ES2215795T3 - Procedimiento para producir ditartrato de 5-nor-anhidrovinblastina a partir de plantas de tipo catharantus. - Google Patents
Procedimiento para producir ditartrato de 5-nor-anhidrovinblastina a partir de plantas de tipo catharantus.Info
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Abstract
Un procedimiento para la producción de ditartrato de 5¿-nor-anhidrovinblastina a partir de especies vegetales del género Catharanthus que comprende los siguientes pasos de proceso: ¿ molienda de plantas de la familia de las Apocináceas, con molino de cuchillas o de martillos; ¿ liberación de los alcaloides mediante extracción sólido-líquido de la especie vegetal molida, mediante un solvente orgánico soluble en agua; ¿ concentración del extracto a temperatura ambiente (de 20ºC a 30ºC) que elimina el solvente orgánico y evita la descomposición de la vindolina y la catarantina; ¿ recuperación de solvente por rectificación; ¿ dilución del extracto en una solución acuosa ácida; ¿ eliminación de impurezas y pigmentos del extracto vegetal mediante extracción líquido-líquido de la dilución acuosa ácida, con un solvente orgánico; ¿ recuperación de solvente por destilación; ¿ neutralización y o alcalinización de la fase acuosa ácida con una base inorgánica u orgánica; ¿ extracción líquido-líquido conun solvente orgánico, que extrae los alcaloides disueltos en agua; ¿ concentración por evaporación, a temperatura inferior a 30ºC, del extracto de los alcaloides totales; ¿ recuperación de solventes por condensación; ¿ separación por cromatografía líquida del extracto de alcaloides totales sobre silicagel con mezclas de solventes orgánicos; ¿ aislamiento de la fracción cromatográfica impura rica en vindolina y catarantina; ¿ concentración hasta sequedad por evaporación a presión reducida; ¿ recuperación de solventes por condensación; ¿ síntesis de la anhidrovinblastina a partir de la vindolina y catarantina mediante la disolución de ambos en una solución acuosa ácida tamponada y agregado de una sal férrica, que cataliza la unión de la vindolina con la catarantina produciendo un compuesto intermediario iminio oxidado; ¿ reducción en del intermediario iminio oxidado a anhidrovinblastina, con borohidruro de sodio en solución de hidróxido de amonio; ¿ extracción de la anhidrovinblastina con unsolvente orgánico; ¿ concentración por evaporación del solvente orgánico a baja temperatura; ¿ recuperación de solventes por condensación; ¿ cristalización de la anhidrovinblastina desde metanol; ¿ filtrado y secado al vacío de la anhidrovinblas5 tina; ¿ reacción de la anhidrovinblastina y un agente halogenado a una temperatura baja entre -40 y y -80ºC con solvente orgánico, ácido orgánico y burbujeo de nitrógeno, obteniéndose un inter10 mediario halogenado de la anhidrovinblastina; ¿ reacción de este intermediario halogenado con tetrafluoroborato de plata en medio alcalinizado con acetato de amonio en agua y tetrahidrofurano para dar 5¿-nor-anhidrovinblastina; ¿ extracción con solvente orgánico no polar y concentración por evaporación; ¿ recuperación de solventes por condensación; ¿ purificación de 5¿-nor-anhidrovinblastina por cromatografía y cristalización hasta alcanzar una concentración mayor a 99%; ¿ recuperación de los solventes de elución cromatográfica por condensación de las fracciones evaporadas; ¿ formación de ditartrato de 5¿-nor-anhidrovinblastina caracterizado porque: dichas plantas de la familia de las Apocináceas frescas y húmedas o secadas a una temperatura inferior a 30ºC., dicha síntesis de la anhidrovinblastina se realiza con una fracción impura de una mezcla rica en vindolina y catarantina con un pH 2 por un periodo de entre 15 a 25 horas y no se produce vinblastina alguna, dicha anhidrovinblastina se almacena después de su síntesis en nitrógeno y a menos de -20ºC hasta su uso, dicha reacción de dicho intermedio halogenado con tetrafluoroborato es una reacción en tandem, dicha formación de 5¿-nor-anhidrovinblastine ditartrato consiste en la disolución de 5¿-nor-anhidro -vinblastina en bruto, con una pureza de más del 99% en etanol puro en una concentración de 0, 10 a 0, 20 mmol/ml y la adición de la cantidad equimolar de ácido tartárico y concentración hasta sequedad a presión reducida y en la oscuridad, o liofilización.
Description
Procedimiento para producir ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina a partir
de plantas de tipo Catharanthus.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento completo y a escala industrial de producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina a partir
de hojas y talluelos frescos de especies vegetales del género
Catharanthus. El mismo consiste en la extracción de los
alcaloides de este vegetal, a partir de los cuales se purifica una
mezcla de vindolina y catarantina que se hace reaccionar utilizando
catión férrico como catalizador para obtener anhidrovinblastina; la
misma se utiliza para sintetizar la
5'-nor-anhidrovinblastina, con la
que se prepara el ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina, un
alcaloide bisindólico de reconocido efecto antitumoral, empleado en
la quimioterapia del cáncer de pulmón, cáncer de mama, y enfermedad
de Hodgkin.
La vindolina
(3-metoxicarbonil-4-acetiloxi-6,7-didehidro-3-hidroxi-16-metoxi-1-metil-aspidospermidina,
PM: 456,54), es un alcaloide dihidroindólico de fórmula dada en la
Figura 1.
La catarantina
(18-metoxicarbonil-3,4-didehidro-ibogamina,
PM: 336,43) es un alcaloide indólico de fórmula dada en la Figura
2.
La anhidrovinblastina
(3',4'-didehidro-4'-desoxi-vinblastina,
PM:764,92) es un alcaloide bisindólico de fórmula dada en la Figura
3.
El ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina
(3',4'-didehidro-4'-desoxi-C5'-nor-vinblastina,
ditartrato, PM: 1079,13) es un alcaloide bisindólico de fórmula dada
en la Figura 4.
La
5'-nor-anhidrovinblastina es similar
en su estructura a la vinblastina. Difiere de la misma en que posee
un metileno menos en la mitad catarantina, y en la presencia del
doble enlace entre los carbonos 3' y 4' debido a la falta de una
molécula de agua. La
5'-nor-anhidrovinblastina es de
particular interés por sus propiedades antitumorales y su menor
neurotoxicidad comparada con la vinblastina, el ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina es la sal
utilizada para la administración clínica de la droga.
La vindolina y catarantina son de interés
farmoquímico ya que son la materia prima para la semisíntesis de la
anhidrovinblastina que se utiliza como materia prima para la
síntesis de alcaloides bisindólicos antitumorales como la
vinblastina y la
5'-nor-anhidrovinblastina, a su vez
la vinblastina se puede usar para sintetizar vincristina y
vindesina.
Los alcaloides diméricos naturales de la Vinca-
vinblastina y vincristina- son antimitóticos clínicos eficaces
poseyendo un mecanismo de acción caracterizado por el bloqueo del
ciclo celular en la fase M. Son usados para el tratamiento del mal
de Hodgkin y para el cáncer de ovario (Lhomme, C., Rev. Prat.
(France) 40, 1780-1781 (1990)). A pesar de su
efectividad se han registrado desventajas en su uso, tales como
resistencia cruzada (Maral, R., Bounut, C., Chenn, E. and Mathe, G.,
Cancer Chemother. Pharmacol. 5 (3), 197-199 (1981)),
y elevada toxicidad, particularmente neurotoxicidad (Binet, S.,
Chaineau, E., Fellous, A., Lataste, H., Krikorian, A., Couzinier,
J.P., Meininger, V., Int. J. Cancer 46, 262-266
(1990)).
Estas desventajas han estimulado investigaciones
y desarrollos tendientes a sintetizar análogos de estos alcaloides,
que conserven su efecto antimitótico y al mismo tiempo presenten
menor toxicidad.
Un gran número de productos derivados
semisintéticos han sido estudiados química y farmacológicamente, y
sólo algunos han llegado al estadio del estudio clínico [O. Van
Tellingen, J. H. M. Sips, J. H. Beijnen, A. Bult and W. J. Nooijen,
Anticancer Research, 12, 1699-1716 (1992)].
La
5'-nor-anhidrovinblastina es el más
importante de los análogos de la vinblastina. Este compuesto es de
gran interés pues ha exhibido una gran actividad antitumoral y baja
neurotoxicidad y menores efectos secundarios que la vinblastina y
la vincristina. Su efecto se basa en un fuerte poder inhibitorio de
la polimerización de la tubulina, lo cual conduce a la inhibición de
la formación del huso cromático que permite la migración de los
cromosomas en la anafase de la mitosis (Fellous, A., Ohayon, R.,
Vacassin, T., Binet, S., Lataste, H., Krikorian, A., Couzinier,
J.P., and Meininger, V., Semin. Oncol. 16,
9-14
(1989)).
(1989)).
Las condiciones de clima y suelo de la provincia
de Entre Ríos han mostrado ser adecuadas para un buen desarrollo del
cultivo de vegetales de la familia de las Apocináceas, en particular
del género Catharanthus, especialmente de las especies
Catharanthus roseus, Catharanthus ovalis y
Catharanthus longifolius, más específicamente de
Catharanthus roseus G. Don, antiguamente denominado Vinca
rosea Linn. ("Index Kewensis" Part IV, Claredon Press,
Oxford, England, 1895, pag.1203).
Por otra parte la cultura agropecuaria de la
Argentina, combinada con el desarrollo de las tecnologías
farmoquímicas, hacen prioritario el desarrollo de productos que,
partiendo de materias primas vegetales producidas localmente,
aumenten la agregación de valor a la economía nacional. En el Área
de Investigación y Desarrollo de Eriochem S.A., después de intensas
investigaciones y experimentación en su planta industrial se ha
logrado un nuevo procedimiento, objeto de la presente invención, que
permite, a escala industrial, partiendo de materia prima sembrada en
la provincia de Entre Ríos, llegar a sintetizar ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina, con una
pureza mayor al 99%, apta para su utilización en formulaciones
medicinales para uso humano.
El estado de la técnica es rico en bibliografía
referente a procesos parciales tales como los de extracción de
vindolina y catarantina referenciados en las patentes FR2544318,
US4172077 entre otras, que llegan a dichos alcaloides monoméricos
aislados y purificados. Otras citas tales como trabajos de Pierre
Potier (Synthesis of Catharanthus Alkaloids, "Journal of
Natural Products" V43,N1,jan-feb 1980), las
patentes US4279817, US4307100, US5047528, FR2544319 y sus familias
describen la síntesis del intermediario anhidrovinblastina a partir
de vindolina y catarantina puros o mezclas a través de la formación
del N-óxido de catarantina seguido de la reacción de Polonovsky
modificada. Otra vía de síntesis desarrollada por Mitsui
Petrochemical Ind. Ltd. parte de vindolina y catarantina puras y por
oxidación con el catión férrico llega a la anhidrovinblastina
(WO88/02002, EP354778).
En la patente US4307100 se reivindica la molécula
de 5'-nor-anhidrovinblastina siendo
el proceso utilizado el del N-óxido. Otras patentes tales como la
US5220016 llegan a la
5'-nor-anhidrovinblastina a partir
de un indol sintetizando cada grupo funcional, paso a paso, hasta
lograr la síntesis total de la molécula.
En el estado de la técnica no se encuentra
información sobre un proceso que parta de la especie vegetal
Catharanthus y llegue al ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina. Por otra
parte si se yuxtapone la información bibliográfica tanto científica
como de patentes se llega a procesos que van de la extracción del
vegetal ya molido hasta la
5'-nor-anhidrovinblastina base que
no insinúan el camino seguido en la síntesis propuesta en esta
patente.
Ante el desafío tecnológico de llegar a
sintetizar el ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina a partir
de los alcaloides extraídos de la especie vegetal Catharanthus
roseus se ha desarrollado un procedimiento que presenta las
siguientes características novedosas:
Se procesa el vegetal fresco de manera tal que
los alcaloides de interés sufran la menor degradación posible; se
utiliza una mezcla impura de vindolina y catarantina para la
síntesis de anhidrovinblastina por la vía del catalizador ion
férrico; se desarrolla un nuevo método de conservación de la
anhidrovinblastina; se realiza la purificación y reciclado de
solventes; se sintetiza la
5'-nor-anhidrovinblastina base en
tándem, sin aislar el intermediario bromado; se purifica la
5'-nor-anhidrovinblastina base por
cromatografía y cristalización; por último se desarrolla un método
de obtención del ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina que no
genera pérdidas de materia activa para obtener la pureza deseada. Lo
que resulta en un mayor rendimiento global, una disminución en los
tiempos de procesos, una disminución en los volúmenes de solventes
utilizados y una disminución de la cantidad de purificaciones al
resumir varias reacciones en pasos únicos de proceso. De tal manera
el nuevo proceso de producción es más económico y eficiente.
El procedimiento objeto de la presente invención,
puede dividirse en siete etapas principales, que se enumeran a
continuación:
- 1)
- molienda de material vegetal de Catharanthus no degradado
- 2)
- obtención de los alcaloides totales del vegetal de Catharanthus
- 3)
- obtención de la fracción cromatográfica de vindolina y catarantina
- 4)
- síntesis y purificación de anhidrovinblastina
- 5)
- síntesis de 5'-nor-anhidrovinblastina
- 6)
- purificación de 5'-nor-anhidrovinblastina base
- 7)
- preparación del ditartrato de 5'-nor-anhidrovinblastina
Más concretamente el procedimiento objeto de la
presente invención comprende los siguientes pasos de proceso:
- \bullet
- molienda del material vegetal de la familia de las Apocinaceas, con molino de cuchillas o de martillos;
- \bullet
- liberación de los alcaloides mediante extracción sólido-líquido de la especie vegetal molida, mediante un solvente orgánico soluble en agua;
- \bullet
- concentración del extracto a temperatura ambiente (de 20ºC a 30ºC) que elimina el solvente orgánico y evita la descomposición de la vindolina y la catarantina;
- \bullet
- recuperación de solvente por rectificación;
- \bullet
- dilución del extracto en una solución acuosa ácida;
- \bullet
- eliminación de impurezas y pigmentos del extracto vegetal mediante extracción líquido-líquido de la dilución acuosa ácida, con un solvente orgánico;
- \bullet
- recuperación de solvente por destilación;
- \bullet
- neutralización y o alcalinización de la fase acuosa ácida con una base inorgánica u orgánica;
- \bullet
- extracción líquido-líquido con un solvente orgánico, que extrae los alcaloides disueltos en agua;
- \bullet
- concentración por evaporación, a baja temperatura, del extracto de los alcaloides totales;
- \bullet
- recuperación de solventes por condensación;
- \bullet
- separación por cromatografía líquida del extracto de alcaloides totales sobre silicagel con mezclas de solventes orgánicos;
- \bullet
- aislamiento de la fracción cromatográfica impura rica en vindolina y catarantina;
- \bullet
- concentración hasta sequedad por evaporación a presión reducida;
- \bullet
- recuperación de solventes por condensación;
- \bullet
- síntesis de la anhidrovinblastina a partir de vindolina y catarantina mediante la disolución de ambos en una solución acuosa ácida tamponada y agregado de una sal férrica, que cataliza la unión de la vindolina con la catarantina produciendo un compuesto intermediario iminio oxidado;
- \bullet
- reducción en tándem del intermediario iminio oxidado a anhidrovinblastina, con borohidruro de sodio en solución de hidróxido de amonio;
- \bullet
- extracción de la anhidrovinblastina con un solvente orgánico;
- \bullet
- concentración por evaporación del solvente orgánico a baja temperatura;
- \bullet
- recuperación de solventes por condensación;
- \bullet
- cristalización de la anhidrovinblastina desde metanol;
- \bullet
- filtrado y secado al vacío de la anhidrovinblastina;
- \bullet
- reacción de la anhidrovinblastina y un agente halogenado a una temperatura baja entre -40ºC y -80ºC con solvente orgánico, ácido orgánico y burbujeo de nitrógeno, obteniéndose un intermediario halogenado de la anhidrovinblastina;
- \bullet
- reacción de este intermediario halogenado con tetrafluoroborato de plata en medio alcalinizado con acetato de amonio en agua y tetrahidrofurano para dar 5'-nor-anhidrovinblastina base;
- \bullet
- extracción con solvente orgánico no polar y concentración por evaporación;
- \bullet
- recuperación de solventes por condensación;
- \bullet
- purificación de 5'-nor-anhidrovinblastina por cromatografía y cristalización hasta concentración mayor a 99%;
- \bullet
- recuperación de los solventes de elución cromatográfica por condensación de las fracciones evaporadas;
- \bullet
- formación de ditartrato de 5'-nor-anhidrovinblastina con ácido tartárico en medio alcohólico o acuoso;
Los pasos detallados, según una realización
preferida, del nuevo proceso se describen precisamente a
continuación:
Se parte de un material vegetal de la familia de
las Apocynaceae, en particular del género
Catharanthus, especialmente de las especies Catharanthus
roseus, Catharanthus ovalis y Catharanthus
longifolius, más especialmente de Catharanthus roseus G.
Don, antiguamente denominado Vinca rosea Linn, rico en
alcaloides; en particular resultan de interés para el presente
proceso la vindolina y la catarantina. Se han desarrollado pruebas
de laboratorio que han arrojado como resultado la definición de las
partes del material vegetal que contienen vindolina y catarantina,
habiéndose determinado que sólo se hallan en cantidad apreciable en
las hojas y talluelos, durante todo el año, en forma independiente
de la floración del material. En tallos y raíces sólo se encuentra
vindolina y catarantina en cantidades menores que no justifican su
extracción.
La bibliografía citada menciona el secado
tradicional de la especie vegetal previo a la extracción de
vindolina y catarantina. Luego de diversos ensayos de laboratorio se
llegó a la conclusión que tanto el calor, como el tiempo afectan la
concentración de los alcaloides de interés en la Vinca rosea.
Por tal motivo se desarrollaron dos nuevos procedimientos
alternativos que resuelven el problema. En una primera alternativa
se parte de material fresco, húmedo. La molienda de material vegetal
fresco presenta inconvenientes que han sido resueltos utilizando un
molino de cuchillas, obteniéndose así un material vegetal altamente
disgregado y apto para las extracciones con solvente. La segunda
alternativa que se presenta es secar el material vegetal recién
cosechado a baja temperatura, menor a los 35ºC, preferiblemente
menor a 20ºC y entre 1 y 15 días, preferentemente menos de 7 días,
proceso que no afecta la concentración de alcaloides presentes en la
planta fresca especialmente de catarantina. De esta manera es
posible utilizar un molino de martillos o cuchillas.
Se obtiene el extracto total vegetal de
Catharanthus por medio de una extracción con solventes
miscibles con agua. Este método presenta ventajas con respecto a la
extracción con solventes inmiscibles, ya que no se requiere
pretratamiento con álcali para liberar los alcaloides presentes como
sales en la planta, al ser estos solubles en alcohol. La extracción
se realiza a temperatura ambiente (entre 20 y 30ºC) tres veces con
alcoholes alifáticos de 1 á 5 C o sus mezclas, pudiéndose utilizar
metanol, etanol, isopropanol, preferentemente metanol, durante un
tiempo que va entre 30 min. y 40 hs. cada vez. Los extractos se
concentran a presión reducida, a temperatura menor de 30ºC en un
evaporador tubular de película ascendente. Los solventes se
recuperan por condensación, procediéndose a una rectificación para
recuperar el alcohol, separándolo del agua e impurezas. Luego de los
análisis correspondientes vuelve al mismo paso del proceso.
Al concentrado, compuesto principalmente por agua
proveniente del mismo material vegetal verde, se le agrega un ácido
inorgánico que puede ser ácido sulfúrico 1 N, ácido clorhídrico 1 N,
y se extrae con un solvente orgánico no polar que puede ser cloruro
de metileno, cloroformo, dicloroetano, hexano, éter de petróleo
(40-60º), éter isopropílico, acetato de etilo,
preferentemente cloruro de metileno. Se realizan tres extracciones
consecutivas para eliminar clorofila y otros pigmentos. La fase
orgánica con estos pigmentos se destila recuperando el solvente que
luego de ser analizado vuelve al proceso. La fase acuosa se
alcaliniza con hidróxido de amonio concentrado, o con hidróxido de
sodio 1 N, preferentemente hidróxido de amonio concentrado, hasta un
pH entre 7.5 y 9; se satura con sal inorgánica que puede ser cloruro
de sodio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, preferentemente
cloruro de sodio.
Se extrae con solvente orgánico no polar, tal
como cloruro de metileno, cloroformo, dicloroetano, hexano, éter de
petróleo (40-60º), éter isopropílico, acetato de
etilo, preferentemente cloruro de metileno; la extracción se realiza
tres veces, y los extractos reunidos se concentran a presión
reducida en evaporador rotatorio hasta sequedad, con una temperatura
de baño igual o inferior a 40ºC. Los solventes se condensan y
vuelven a ser utilizados en el mismo paso de proceso.
Se obtiene un crudo de alcaloides totales con un
rendimiento másico respecto al material fresco del 0,05 al 0,3%,
generalmente del 0,15 al 0,25%, los cuales se cromatografían en una
columna de silicagel 60 de 63 a 37 micrones (mm)
(230-400 mesh ASTM), eluyendo con una mezcla de
cloruro de metileno-acetato de etilo 80:20. Se
recogen las distintas fracciones; y se seleccionan las fracciones
más ricas en la mezcla de vindolina y catarantina (se controlan las
fracciones por cromatografía sobre capa delgada usando cromatofolios
de silicagel Merck, y como solvente de desarrollo: cloruro de
metileno-acetona-metanol 92:5:3).
Las fracciones separadas se evaporan a presión reducida en
evaporador rotatorio, obteniéndose una mezcla rica en vindolina y
catarantina que contiene entre 40 y 80% de la mezcla de vindolina y
catarantina en relación molar 1:1 hasta 1,5:1 generalmente 1,1:1 a
1,3:1 tal como se extrae del vegetal. Esto equivale a un rendimiento
másico de 5 al 20% de los alcaloides totales, particularmente entre
el 7 y el 12%. Por otra parte los solventes de elución
cromatográfica se rectifican, analizan, se corrige la relación de
concentraciones necesaria y se utilizan nuevamente en el proceso de
cromatografía.
A continuación se procede a la síntesis de
anhidrovinblastina con la mezcla impura de vindolina y catarantina
por la vía del catión férrico como catalizador. El hecho de trabajar
con una fracción impura evita la costosa separación y purificación
de cada uno de estos dos alcaloides, disminuyendo la cantidad de
solventes y de silicagel necesarios, obteniéndose rendimientos de
reacción del 70%, acordes con los referidos en la bibliografía ya
citada, y coincidentes con los obtenidos en los laboratorios de
Eriochem S.A. a partir de vindolina y catarantina purificadas. Una
vez concluida la reacción de obtención de anhidrovinblastina, este
alcaloide dimérico es aislado y purificado de la misma forma, tanto
si se partió de los monómeros purificados como si se partió de una
mezcla cuyo tenor de alcaloides deseados oscile entre el 40 y el
100%. Este paso del nuevo procedimiento no se sugiere ni se hace
obvio del estado actual del arte.
La síntesis de anhidrovinblastina se lleva a cabo
en un reactor de vidrio, en medio acuoso. La obtención de
anhidrovinblastina se ve favorecida a pH 2 o inferior, ya que a
mayor pH aumenta la formación de vinblastina. El medio puede
obtenerse utilizando un ácido mineral en concentraciones menores al
1%, de forma de obtener el pH adecuado. Puede usarse ácido
clorhídrico o sulfúrico. También puede utilizarse un tampón como
glicina o citrato. Preferentemente se utiliza un buffer de glicina,
cloruro de sodio y ácido clorhídrico, a pH 2.
La reacción se lleva a cabo a una temperatura
entre los 10ºC y los 25ºC, la mezcla se burbujea con nitrógeno u
otro gas inerte, como argón, y esta condición se mantiene durante la
reacción a fin de evitar que por oxidación se formen otros
alcaloides indeseados como vinblastina, catarina, leurosina,
etc.
Se agrega a este buffer el catalizador férrico
que puede ser cloruro férrico, sulfato férrico, nitrato férrico, en
particular cloruro férrico hexahidrato.
El catalizador se agrega en relación 5:1 molar
con respecto a catarantina.
Se agrega la fracción cromatográfica rica en
vindolina y catarantina manteniendo la agitación y el burbujeo de
nitrógeno, durante un período de tiempo que va entre 15 y 25 horas,
durante las cuales se forma un intermediario iminio. Dicho
intermediario es transformado en anhidrovinblastina mediante el
agregado, al mismo medio de reacción, de un agente reductor,
especialmente borohidruro de sodio, en medio alcalino,
preferentemente hidróxido de amonio concentrado a temperatura
ambiente y se deja reaccionar entre 10 y 60 minutos preferiblemente
entre 10 y 15 min.
Para aislar la anhidrovinblastina, la mezcla se
extrae con solvente orgánico no polar que puede ser acetato de
etilo, éter etílico, preferentemente cloruro de metileno. Después de
cuatro extracciones, la fase orgánica se filtra por un lecho
filtrante como Celite a fin de separar el hierro, y se concentra a
presión reducida. El residuo se diluye con cloruro de metileno o
algún solvente orgánico tal como acetato de etilo, éter etílico,
preferentemente cloruro de metileno, y se trata con carbón
activado.
La solución decolorada se concentra a presión
reducida. Por un lado, el solvente se condensa y luego de analizar
se reutiliza en el proceso, y por otro el residuo de la evaporación
se disuelve en un alcohol alifático de menos de 4 C, preferentemente
metanol o etanol, especialmente metanol, a temperatura ambiente y se
mantiene a entre 4 y 8ºC durante 7 a 18 horas. El precipitado se
filtra, se lava con metanol frío y se seca al vacío.
Los rendimientos en anhidrovinblastina son del
50% al 85% particularmente entre 65 y 75%, dependiendo de las
condiciones utilizadas entre las anteriormente mencionadas.
En el estado de la técnica se encuentran
referencias a la inestabilidad y a la necesidad de la utilización
inmediata de la anhidrovinblastina. Se ha experimentado con éxito un
método que resulta parte de este nuevo proceso que permite conservar
este alcaloide en perfectas condiciones por más de tres meses, este
paso se realiza en atmósfera de nitrógeno a una temperatura entre
-15ºC y -80ºC, especialmente a -20ºC. Esto permite establecer una
planificación de producción que baja los costos globales por la
óptima utilización de los equipos de planta.
La anhidrovinblastina se hace reaccionar con un
agente de halogenación para dar un intermediario halogenado en
posición 7'. Varios agentes de halogenación pueden ser usados, como
el clorobenzotriazol, N-clorosuccinimida, o
N-cloroacetamida, preferentemente
N-bromosuccinimida, que forma específicamente la
7'-bromoindolenina de la anhidrovinblastina como
intermediario tal como se presenta en la Figura 5.
Las proporciones estequiométricas de los
reactantes pueden estar entre 0,8:1 y 1,3:1, preferentemente entre
1:1 y 1,15:1 (agente halogenante a anhidrovinblastina), y la
reacción se ve favorecida por la presencia de 1 a 2 equivalentes de
ácido trifluoroacético.
La reacción se lleva a cabo en atmósfera inerte
(nitrógeno o argón), a bajas temperaturas, -80ºC á -40ºC,
preferentemente entre -50ºC y -65ºC. Dichas condiciones deben
mantenerse durante toda la reacción a partir del agregado de todos
los reactivos, durante un tiempo de 1 a 4 horas, preferiblemente 2
horas.
En el estado de la técnica, tanto en el trabajo
Françoise Gueritte, Composés antitumoraux du grupe de la
vinblastine: dérivés de la nor-5'
anhydrovinblastine (Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.
1983-18 n5 pp419-424), como en la
patente estadounidense Nº 4.307.100, el derivado halogenado obtenido
de esta forma se aísla por extracción con solventes luego de
neutralización del medio de reacción con hidróxido de sodio u otra
base similar.
En este nuevo procedimiento, la transformación
del intermediario bromado en
5'-nor-anhidrovinblastina se realiza
en tándem con la bromación, mediante el agregado al mismo medio de
reacción, luego de neutralizar con acetato de amonio, de
tetrafluoroborato de plata en medio acuoso, o mezclas de agua y un
solvente orgánico como tetrahidrofurano. Luego del agregado de
tetrafluoroborato de plata, la mezcla se deja reaccionar a
temperatura ambiente durante 2 á 18 horas, preferentemente de 3 á 5
hs., y luego se alcaliniza con bicarbonato de sodio, o acetato de
sodio. El producto se extrae de la fase acuosa con solvente orgánico
no polar, preferentemente cloruro de metileno. Con este
procedimiento se evita el aislamiento de la
7'-bromoindolenina de la anhidrovinblastina, un
intermediario que es poco estable, con el consiguiente aumento del
rendimiento, permitiendo obtener este compuesto en escala industrial
y económicamente viable.
Los extractos reunidos se secan sobre sulfato de
sodio anhidro, se filtran y el solvente se evapora a presión
reducida, se condensa y reutiliza. El rendimiento de la reacción
esta comprendido entre 10 y 60%, generalmente entre el 25 y 40%.
A continuación, la
5'-nor-anhidrovinblastina cruda se
purifica por cromatografía en columna tipo flash, utilizando como
soporte gel de sílice, de granulometría de 63 a 37 micrones (mm)
(230-400 mesh ASTM) y eluyendo con mezclas de
acetona y metanol en relaciones que van de 100:0 a 80:20,
preferentemente en relación azeotrópica (aprox. 88:12), lo que
permite recuperar la mezcla sencillamente por condensación luego de
la concentración de la
5'-nor-anhidrovinblastina.
La composición de las fracciones se controla por
cromatografía en capa delgada (cromatofolios silicagel Merck,
solvente de desarrollo: cloruro de
metileno-hexano-metanol 50:40:10,
detección a 254nm).
Luego de la cromatografía en columna tipo flash
se evapora el solvente obteniendo un producto rico en
5'-nor-anhidrovinblastina. Para las
fracciones que contienen otros componentes además del producto, se
requiere una segunda cromatografía, en las mismas condiciones que la
primera.
Las fracciones que contienen la
5'-nor-anhidrovinblastina como única
mancha en cromatografía en capa delgada, se concentran a presión
reducida y el residuo se recristaliza de metanol, disolviendo a
temperatura entre 10 y 60ºC, más particularmente entre 20 y 30ºC, y
dejando cristalizar a bajas temperaturas, entre 5ºC y –30ºC,
preferiblemente entre 2 y -20ºC, se filtra y seca. La pureza del
material se determina por HPLC, siendo superior a 99%.
Este material es
5'-nor-anhidrovinblastina en forma
de base. La forma utilizada para obtener la forma farmacéutica
terminada es el ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina.
Es conocido que la manera corriente de purificar
sales como un tartrato de alcaloides es por medio de una disolución
en alcohol anhidro y cristalización, favoreciendo la precipitación
por el agregado de hexano o éter etílico. En los laboratorios de
Eriochem S. A. se ha comprobado que en particular el ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina no
presenta una forma cristalina, sino que precipita como un material
amorfo, por lo que el procedimiento usual conduce a pérdidas de
materia activa en el líquido madre y sin provocar una mejora
sustancial en la calidad del material.
Luego de experimentar diversas maneras de formar
y purificar el ditartrato se llegó al presente procedimiento en el
que se disuelve
5'-nor-anhidrovinblastina base, de
pureza mayor de 99% (HPLC), en etanol absoluto, en una concentración
entre 0,10 y 0,20 mmol/ml, preferiblemente 0,15 a 0,19 mmol/ml, y se
agrega la cantidad equimolar de ácido tartárico, a temperatura
ambiente, entre 10 y 50ºC, preferentemente entre 20 y 30ºC. La
mezcla se concentra a sequedad a presión reducida. El sólido blanco
amorfo se seca al vacío a 666 Pa (5 mmHg) o menor, entre 20ºC y
50ºC, en la oscuridad, hasta peso constante. Se obtiene
cuantitativamente ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina.
Alternativamente, el ditartrato puede prepararse
en medio acuoso, por liofilización de una solución de concentración
entre el 2 y el 10% de
5'-nor-anhidrovinblastina
ditartrato, preparada por disolución de la cantidad necesaria de
ácido tartárico y agregado de la
5'-nor-anhidrovinblastina base
correspondiente, entre 10 y 30ºC.
Dicho material es apto para la preparación de una
forma farmacéutica terminada. La pureza del material, determinada
por HPLC, es superior a 99%, y su título determinado por titulación
de alcaloides totales por volumetría no acuosa y corregido por la
pérdida de peso por secado es del orden del 100%.
El análisis del ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina se realiza
con un HPLC Waters con detector de arreglos de diodos modelo 996
(PDA) y bomba modelo 515. Se utiliza columna C-18
250 mm x 4 mm L1 (5 \mu), y se realiza detección a 269 nm. La fase
móvil se compone de solución buffer de pH 7,25 (cloruro de sodio,
acetato de amonio, cetiltrimetilamonio bromuro) y acetonitrilo en
relación 60:40.
Cabe destacar que no se han hallado en el estado
actual de la técnica referencias a procedimientos para producir
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina a partir
de 5'-nor-anhidrovinblastina base,
además las dos alternativas propuestas logran un máximo rendimiento
sin pérdidas de materia activa en su preparación.
40 kg de hojas y talluelos de material vegetal
fresco de plantas de Catharanthus roseus, molido en un molino
tipo martillo, se extraen a temperatura ambiente (20 á 30ºC) tres
veces con metanol, con 60 litros durante 24 horas cada vez. Los
extractos se concentran a presión reducida, a temperatura menor de
30ºC, hasta un volumen de 20 litros. El metanol recuperado se
rectifica para separarlo del agua y vuelve al proceso. Al
concentrado, compuesto principalmente por agua (del mismo material
vegetal), se le agregan 20 litros de ácido sulfúrico 1 N, y se
extrae con cloruro de metileno tres veces con 6 litros cada vez para
eliminar clorofila y otros pigmentos. El cloruro de metileno se
evapora, recuperándose por condensación para reutilizarlo. La fase
acuosa se alcaliniza con hidróxido de amonio concentrado hasta pH
8,5, se satura con cloruro de sodio, se extrae con cloruro de
metileno tres veces con 6 litros cada vez, y los extractos se
concentran a presión reducida hasta sequedad. El cloruro de metileno
se recupera por condensación para ser reutilizado. Se obtienen 75
gramos de un crudo de alcaloides totales, los cuales se
cromatografían en una columna cargada con 500 g de silicagel 60 de
63 a 37 micrones (mm) (230-400 mesh ASTM), eluyendo
con cloruro de metileno-acetato de etilo 80:20. Se
recogen fracciones de 600 ml; las fracciones 3-5
contienen la mezcla de vindolina y catarantina (se controlan las
fracciones por cromatografía sobre capa delgada en cromatofolios
silicagel Merck, utilizando como solvente de desarrollo la mezcla
cloruro de metileno-acetona-metanol
92:5:3 o Acetato de etilo). Las fracciones separadas se evaporan a
presión reducida, obteniéndose 13,6 gramos de mezcla rica en
vindolina y catarantina, cuyo contenido másico real es de 32,5% de
vindolina y 22,5% de catarantina medidos por HPLC. Se realiza una
rectificación para recuperar los solventes y reutilizarlos previa
validación analítica.
En un reactor de vidrio, se disuelven 4,25 g de
glicina y 3,33 g de cloruro de sodio en 540 ml de agua y 525 ml de
HCl 0,1 N a temperatura ambiente, y la mezcla se burbujea con
nitrógeno. Se agrega a este buffer 31,85 g de cloruro férrico
hexahidratado mientras se agita a temperatura ambiente con burbujeo
de nitrógeno. Se agregan 21 g de la fracción cromatográfica rica en
vindolina y catarantina que contiene alrededor de 55% de la mezcla
vindolina:catarantina en relación molar aproximada 1,1: 1
manteniendo la agitación y el burbujeo de nitrógeno, durante 20
horas. A la solución formada, se le agrega lentamente una mezcla de
1,05 g de borohidruro de sodio en 125 ml de hidróxido de amonio
concentrado a temperatura ambiente y se deja reaccionar 20 minutos.
La mezcla se extrae con cloruro de metileno (4 x 400 ml), el
extracto se filtra por Celite (100 g), y se concentra a presión
reducida. Mientras el solvente se recupera por condensación para
volver a la extracción, el residuo se diluye con 75 ml de cloruro de
metileno, y se filtra por lecho de carbón activado (7 g). La
solución decolorada se concentra a presión reducida. El residuo de
la evaporación se disuelve en 15 ml de metanol a temperatura
ambiente y se mantiene entre 2 y 4ºC durante 12 horas. El
precipitado se filtra, se lava con metanol frío (10 ml) y se seca al
vacío. Se obtienen 7,35 g de anhidrovinblastina.
En un reactor de vidrio, equipado con agitación
magnética, entrada de nitrógeno, y ampolla de agregado, se colocan
10,1 g de anhidrovinblastina. El reactor se coloca en un baño a
-60ºC. Desde la ampolla se agrega lentamente una solución
conteniendo 2,5 g de N-bromosuccinimida, 40 ml de
cloruro de metileno y 1,39 ml de ácido trifluoroacético, con
burbujeo de nitrógeno. La mezcla se agita 2 horas a -60ºC con
burbujeo de nitrógeno. Luego de ese tiempo, el reactor se retira del
baño, se detiene el burbujeo de nitrógeno, se agrega una solución de
2,61 g de acetato de amonio en 10,1 ml de agua y se agrega una
solución de 2,72 g de tetrafluoroborato de plata en 15,7 ml de
tetrahidrofurano y 15,7 ml de agua. Después de 18 hs a 20ºC se
agregan 80 ml de bicarbonato de sodio 10%, se separa la fase
orgánica, y la fase acuosa se extrae con nuevamente con cloruro de
metileno (3 x 50 ml). Los extractos reunidos se secan sobre sulfato
de sodio anhidro, se filtran, y el solvente se evapora a presión
reducida, se condensa y reutiliza.
El producto crudo de la reacción se purifica por
cromatografía en columna, utilizando 500 g de silicagel 60 de 63 a
37 micrones (230-400 mesh ASTM) en una columna de 10
cm de diámetro, y eluyendo con gradientes de acetona hasta
acetona-metanol en relación azeotrópica, lo que
permite recuperar la mezcla sencillamente por condensación luego de
la concentración de la
5'-nor-anhidrovinblastina.
La composición de las fracciones se controla por
cromatografía en capa delgada (cromatofolios silicagel Merck,
solvente de desarrollo: cloruro de
metileno-hexano-metanol 50:40:10).
Las fracciones que contienen la
5'-nor-anhidrovinblastina como
componente mayoritario, controlado por cromatografía en capa
delgada, se concentran a presión reducida y el residuo se
recromatografía. La totalidad de las fracciones que contienen la
5'-nor-anhidrovinblastina como única
mancha, se concentran a presión reducida y el residuo se
recristaliza de metanol, disolviendo a temperatura ambiente (25 á
30ºC) y dejando cristalizar a -20ºC, se filtra y seca. La pureza
del material se determina por HPLC, siendo superior a 99%. Se
obtienen 3,15 g de
5'-nor-anhidrovinblastina base.
En un reactor de vidrio se disuelven 2,83 g de
5'-nor-anhidrovinblastina base, de
pureza mayor de 99% (HPLC), en 14 ml de etanol absoluto, y se
agregan 1,089 g de ácido tartárico (cantidad equimolar), a
temperatura ambiente.
La mezcla se concentra a sequedad a presión
reducida. El sólido blanco amorfo se seca al vacío a 666 Pa (5
mmHg), a 40ºC, en la oscuridad, hasta peso constante. Se obtiene
cuantitativamente ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina: 3,92 g.
La pureza del material se determina por HPLC, siendo superior a 99%,
y su título determinado por volumetría no acuosa y corregido por la
pérdida de peso por secado es del orden del 100%.
El rendimiento molar global de la síntesis a
partir de catarantina alcanza un 20% y un rendimiento másico
aproximado de 50 ppm de ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina de una
pureza mayor o igual al 99% respecto del material vegetal fresco de
Catharanthus roseus.
Claims (12)
1. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina a partir
de especies vegetales del género Catharanthus que comprende
los siguientes pasos de proceso:
- \bullet
- molienda de plantas de la familia de las Apocináceas, con molino de cuchillas o de martillos;
- \bullet
- liberación de los alcaloides mediante extracción sólido-líquido de la especie vegetal molida, mediante un solvente orgánico soluble en agua;
- \bullet
- concentración del extracto a temperatura ambiente (de 20ºC a 30ºC) que elimina el solvente orgánico y evita la descomposición de la vindolina y la catarantina;
- \bullet
- recuperación de solvente por rectificación;
- \bullet
- dilución del extracto en una solución acuosa ácida;
- \bullet
- eliminación de impurezas y pigmentos del extracto vegetal mediante extracción líquido-líquido de la dilución acuosa ácida, con un solvente orgánico;
- \bullet
- recuperación de solvente por destilación;
- \bullet
- neutralización y o alcalinización de la fase acuosa ácida con una base inorgánica u orgánica;
- \bullet
- extracción líquido-líquido con un solvente orgánico, que extrae los alcaloides disueltos en agua;
- \bullet
- concentración por evaporación, a temperatura inferior a 30ºC, del extracto de los alcaloides totales;
- \bullet
- recuperación de solventes por condensación;
- \bullet
- separación por cromatografía líquida del extracto de alcaloides totales sobre silicagel con mezclas de solventes orgánicos;
- \bullet
- aislamiento de la fracción cromatográfica impura rica en vindolina y catarantina;
- \bullet
- concentración hasta sequedad por evaporación a presión reducida;
- \bullet
- recuperación de solventes por condensación;
- \bullet
- síntesis de la anhidrovinblastina a partir de la vindolina y catarantina mediante la disolución de ambos en una solución acuosa ácida tamponada y agregado de una sal férrica, que cataliza la unión de la vindolina con la catarantina produciendo un compuesto intermediario iminio oxidado;
- \bullet
- reducción en del intermediario iminio oxidado a anhidrovinblastina, con borohidruro de sodio en solución de hidróxido de amonio;
- \bullet
- extracción de la anhidrovinblastina con un solvente orgánico;
- \bullet
- concentración por evaporación del solvente orgánico a baja temperatura;
- \bullet
- recuperación de solventes por condensación;
- \bullet
- cristalización de la anhidrovinblastina desde metanol;
- \bullet
- filtrado y secado al vacío de la anhidrovinblastina;
- \bullet
- reacción de la anhidrovinblastina y un agente halogenado a una temperatura baja entre -40 y -80ºC con solvente orgánico, ácido orgánico y burbujeo de nitrógeno, obteniéndose un intermediario halogenado de la anhidrovinblastina;
- \bullet
- reacción de este intermediario halogenado con tetrafluoroborato de plata en medio alcalinizado con acetato de amonio en agua y tetrahidrofurano para dar 5'-nor-anhidrovinblastina;
- \bullet
- extracción con solvente orgánico no polar y concentración por evaporación;
- \bullet
- recuperación de solventes por condensación;
- \bullet
- purificación de 5'-nor-anhidrovinblastina por cromatografía y cristalización hasta alcanzar una concentración mayor a 99%;
- \bullet
- recuperación de los solventes de elución cromatográfica por condensación de las fracciones evaporadas;
- \bullet
- formación de ditartrato de 5'-nor-anhidrovinblastina
caracterizado porque:
dichas plantas de la familia de las Apocináceas
frescas y húmedas o secadas a una temperatura inferior a 30ºC.,
dicha síntesis de la anhidrovinblastina se
realiza con una fracción impura de una mezcla rica en vindolina y
catarantina con un pH 2 por un periodo de entre 15 a 25 horas y no
se produce vinblastina alguna,
dicha anhidrovinblastina se almacena después de
su síntesis en nitrógeno y a menos de -20ºC hasta su uso,
dicha reacción de dicho intermedio halogenado con
tetrafluoroborato es una reacción en tandem,
dicha formación de
5'-nor-anhidrovinblastine ditartrato
consiste en la disolución de
5'-nor-anhidrovinblastina en bruto,
con una pureza de más del 99% en etanol puro en una concentración de
0,10 a 0,20 mmol/ml y la adición de la cantidad equimolar de ácido
tartárico y concentración hasta sequedad a presión reducida y en la
oscuridad, o liofilización.
2. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina como el de
la reivindicación 1 caracterizado porque se usa material
vegetal fresco y húmedo, particularmente las hojas y talluelos
molidos.
3. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina como el de
la reivindicación 1 caracterizado porque se usa material
vegetal secado a temperaturas de menos de 20ºC y durante un período
menor a los 15 días y se muele.
4. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina como el de
la reivindicación 1 caracterizado porque la separación por
cromatografía líquida del extracto de alcaloides totales sobre
silicagel con mezclas de solventes orgánicos es con cloruro de
metileno y acetato de etilo.
5. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina como el de
la reivindicación 1 caracterizado porque la síntesis de
anhidrovinblastina por la vía de catalizador ion férrico se realiza
a partir de vindolina y catarantina en forma conjunta como fracción
impura, tal como resultan de la purificación por cromatografía flash
del extracto de alcaloides totales, sin que hallan sido separadas la
una de la otra y en un rango de concentración de entre el 40 y el
80% del extracto impuro de catarantina y vindolina.
6. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina como el de
la reivindicación 1 caracterizado porque se recuperan los
solventes utilizados en las distintas etapas del proceso para ser
reutilizados en las mismas.
7. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina como el de
la reivindicación 1 caracterizado porque la reacción de la
anhidrovinblastina y un agente halogenado es con
N-bromosuccinamida a una temperatura baja entre -40
y -80ºC con solvente orgánico, ácido orgánico y burbujeo de
nitrógeno, obteniéndose un intermediario halogenado bromo -7
indolenina de la anhidrovinblastina.
8. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina como el de
la reivindicación 1 caracterizado porque la reacción del
intermediario de la 7'-bromoindolenina de la
anhidrovinblastina para llegar a la
5'-nor-anhidrovinblastina se realiza
en tandem con la bromación, mediante el agregado al mismo medio de
reacción, luego de neutralizar con acetato de amonio, de
tetrafluoroborato de plata en medio acuoso, o mezclas de agua y un
solvente orgánico como tetrahidrofurano o acetato de etilo, sin
aislar el intermediario.
9. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina como el de
la reivindicación 1 caracterizado porque la
5'-nor-anhidrovinblastina base se
purifica por cromatografía líquida con columna tipo flash con
silicagel y eluída con mezclas de acetona - metanol y por
cristalización de metanol a temperaturas entre 2ºC y -20ºC.
10. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina como el de
la reivindicación 1 caracterizado porque la formación del
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina a partir
de 5'-nor-anhidrovinblastina base y
el ácido tartárico se realiza en medio alcohólico absoluto, se
concentra por evaporación a presión reducida y se seca en
oscuridad.
11. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina como el de
la reivindicación 1 caracterizado porque la formación del
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina a partir
de 5'-nor-anhidrovinblastina base y
ácido tartárico se realiza en medio acuoso y se liofiliza.
12. Un procedimiento para la producción de
ditartrato de
5'-nor-anhidrovinblastina como el de
la reivindicación 1 caracterizado porque la
anhidrovinblastina se almacena bajo atmósfera inerte de nitrógeno o
argón y entre -15ºC y -80ºC, más especialmente a -20ºC durante mas
de tres meses, sin que se aprecie degradación por cromatografía en
capa delgada.
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