangsmaterial einsetzt
und zu 5'-Noranhydrovinblastinditartrat
führt.
Ferner werden beim Nebeneinanderstellen von wissenschaftlichen Veröffentli chungen
und Patentveröffentlichungen
zwar Verfahren gefunden, die von der Extraktion der bereits gemahlenen
Pflanze bis zur Produktion von rohem 5'-Noranhydrovinblastin reichen, jedoch
enthalten sie keinen Hinweis auf die Schritte, die bei der Synthese gemäß dem vorliegenden
Patent durchgeführt
werden.
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Der
Anmelder stand der technologischen Herausforderung gegenüber, eine
Synthese von 5'-Noranhydrovinblastinditartrat
aus Alkaloiden, die aus der Spezies Catharanthus roseus extrahiert
worden waren, bereitzustellen und so wurde ein Verfahren mit den
folgenden neuen Merkmalen entwickelt:
Es wird die frische Pflanze
verarbeitet, so dass die gewünschten
Alkaloide so wenig wie möglich
Zersetzung unterworfen sind, es wird eine unreine Mischung von Vindolin
und Catharanthin für
die Synthese von Anhydrovinblastin mit dem Eisenionkatalysator verwendet,
ein neues Verfahren zur Lagerung von Anhydrovinblastin ist entwickelt
worden, es werden die Reinigung und das Recycling von Lösungsmitteln durchgeführt, rohes
5'-Noranhydrovinblastin
wird in Tandem ohne Isolierung des bromierten Zwischenprodukts synthetisiert,
rohes 5'-Noranhydrovinblastin wird
durch Chromatographie und Kristallisierung gereinigt, und schließlich wird
ein Verfahren zum Erhalt von 5'-Noranhydronvinblastinditartrat
entwickelt, bei dem kein Substanzverlust auftritt, um die gewünschte Reinheit
zu erzielen. Dies führt
zu einer größeren Gesamtausbeute,
verminderten Verfahrensdauern, verringerter Verwendung von Lösungsmitteln
und einer kleineren Anzahl von Reinigungsschritten, da es mehrere
Reaktionen in einem einzigen Verfahrensschritt umfasst. Folglich
ist das neue Herstellungsverfahren wirtschaftlicher und effizienter.
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BESCHREIBUNG
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Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung kann in sieben Hauptstufen unterteilt werden, die im folgenden
angegeben sind:
- 1) Zerkleinern der nicht-zersetzten
(non-degraded) Catharanthuspflanze
- 2) Gewinnen der Gesamtalkaloide aus der Catharanthuspflanze
- 3) Gewinnen der chromatographischen Fraktion aus Vindolin und
Catharanthin
- 4) Synthese und Reinigung von Anhydrovinblastin
- 5) Synthese von 5'-Noranhydrovinblastin
- 6) Reinigung von rohem 5'-Noranhydrovinblastin
- 7) Herstellung von 5'-Noranhydrovinblastinditartrat
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Genauer
gesagt umfasst das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung die folgenden Verfahrensschritte:
- • Zerreiben
(grinding) von Pflanzen der Apocynaceae-Familie (Apocinaeceous family)
mittels einer Blatt- oder Hammermühle;
- • Fest-Flüssig-Extraktion
von Alkaloiden aus der zerriebenen Pflanze mittels eines organischen,
in Wasser löslichen
Lösungsmittels;
- • Konzentrierung
des Extrakts bei Raumtemperatur (von 20°C bis 30°C), um das organische Lösungsmittel
zu entfernen und die Zersetzung von Vindolin und Catharanthin zu
vermeiden;
- • Wiedergewinnung
des Lösungsmittels
durch Rektifikation;
- • Verdünnen des
Extrakts in einer wässrigen, säurehaltigen
Lösung;
- • Entfernung
von Verunreinigungen und Pigmenten des Pflanzenextrakts mittels
Flüssig-Flüssig-Extraktion
der wässrigen,
säurehaltigen,
verdünnten
Lösung
mit einem organischen Lösungsmittel;
- • Wiedergewinnung
von Lösungsmittel
durch Destillation;
- • Neutralisation
und/oder Alkalisierung der wässrigen,
säurehaltigen
Phase entweder mit einer anorganischen oder organischen Base;
- • Flüssig-Flüssig-Extraktion
mit einem organischen Lösungsmittel,
welches die in Wasser gelösten
Alkaloide extrahiert;
- • Konzentrierung
durch Abdampfen, bei einer niedrigen Temperatur, des gesamten Alkaloid-Extrakts;
- • Wiedergewinnung
der Lösungsmittel
durch Kondensation;
- • Abtrennung
des gesamten Alkaloid-Extrakts durch Flüssigkeitschromatographie auf
Silicagel mit Mischungen organischer Lösungsmittel;
- • Isolierung
der unreinen Chromatographiefraktion, welche reich an Vindolin und
Catharanthin ist;
- • Konzentrierung
zur Trockenheit durch Abdampfen bei reduziertem Druck;
- • Wiedergewinnung
von Lösungsmitteln
durch Kondensation;
- • Synthese
von Anhydrovinblastin aus Vindolin und Catharanthin durch Auflösen derselben
in einer tamponierten (tamponed) wässrigen, säurehaltigen Lösung und
Zugabe eines Eisensalzes (ferric salt), welches die Bindung von
Vindolin an Catharanthin katalysiert, um ein oxidiertes Iminio-Zwischenprodukt
zu ergeben;
- • Tandemreduktion
des oxidierten Iminio-Zwischenprodukts zu Anhydrovinblastin mit
Natriumborhydrid in einer Ammoniumhydroxidlösung;
- • Extraktion
von Anhydrovinblastin mit einem organischen Lösungsmittel;
- • Konzentrierung
durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels bei niedriger
Temperatur;
- • Wiedergewinnung
von Lösungsmitteln
durch Kondensation;
- • Kristallisation
von Anhydrovinblastin aus Methanol;
- • Filtrieren
und Vakuumtrocknen von Anhydrovinblastin;
- • Reaktion
von Anhydrovinblastin und einem Halogenierungsreagenz (halogenated
agent) bei niedriger Temperatur von –40°C bis –80°C mit einem organischen Lösungsmittel,
organischer Säure
und unter Stickstoffeinleitung, um ein halogeniertes Intermediat
von Anhydrovinblastin zu gewinnen;
- • Reaktion
dieses Intermediats mit Silbertetrafluorborat in einem mit Ammoniumacetat
alkalisiertem Medium in Wasser und Tetrahydrofuran, um rohes 5'-Noranhydrovinblastin zu gewinnen;
- • Extraktion
mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel und Konzentrierung
durch Abdampfen;
- • Wiedergewinnung
von Lösungsmitteln
durch Kondensation;
- • Reinigung
von 5'-Noranhydrovinblastin
durch Chromatographie und Kristallisation, bis eine Konzentration über 99 %
erreicht ist;
- • Wiedergewinnung
der chromatographischen Eluent-Lösungsmittel
durch Kondensation der abgedampften Fraktionen;
- • Bildung
von 5'-Noranhydrovinblastinditartrat
mit Weinsäure
in einem alkoholischen oder wässrigen
Medium.
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Das
Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzen der Apocynaceae-Familie frisch und
feucht oder bei einer Temperatur von weniger als 30°C getrocknet
zerrieben (ground) werden; dass die Synthese von Anhydrovinblastin
mit einer unreinen Fraktion einer vindolin- und catharanthinreichen
Mischung bei einem pH von 2 für
eine Dauer zwischen 15 und 25 Stunden durchgeführt und kein Vinblastin hergestellt
wird; dass das Anhydrovinblastin nach der Synthese in Stickstoff
und bei weniger als –20°C bis zu
dessen Einsatz aufbewahrt wird; dass die Reaktion des halogenierten
Zwischenprodukts mit Silbertetrafluorborat eine Tandemreaktion darstellt;
und dass die Bildung von 5'-Noranhydrovinblastinditartrat
aus dem Lösen
von rohem 5'-Noranhydrovinblastin
mit einer Reinheit von über
99 % in absolutem Ethanol bei einer Konzentration von 0,10 bis 0,2
mMol/ml und der Zugabe der equimolaren Menge Weinsäure und der
Konzentrierung bis zur Trockene bei reduziertem Druck und im Dunklen
oder aus einer Lyophilisierung besteht.
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Die
genauen Schritte des neuen Verfahrens sind im folgenden beschrieben,
in Übereinstimmung mit
der bevorzugten Durchführung:
Das Ausgangsmaterial ist eine Pflanze aus der Apocynaceae-Familie,
insbesondere der Gattung Catharanthus und vor allem der Spezies
Catharanthus roseus, Catharanthus ovalis und Catharanthus longifolius,
genauer gesagt Catharanthus roseus G. Don, früher als Vinca rosea Linn bekannt,
die reich an Alkaloiden ist. Vindolin und Catharanthin sind von
besonderer Bedeutung für
das vorliegende Verfahren. Es wurden Laboruntersuchungen durchgeführt, in
denen aufgezeigt wurde, welche Teile der Pflanzen Vindolin und Catharanthin
enthalten. Bei diesen Untersuchungen konnte festgestellt werden,
dass die Substanzen in bedeutsamen Mengen nur in deren Blättern und
Trieben (shoots, Schösslingen)
gefunden werden, unabhängig
von der Blühperiode
der Pflanzen während dem
ganzen Jahr. In den Stielen und Wurzeln können Vindolin und Catharanthin
nur in geringen Mengen gefunden werden, die keine Extraktion rechtfertigen können.
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Der
angegebene Stand der Technik erwähnt das
traditionelle Trocknen der Pflanze vor der Extraktion von Vindolin
und Catharanthin. Aus verschiedenen Laboruntersuchungen wurde gefolgert,
das sowohl die Wärme
als auch die Zeit die Konzentration der erwünschten Alkaloide in Vinca
rosea beeinträchtigen.
So wurde zwei neue alternative Verfahren entwickeln, um diese Aufgabe
zu lösen.
Die erste Alternative besteht in der Verwendung von frischem, feuchtem
Ausgangsmaterial. Das Zerreiben von frischen Pflanzen führt Probleme
mit sich, die durch Verwendung einer Blattmühle überwunden werden können, wodurch
ein feinzerriebenes (highly disintegrated) Material erhalten wird,
das für
Extraktionen mit Lösungsmittel
geeignet ist. Die zweite Alternative besteht in der Trocknung des
frisch geernteten Materials bei niedriger Temperatur, unter 35°C, und bevorzugt
unter 20°C
für 1 bis
15 Tage, bevorzugt weniger als 7 Tage. Dieses Verfahren beeinflusst
nicht die Konzentration von Alkaloiden, die in der frischen Pflanze
vorliegen, insbesondere von Catharanthin. Es ist folglich möglich, eine
Hammermühle
oder eine Blattmühle
einzusetzen.
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Ein
Gesamtextrakt von Catharanthus wird mittels einer Extraktion mit
Lösungsmitteln,
die mit Wasser mischbar sind, erhalten. Dieses Verfahren weist Vorteile
im Vergleich zu einer Extraktion mit nicht-mischbaren Lösungsmitteln
auf, da eine Vorbehandlung mit Alkali zur Freisetzung der Alkaloide,
die als Salze in der Pflanze vorliegen, nicht erforderlich ist,
da diese in Alkohol löslich
sind. Die Extraktion wird bei Raumtemperatur (von 20°C bis 30°C) dreimal
mit aliphatischen Alkoholen mit 1 bis 5 C oder deren Mischungen
durchgeführt.
Es können
Methanol, Ethanol und Isopropanol eingesetzt werden (Methanol ist
bevorzugt), für
eine Dauer von jeweils 30 Minuten bis 40 Stunden. Die Extrakte werden
in einem Kletterfilmverdampfer bei vermindertem Druck konzentriert,
bei einer Temperatur unter 30°C.
Die Lösungsmittel
werden durch Kondensation wiedergenommen und es wird eine Rektifizierung
durchgeführt,
um den Alkohol zurückzugewinnen,
wobei er von Wasser und Unreinheiten abgetrennt wird. Nach Durchführung der
entsprechenden Tests wird er in den gleichen Verfahrensschritt zurückgeführt.
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Eine
anorganische Säure,
die Schwefelsäure
1N, Salzsäure
1N sein kann, wird zu dem Konzentrat zugefügt – das vorwiegend aus Wasser
aus der Pflanze selbst besteht – und
wird mit einem unpolaren organischen Lösungsmittel extrahiert, das
Methylenchlorid, Chloroform, Dichlorethan, Hexan, Petroleumether
(40–60°), Isopropylether,
Ethylacetat, bevorzugt Methylenchlorid darstellen kann. Es werden drei
nacheinanderfolgende Extraktionen vorgenommen, um Chlorophyll und
weitere Pigmente zu entfernen. Die organische Phase mit diesen Pigmenten wird
destilliert und das Lösungsmittel
wird wiedergewonnen und nach Analyse in das Verfahren zurückgeführt. Die
wässrige
Phase wird mit konzentriertem Ammoniumhydroxid oder Natriumhydroxid
1N, bevorzugt konzentriertem Ammoniumhydroxid, mit einem pH zwischen
7,5 und 9 alkalisiert. Sie wird mit anorganischem Salz gesättigt, das
Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumsulfat und bevorzugt Natriumchlorid
darstellen kann.
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Die
Extraktion wird mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel
durchgeführt,
wie z. B. Methylenchlorid, Chloroform, Dichlorethan, Hexan, Petroleumether
(40–60°), Isopropylether,
Ethylacetat und bevorzugt Methylenchlorid. Nach drei Extraktionen
werden die erhaltenen Extrakte bei vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer
bis zur Trocknung konzentriert, bei einer Badtemperatur von 40°C oder weniger.
Die Lösungsmittel
werden kondensiert und im gleichen Verfahrensschritt wieder eingesetzt.
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Das
Ergebnis ist ein Rohprodukt der Gesamtalkaloide mit einer Massenausbeute
von 0,05 bis 0,3 % bezogen auf das frische Material – üblicherweise
0,15 bis 0,25 %. Das Rohprodukt wird auf einer Säule von Silicagel 60 mit 63
bis 37 Mikrometer (mm) (230–400
mesh ASTM) chromatographiert, wobei mit einer Mischung von Methylenchlorid-Ethylacetat 80:20
eluiert wird. Die verschiedenen Fraktionen werden gesammelt und
jene, die am stärksten
mit der Mischung aus Vindolin und Catharanthin angereichert sind,
werden ausgewählt
(die Fraktionen werden mittels Dünnschichtchromatographie
auf Merck Silicagel-Platten und Methylenchlorid-Aceton-Methanol
als Laufmittel (development solution): 29:5:3 untersucht). Die abgetrennten
Fraktionen werden bei vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer verdampft,
wodurch eine Mischung erhalten wird, die reich an Vindolin und Catharanthin
ist, welche 40 % bis 80 % der Vindolin- und Catharanthinmischung
in einem Molverhältnis
von 1:1 bis 1,5:1, üblicherweise 1,1:1–1,3:1 wie
aus der Pflanze extrahiert enthält. Dies
bedeutet eine Massenausbeute von 5 % bis 20 % der Gesamtalkaloide,
insbesondere zwischen 7 % und 12 %. Die chromatographischen Eluierungslösungsmittel
werden rektifiziert und analysiert, das benötigte Konzentrationsverhältnis wird
eingestellt und die Lösungsmittel
werden wieder in dem Chromatographieverfahren eingesetzt.
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Anschließend wird
das Anhydrovinbastin aus der unreinen Mischung von Vindolin und
Catharanthin mit dem Eisenkantion (ferric cation) als Katalysator hergestellt.
Das Arbeiten mit einer unreinen Fraktion vermeidet eine teure Trennung
und Reinigung jeder dieser beiden Alkaloide, wodurch die benötigte Menge
an Lösungsmittel
und Silicagel reduziert wird. Es werden Reaktionsausbeuten von 70
% erzielt, was mit jenen im zitierten Stand der Technik und jenen, die
in den Laboratorien von Eriochem S. A. mit gereinigtem Vindolin
und Catharanthin als Ausgangsmaterialien erhalten wurden, übereinstimmt.
Nachdem die Reaktion zum Erhalten von Anhydrovinblastin beendet
ist, wird dieses dimere Alkaloid auf gleiche Weise isoliert und
gereinigt, unabhängig
davon, ob die gereinigten Monomere als Anfangsmaterialien eingesetzt
wurden oder ob das Anfangsmaterial eine Mischung mit Gehalten der
gewünschten
Alkaloide im Bereich von 40 bis 100 % darstellte. Aus dem Stand der
Technik geht weder ein Hinweis auf, noch ein Nachweis über diesen
Schritt des neuen Verfahrens hervor.
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Die
Anhydrovinblastinsynthese wird in einem Glasreaktor durchgeführt, in
einem wässrigen
Medium. Anhydrovinblastin wird vorzugsweise bei pH 12 oder niedriger
erhalten, denn je höher
der pH ist, desto mehr Vinblastin wird hergestellt. Das Medium kann gebildet
werden, indem eine anorganische Säure in Konzentrationen unter
1 % verwendet wird, um den richtigen pH zu erhalten. Es können Salzsäure oder Schwefelsäure verwendet
werden. Es sollte auch ein Puffer (tampon) wie z. B. Glycin oder
Citrat, bevorzugt ein Glycinpuffer, Natriumchlorid und Chlorwasserstoffsäure bei
pH 2 verwendet werden.
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Die
Reaktion wird bei einer Temperatur zwischen 10 °C und 25 °C durchgeführt, durch die Mischung wird
Stickstoff oder ein anderes inertes Gas wie z. B. Argon eingeleitet
und diese Bedingung wird während
der Reaktion beibehalten, um die Bildung von unerwünschten
Alkaloiden wie Vinblastin, Catharin, Leurosin etc. durch Oxidation
zu vermeiden.
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Der
Eisenkatalysator (ferric catalysator) wird zu diesem Puffer zugegeben.
Der Katalysator kann Eisenchlorid, Eisensulfat, Eisennitrat, bevorzugt
Eisenchloridhexahydrat sein.
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Der
Katalysator wird in einem Molverhältnis von 5:1 zu Catharanthin
zugegeben.
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Die
vindolin- und catharanthinreiche chromatographische Fraktion wird
zugegeben, wobei Rühren
und Stickstoffeinleiten für
eine Dauer von 2 bis 40 Stunden beibehalten wurden, während der
ein Iminio-Zwischenprodukt gebildet wird. Dieses Zwischenprodukt
wird zu Anhydrovinblastin, indem das Reaktionsprodukt mit einem
Mittel, insbesondere Natriumborhydrid, in einem alkalischen Medium,
bevorzugt kon zentriertes Ammoniumhydroxid, bei Raumtemperatur reduziert
wird, wobei man es für
10 bis 60 Minuten, bevorzugt zwischen 10 und 15 Minuten reagieren
lässt.
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Zur
Isolierung von Anhydrovinblastin wird die Mischung mit einem unpolaren
organischen Lösungsmittel
extrahiert, das Ethylacetat, Ethylether, bevorzugt Methylenchlorid
sein kann. Nach vier Extraktionen wird die organische Phase durch
eine Filterschicht wie Celite filtriert, um das Eisen zu isolieren,
und bei vermindertem Druck konzentriert. Dieser Rückstand
wird in Methylenchlorid oder einem organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat,
Ethylether, bevorzugt Methylenchlorid, verdünnt und mit Aktivkohle behandelt.
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Die
entfärbte
Lösung
wird bei vermindertem Druck konzentriert. Das Lösungsmittel wird kondensiert
und nach Analyse wieder in dem Verfahren eingesetzt und der Verdampfungsrückstand
wird in einem aliphatischen Alkohol mit weniger als 4 C, bevorzugt
Methanol oder Ethanol, wobei Methanol bevorzugt ist, bei Raumtemperatur
gelöst
und wird bei 4 bis 8 °C
für 7 bis
18 Stunden gehalten. Das Präzipitat wird
filtriert, in kaltem Methanol gewaschen und vakuumgetrocknet.
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Die
Ausbeuten an Anhydrovinblastin liegen bei 50 % bis 85 %, üblicherweise
65 % bis 75 %, in Abhängigkeit
der vorstehend genannten Bedingungen.
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Der
Stand der Technik enthält
Angaben zur Instabilität
und der Notwendigkeit des sofortigen Einsatzes von Anhydrovinblastin.
Eine Methode, die Teil des vorliegenden neuen Verfahrens ist, ist
erfolgreich untersucht worden. Diese Methode ermöglicht die Lagerung dieses
Alkaloids in perfekten Bedingungen für mehr als 3 Monate. Dieser
Schritt wird in einer Stickstoffatmosphäre bei einer Temperatur von –15 °C bis –80 °C durchgeführt, bevorzugt
bei –20 °C. Dies ermöglicht das
Aufstellen eines Produktionsplans, der aufgrund der optimalen Verwendung
der Betriebsanlage die Gesamtkosten reduziert.
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Anhydrovinblastin
wird mit einem Halogenierungsmittel umgesetzt, um ein in Position
7' halogeniertes
Zwischenprodukt zu erhalten. Es können mehrere Halogenierungsmittel
eingesetzt werden, wie Chlorbenzotriazol, N-Chlorsuccinimid oder N-Chloracetamid, bevorzugt
N-Bromsuccinimid, das spezifisch das Zwischenprodukt 7'-Bromindolenin aus
Anhydrovinblastin ergibt, wie in der 5 dargestellt.
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Die
stöchiometrischen
Verhältnisse
der Reaktanden können
zwischen 0,8:1 und 1,3:1 liegen, bevorzugt zwischen 1:1 und 1,15:1
(Halogenierungsmittel für
Anhydro vinblastin), und die Reaktion wird durch die Gegenwart von
1 bis 2 Äquivalenten
Trifluoressigsäure
begünstigt.
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Die
Reaktion wird in einer inerten Atmosphäre (Stickstoff oder Argon)
durchgeführt,
bei niedrigen Temperaturen, –80 °C bis –40 °C, bevorzugt –50 °C bis –65 °C. Diese
Bedingungen sollten während
der gesamten Reaktion durch Zugabe aller Reagenzien über einen
Zeitraum von 1 bis 4 Stunden, bevorzugt 2 Stunden, beibehalten werden.
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Im
Stand der Technik, sowohl in der Arbeit von Françoise Gueritte, Composés antitumoraux
du groupe de la vinblastine: dérivés de la
nor-5'-anhydrovinblastin
(Eur.). Med. Chem. Chim. Ther. 1983-18 n5 pp 419–424), als auch in dem US Patent 4,307,100,
wird das erhaltene halogenierte Derivat durch Extraktion mit Lösungsmitteln
nach Neutralisierung des Reaktionsmediums mit Natriumhydroxid oder
einer ähnlichen
Base isoliert.
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In
diesem neuen Verfahren wird die Umwandlung des bromierten Intermediats
in 5'-Noranhydrovinblastin
in Tandem mit der Bromierung durch Zugabe zum gleichen Reaktionsmedium,
nach Neutralisierung mit Ammoniumacetat, von Silbertetrafluorborat
in einem wässrigen
Medium oder Mischungen von Wasser und einem organischen Lösungsmittel
wie Tetrahydrofuran durchgeführt.
Nach Zugabe von Silbertetrafluorborat lässt man die Mischung bei Raumtemperatur
für 2 bis
18 Stunden, bevorzugt für 3
bis 5 Stunden reagieren und anschließend wird sie mit Natriumhydrogencarbonat
oder Natriumacetat alkalisiert. Das Produkt wird aus der wässrigen
Phasen mit einem unpolarem organischen Lösungsmittel, bevorzugt Methylenchlorid,
extrahiert. Durch dieses Verfahren kann die Isolierung von 7'-Bromindolenin aus
Anhydrovinblastin – einem
Zwischenprodukt, das recht instabil ist – umgangen werden. Dies führt, zusammen
mit dem resultierenden Ausbeuteanstieg, dazu, dass die Herstellung
dieser Verbindung in industriellem Maßstab wirtschaftlich möglich ist.
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Die
vereinigten Extrakte werden über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel
wird bei vermindertem Druck verdampft, kondensiert und wieder verwendet.
Die Reaktionsausbeute liegt zwischen 10 und 60 %, üblicherweise
zwischen 25 und 40 %.
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Als
nächstes
wird das 5'-Noranhydrovinblastin
durch Flash-Säulenchromatographie
unter Verwendung von Silicagel als Träger, Granulometrie von 63 bis
37 Mikrometer (mm) (230 bis 400 mesh ASTM) gereinigt und mit Mischungen
von Aceton und Methanol in Verhältnissen
im Bereich von 100:0 bis 80:20 eluiert, bevorzugt in einem azeotropen
Verhältnis (ungefähr 88:12),
was es möglich
macht, die Mischung durch Kondensation nach Konzentrierung von 5'-Noranhydrovinblastin
einfach wiederzugewinnen.
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Die
Zusammensetzung der Fraktionen wird mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt
(Merck Silicagel-Platten, Laufmittel: Methylenchlorid-Hexan-Methanol
50:40:10, Detektion bei 254 nm).
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Nach
der Flash-Säulenchromatographie
wird das Lösungsmittel
verdampft und ein 5'-Noranhydrovinblastin-reiches
Produkt wird erhalten. Für
die Fraktionen, die zusätzliche
Komponenten erhalten, ist eine zweite Chromatographie unter den
gleichen Bedingungen erforderlich.
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Die
Fraktionen, die 5'-Noranhydrovinblastin als
einzigen Flecken bei der Dünnschichtchromatographie
aufweisen, werden unter vermindertem Druck reduziert und der Rückstand
wird aus Methanol kristallisiert, wobei der Rückstand bei einer Temperatur
zwischen 10 und 60 °C,
insbesondere zwischen 20 und 30 °C
gelöst
wird, und man ihn anschließend
bei niedriger Temperatur zwischen 5 °C und –30 °C, bevorzugt zwischen 2 °C und –20 °C, kristallisieren
lässt.
Er wird anschließend
filtriert und getrocknet. Die Reinheit des Materials wird mittels HPLC
bestimmt und liegt bei mehr als 99 %.
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Dieses
Material ist 5'-Noranhydrovinblastin in
Rohform. Die Form, die verwendet wird, um das pharmazeutische Endprodukt
zu erhalten, ist 5'-Noranhydrovinblastinditartrat.
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Es
ist bekannt, dass das übliche
Verfahren zur Reinigung von Salzen wie Alkaloidtartraten mittels
Lösen in
wasserfreiem Alkohol und Kristallisierung, mit Zugabe von Hexan
oder Ethylether, die zur Ausfällung
beitragen, durchgeführt
wird. In den Laboratorien von Eriochem S. A. wurde nun gefunden, dass
insbesondere 5'-Noranhydrovinblastinditartrat keine
kristalline Form zeigt, sondern als amorphes Material ausfällt, so
dass das übliche
Verfahren zu Verlusten der aktiven Substanz in der Mutterlösung führt, ohne
das substantielle Verbesserungen der Qualität des Materials erzielt werden.
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Nach
Experimenten in Bezug auf verschiedene Wege zur Herstellung und
Reinigung des Ditartrats konnte das vorliegende Verfahren erzielt
werden. Es besteht aus dem Lösen
von rohem 5'-Noranhydrovinblastin – mit einer
Reinheit von mehr als 99 % (HPLC) – in absolutem Ethanol, in
einer Konzentration von 0,1 bis 0,2 mMol/ml, bevorzugt 0,15 bis 0,19
mMol/ml und Zugabe der äquimolaren
Menge Weinsäure
bei Raumtemperatur, zwischen 10 °C
und 50 °C,
bevorzugt zwischen 20 °C
und 30 °C.
Anschließend
wird die Mischung bei reduziertem Druck bis zur Trockene konzentriert.
Der amorphe weiße Feststoff
wird dann vakuumgetrocknet bei 666 Pa (5 mmHg) oder weniger, zwischen
20 °C und
50 °C im Dunklen,
bis ein konstantes Gewicht erreicht worden ist. 5'-Noranhydrovinblastinditartrat
wird quantitativ erhalten.
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Alternativ
dazu kann das Ditartrat in einem wässrigen Medium hergestellt
werden, durch Lyophilisieren einer Lösung mit einer Konzentration
zwischen 2 % und 10 % 5'-Noranhydrovinblastinditartrat, die
durch Lösen
der erforderlichen Menge Weinsäure und
Zugabe des entsprechenden rohen 5'-Noranhydrovinblastins, zwischen 10 °C und 30 °C, hergestellt wird.
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Das
genannte Material ist für
die Herstellung einer finalen pharmazeutischen Formulierung geeignet.
Die Reinheit des Materials, bestimmt mittels HPLC, liegt bei über 99 %
und der Titer, der durch Titration der Gesamtalkaloide mittels nicht-wässriger Volumetrie
bestimmt ist und in Bezug auf Gewichtsverluste während dem Trocknen korrigiert
ist, liegt bei etwa 100 %.
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Das
5'-Noranhydrovinblastinditartrat
wird mit einem Waters HPLC mit Diodenarray-Nachweisgerät Modell 996 (PDA) und Pumpe
Modell 515 durchgeführt.
Es wird eine Säule
C-18 285 mm × 4
mm L1 (5 μ)
verwendet und die Detektion wird bei 269 nm vorgenommen. Die mobile
Phase umfasst eine Pufferlösung
mit pH 7,25 (Natriumchlorid, Ammoniumacetat, Cetyltrimethylammoniumbromid)
und Acetonitril in einem Verhältnis
60:40.
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Es
ist darauf hinzuweisen, dass der Stand der Technik keine Hinweise
auf Verfahren zur Herstellung von 5'-Noranhydrovinblastinditartrat aus rohem
5'-Noranhydrovinblastin
enthält.
Ferner erzielen die beiden vorgeschlagenen Alternativen eine maximale
Ausbeute ohne Verlust von aktivem Material während der Herstellung.
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BEISPIEL
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40
kg frischer Blätter
und Triebe von Catharanthus roseus, in einer Hammermühle zerrieben, werden
bei Raumtemperatur (20 °C
bis 30 °C)
dreimal mit Methanol extrahiert, mit jeweils 60 Liter für 24 Stunden.
Die Extrakte werden bei vermindertem Druck konzentriert, bei einer
Temperatur unterhalb von 30 °C,
mit einem Volumen bis zu 20 Litern. Das rückgewonnene Methanol wird rektifiziert,
um es von dem Wasser abzutrennen und wird in dem Verfahren wieder
eingesetzt. 20 Liter Schwefelsäure
1N werden zu dem Konzentrat gegeben – das vorwiegend Wasser aus
der gleichen Pflanze umfasst –,
und es wird dreimal mit jeweils 6 Liter Methylenchlorid extrahiert, um
Chlorophyll und weitere Pigmente zu entfernen. Das Methylenchlorid
wird verdampft und durch Kondensation für eine Wiederverwendung gewonnen. Die
wässrige
Phase wird mit Ammoniumhydroxid konzentriert bis zu pH 8,5 alkalisch
eingestellt, mit Natriumchlorid gesättigt, dreimal mit jeweils
6 Liter Methylenchlorid extrahiert und die Extrakte werden bei vermindertem
Druck bis zur Trockene konzentriert. Das Methylenchlorid wird mittels
Kondensation für
eine Wiederverwendung gewonnen. 75 g eines Rohprodukts der Gesamtalkaloide
werden erhalten und über
eine Säule,
die mit 500 g Silicagel 60 mit 63 bis 37 Mikrometer (mm) (230–400 mesh
ASTM) geladen ist, chromatographiert, wobei mit Methylenchlorid-Ethylacetat
80:20 eluiert wird. Es werden 600 ml-Fraktionen erhalten. Die Fraktionen
3–5 enthalten die
Mischung von Vindolin und Catharanthin (die Fraktion werden chromatographisch über Dünnschicht-Chromatographie
auf Merck Silicagel-Platten untersucht, wobei eine Mischung von
Methylenchlorid-Aceton-Methanol 92:5:3 oder Ethylacetat als Laufmittel
verwendet wird). Die aufgetrennten Fraktionen werden bei vermindertem
Druck eingedampft, wobei 13,6 g einer Mischung erhalten wird, die
reich an Vindolin und Catharanthin ist, mit einem Realmassengehalt
von 32,5 % Vindolin und 22,5 % Catharanthin, gemessen mittels HPLC.
Es wird eine Rektifizierung durchgeführt und die Lösungsmittel
werden zurückgewonnen
und nach Analyse wieder eingesetzt.
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4,25
g Glycin und 3,33 g Natriumchlorid werden in 540 ml Wasser und 525
ml HCL 0,1 N in einem Glasreaktor bei Raumtemperatur gelöst und Stickstoff
wird in die Mischung eingeleitet. 31,85 g Eisenchloridhexahydrat
wird zu diesem Puffer bei Raumtemperatur unter Rühren und Stickstoffeinleitung
zugegeben. 21 g der chromatographischen Fraktion, die vindolin-
und catharanthinreich ist, und 55 % der Mischung Vindolin:Catharanthin
in einem Molverhältnis
von ungefähr
1,1:1 enthält,
werden zugegeben, während
Rühren
und Stickstoffeinleitung für
20 Stunden weitergeführt
werden. Eine Mischung von 1,05 g Natriumborhydrid in 125 ml konzentriertem
Ammoniumhydroxid wird langsam zu der erhaltenen Lösung bei
Raumtemperatur zugegeben und man lässt sie für 20 Minuten reagieren. Die
Mischung wird mit Methylenchlorid extrahiert (4 × 400 ml), das Extrakt wird über Celite
(100 g) filtriert und bei vermindertem Druck konzentriert. Während das
Lösungsmittel durch
Kondensation zurückgewonnen
wird, um es bei der Extraktion erneut einzusetzen, wird der Rückstand
in 75 ml Methylenchlorid verdünnt
und über eine
Aktivkohleschicht filtriert (7 g). Die entfärbte Lösung wird bei vermindertem
Druck konzentriert. Der Verdampfungsrückstand wird in 15 ml Methanol
bei Raumtemperatur gelöst
und bei 2 bis 4 °C
für 12 Stunden
gehalten. Der Niederschlag wird filtriert, in kaltem Methanol (10
ml) gewaschen und vakuumgetrocknet. Es werden so 7,35 g Anhydrovinblastin
erhalten.
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10,1
g Anhydrovinblastin werden in einen Glasreaktor eingeführt, der
mit einem Magnetrührer, Stickstoffeinlass
und einem Trichter versehen ist. Der Reaktor wird in ein Bad bei
-60 °C eingeführt. Durch den
Trichter wird eine Lösung,
die 2,5 g N-Bromsuccinimid, 40 ml Methylenchlorid und 1,39 ml Trifluoressigsäure enthält, unter
Stickstoffeinleitung zugeführt. Die
Mischung wird für
2 Stunden bei –60 °C unter Stickstoffeinleitung
gerührt.
Anschließend
wird der Reaktor aus dem Bad herausgenommen, die Stickstoffzufuhr
wird abgebrochen und es werden aufeinanderfolgend eine Lösung von
2,61 g Ammoniumacetat in 10,1 ml Wasser und eine Lösung von
2,72 g Silbertetrafluorborat in 15,7 ml Tetrahydrofuran und 15,7
ml Wasser zugegeben. Nach 18 Stunden bei 20 °C werden 80 ml Natriumhydrogencarbonat
10 % zugegeben, die organische Phase wird abgetrennt und die wässrige Phase
wird wiederum mit Methylenchlorid (3 × 50 ml) extrahiert. Die erhaltenen
Extrakte werden über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert, und das Lösungsmittel
wird bei vermindertem Druck verdampft, kondensiert und wieder eingesetzt.
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Das
Rohprodukt der Reaktion wird durch Säulenchromatographie gereinigt,
wobei 500 g Silicagel 60 mit 63 bis 37 Mikrometer (230–400 mesh ASTM)
in einer Säule
mit einem Durchmesser von 10 cm verwendet werden und mit Acetongradienten
eluiert wird, bis ein Aceton-Methanol-Azeotrop erreicht wird, was
eine einfache Gewinnung der Mischung durch Kondensation nach der
5'-Noranhydrovinblastin-Konzentrierung
ermöglicht.
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Die
Zusammensetzung der Fraktionen wird chromatographisch durch Dünnschichtchromatographie überprüft (Merck
Silicagel-Platten, Laufmittel: Methylenchlorid-Hexan-Methanol 50:40:10).
Die Fraktionen, die 5'-Noranhydrovinblastin
als Hauptbestandteil enthalten, – chromatographisch mittels Dünnschichtchromatographie überprüft – werden
bei vermindertem Druck reduziert und der Rückstand wird wiederum chromatographiert.
Alle Fraktionen, die 5'-Noranhydrovinblastin
als einzigen Flecken enthalten, werden bei vermindertem Druck konzentriert und
der Rückstand
wird aus Methanol rekristallisiert, wobei man den Rückstand
bei Raumtemperatur (25 °C
bis 30 °C)
löst und
bei –20 °C kristallisieren
lässt, anschließend wird
filtriert und getrocknet. Die Reinheit des Materials wird mittels
HPLC bestimmt, und beträgt über 99 %.
Es werden so 3,15 g rohes 5'-Noranhydrovinblastin
erhalten.
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In
einem Glasreaktor werden 2,83 g rohes 5'-Noranhydrovinblastin mit einer Reinheit
von mehr als 99 % (HPLC) in 14 ml absolutem Ethanol eingeführt und
1,089 g Weinsäure
(äquimolare
Menge) werden bei Raumtemperatur zugegeben.
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Die
Mischung wird bis zur Trockene bei vermindertem Druck konzentriert.
Der amorphe weiße Feststoff
wird bei 666 Pa (5 mmHg), bei 40 °C
im Dunklen getrocknet, bis ein konstantes Gewicht erreicht wird.
5'-Noranhydrovinblastinditartrat
wird quantitativ erhalten: 3,92 g. Die Reinheit des Materials wird
mittels HPLC bestimmt, und liegt bei über 99 %, und dessen Titer,
bestimmt mittels Titration der Gesamtalkaloide durch nicht-wässrige Volumetrie und
gegenüber
Gewichtsverlusten bei der Trocknung korrigiert, liegt bei ungefähr 100 %.
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Die
Gesamtmolausbeute der Synthese aus Catharanthin erreicht 20 % und
eine ungefähre
Massenausbeute von 50 ppm 5'-Noranhydrovinblastinditartrat
mit einer Reinheit von gleich oder größer 99 %, bezogen auf frischen
Catharanthus roseus.