FI91639B - Alkaloidien uutto - Google Patents
Alkaloidien uutto Download PDFInfo
- Publication number
- FI91639B FI91639B FI886053A FI886053A FI91639B FI 91639 B FI91639 B FI 91639B FI 886053 A FI886053 A FI 886053A FI 886053 A FI886053 A FI 886053A FI 91639 B FI91639 B FI 91639B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- avlb
- tissue
- component
- extraction
- soluble component
- Prior art date
Links
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims description 41
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 title claims description 23
- FFRFGVHNKJYNOV-DOVUUNBWSA-N 3',4'-Anhydrovinblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C=C(C2)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 FFRFGVHNKJYNOV-DOVUUNBWSA-N 0.000 claims description 78
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 43
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 20
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 20
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 18
- 240000001829 Catharanthus roseus Species 0.000 claims description 16
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 14
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 11
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims description 11
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 5
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 claims 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 229910052787 antimony Inorganic materials 0.000 claims 1
- WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N antimony atom Chemical compound [Sb] WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 claims 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 33
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 13
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- GKWYINOZGDHWRA-UHFFFAOYSA-N catharanthine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2C(=O)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 GKWYINOZGDHWRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WVTGEXAIVZDLCR-UHFFFAOYSA-N Vindoline Natural products CC1C2CN3CCCC14CCC5Nc6ccccc6C25C34 WVTGEXAIVZDLCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- CXBGOBGJHGGWIE-IYJDUVQVSA-N vindoline Chemical compound CN([C@H]1[C@](O)([C@@H]2OC(C)=O)C(=O)OC)C3=CC(OC)=CC=C3[C@]11CCN3CC=C[C@]2(CC)[C@@H]13 CXBGOBGJHGGWIE-IYJDUVQVSA-N 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CMKFQVZJOWHHDV-DYHNYNMBSA-N catharanthine Chemical compound C([C@@H]1C=C([C@@H]2[C@@]3(C1)C(=O)OC)CC)N2CCC1=C3NC2=CC=CC=C12 CMKFQVZJOWHHDV-DYHNYNMBSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 6
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 5
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 5
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229950001104 anhydrovinblastine Drugs 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 108010081495 driselase Proteins 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 3
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 3
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 2
- LPGWZGMPDKDHEP-HLTPFJCJSA-N Leurosine Chemical compound C([C@]1([C@@H]2O1)CC)N(CCC=1C3=CC=CC=C3NC=11)C[C@H]2C[C@]1(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC LPGWZGMPDKDHEP-HLTPFJCJSA-N 0.000 description 2
- LPGWZGMPDKDHEP-GKWAKPNHSA-N Leurosine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@]6(CC)O[C@@H]6[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C LPGWZGMPDKDHEP-GKWAKPNHSA-N 0.000 description 2
- XADCESSVHJOZHK-UHFFFAOYSA-N Meperidine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(C(=O)OCC)CCN(C)CC1 XADCESSVHJOZHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- SASWULSUPROHRT-MCIGMTSASA-N Vindorosine Natural products CN([C@H]1[C@](O)([C@@H]2OC(C)=O)C(=O)OC)C3=CC=CC=C3[C@@]11CCN3CC=C[C@]2(CC)[C@@H]13 SASWULSUPROHRT-MCIGMTSASA-N 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012746 preparative thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 2
- CXBGOBGJHGGWIE-ACSXSLCXSA-N vindoline Chemical compound CN([C@H]1[C@](O)([C@@H]2OC(C)=O)C(=O)OC)C3=CC(OC)=CC=C3[C@@]11CCN3CC=C[C@]2(CC)[C@@H]13 CXBGOBGJHGGWIE-ACSXSLCXSA-N 0.000 description 2
- 235000020138 yakult Nutrition 0.000 description 2
- GIXIBLNEKTZVGO-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropan-2-amine;phosphoric acid Chemical compound CC(C)(C)N.CC(C)(C)N.CC(C)(C)N.OP(O)(O)=O GIXIBLNEKTZVGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710081650 Beta-glucosidase 10 Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000013066 combination product Substances 0.000 description 1
- 229940127555 combination product Drugs 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 238000012924 normal-phase thin-layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N p-menthan-3-ol Chemical compound CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 peptinase Proteins 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000010956 selective crystallization Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- OKJMLYFJRFYBPS-UHFFFAOYSA-J tetraazanium;cerium(4+);tetrasulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[Ce+4].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O OKJMLYFJRFYBPS-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
- C07D519/04—Dimeric indole alkaloids, e.g. vincaleucoblastine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Extraction Or Liquid Replacement (AREA)
Description
91639
Alkaloidien uutto Tämä keksintö koskee alkaloideja, joita Catharanthus roseus-kasvi tuottaa.
Ne pienet määrät vinblastiinia ja vinkristiiniä, joita Catharanthus roseus luonnossa tuottaa, ovat saaneet tutkijat tutkimaan mahdollisuutta käyttää in vitro -tekniikkaa näiden farmaseuttisesti aktiivisten yhdisteiden valmistukseen.
Eri aloilla suoritetun tutkimuksen tuloksena tiedetään nykyään yleisesti, että monomeeriset alkaloidit katarantiini ja vin-doliini ovat ne komponentit, jotka in vivo yhtyvät muodostaen välituotteena 3',4'-anhydrovinblastiini-yhdistettä , joka lopuksi konvertoidaan vinblastiinin muodostamiseksi. Vinkris-tiini puolestaan muodostetaan vinblastiinistä. Kokonaisreak-tiokaavio voidaan näin ollen esittää seuraavasti: vindoliini + katarantiini 3',4'-anhydrovinblastiini vinblastiini vinkristiini
Jotta vinblastiinin ja vinkristiinin taloudellinen in vitro-tuotanto olisi mahdollista, 3',4'-anhydrovinblastiinin (jäljempänä käytetään nimitystä AVLB) tehokas tuotanto on välttämätön. Tämä keksintö koskee tämän vuoksi menetelmää AVLB:n talteenottamiseksi erityisesti sen käyttämiseksi in vitrome-netelmien soveltamisessa arvokkaampien dimeeristen alkaloidien, vinblastiinin ja vinkristiinin tuottamiseksi.
CA-patentissa 1 094 552, julkaistu 27. tammikuuta 1981, kuvataan menetelmiä vindoliinin, katarantiinin ja AVLB:n eristämiseksi, jossa menetelmässä uutetaan kuivattuja lehtiä orgaanisella liuottimena, kuten metanolilla tai tolueenilla tai niiden seoksella ja hapon vesiliuoksella, puhdistetaan uute 2 91639 käyttäen faasmvaihtomenetelmää ja saostetaan sitten sulfaatti 1isäykse11ä. Tämän jälkeen yksittäisiä alkaloideja tai niiden ryhmiä eristetään emäliuoksesta käyttäen kromatografiaa, 1iuotingradientteja ja/tai pH-eroja.
Julkaisussa Physiol. Veg., 1985, 23(4), 381-388, Renaudin kuvaa alkaloidin uuttoprosessia, jossa Catharanthus roseus-kasvin suspensiosoluja uutetaan 0,01-%:sella etikkahapolla ja kerätään orgaanisiin 1iuotinjakeisiin käyttäen käänteisfaasi-patruunaa sen jälkeen, kun happouutteen pH on nostettu pH-arvon 7,3-7,5 NaOH-1isäyksella. Tämä nimenomainen uuttomene-telmä on erityisen sopiva alkaloidisisällön määritykseen käyttäen HPLC:a fluorimetrisella detektiolla.
Alkaloidien uuttotekniikkaan perehtyneet voivat arvioida, että uuttoprosessit vaihtelevat riippuen uutettavan yhdisteen kemiallisesta luonteesta. Tässä suhteessa AVLB vaatii erikois-huomiota, kun oletetaan, että sillä on taipumus hapettua vähemmän tärkeiksi ja vähemmän arvokkaiksi alkaloideiksi, kuten leurosiiniksi . Kuivattujen lehtien käyttö uuttoprosessissa, kuten on selostettu esimerkiksi edellä mainitussa CA-paten-tissa, on epämieluisaa, kun AVLB valitaan talteenotettavaksi, sillä kuivausprosessi on luonteeltaan hapettava ja saattaisi vähentää tätä lähtökudoksessa käytettävissä olevaa AVLB:a.
Tällä samalla tavoin epäpuhtaan AVLB-uutteen pH-arvon nostaminen Renaudinin selostamalla tavalla, kuten lisäämällä natrium-hydroksidia, saattaa myös myötävaikuttaa AVLB:n hapettumiseen ja vähentää tämän vuoksi talteenottoon saatavaa AVLB:a.
AVLB:n hapettumista alan aikaisemmissa prosesseissa heijastelee ehkä se hyvin vaatimaton AVLB:n saanto, joka on uutettu CA-patentissa kuvatulla prosessilla (0,145 g 1 kgrsta kuivattuja lehtiä). Näin ollen tämän keksinnön tavoitteena on saada aikaan menetelmä, joka sopii AVLB:n uuttamiseen C. ro-seus -kudoksesta.
91639 3 Tässä keksinnössä käytetään ensimmäisenä uuttoaineena vesipitoista väliainetta, jolla on hapan pH. Vesipitoisen, happaman väliaineen käyttö orgaanisen liuottimen sijasta ensimmäisessä uuttomenettelyssä tarjoaa useita etuja. Ensinnäkin vesipitoinen väliaine on selektiivinen siinä mielessä, että AVLB ja muut perusalkaloidit saadaan talteen ensimmäisessä vaiheessa sensijaan, että saataisiin suurempi määrä kasvituotteita orgaaniseen liuottimeen. Lisäksi solujäte kloroplastit mukaanluettuna, jotka on saatu talteen vesipitoiseen väliaineeseen, voidaan poistaa yksinkertaisella sentrifugoinnilla poistaen täten lehtivihreä, joka muutoin saattaisi myötävaikuttaa AVLBrn hapettumiseen ja saattaa häiritä puhdistusprosessia. Lehtivihreän poisto orgaanisesta liuottimesta vaatii monimutkaisempaa tekniikkaa.
Sen jälkeen, kun solujäte on erotettu liukoisista komponenteista esimerkiksi sentrifugoimalla, liukoinen komponentti uutetaan orgaanisella liuottimena. Edullisen toteutusmuodon mukaisesti pelkistysainetta, edullisesti natriumboorihydridiä lisätään liukoiseen komponenttiin ennen uuttoa orgaanisella liuottimena. Pelkistysaineen lisäys uuttomenettelyn tässä vaiheessa johtaa parantuneeseen AVLB-saantoon mahdollisesti kompensoimalla hapettavia aineita tai konvertoimalla hapettuneet AVLB-johdannaiset AVLB:ksi, ts. katarantiinin ja vindo-liinin yhdistymistuote pelkistetään natriumboorihydridi1la AVLB:ks i.
Kun AVLB on kerran uutettu orgaanisella liuottimena, se voidaan puhdistaa alan standarditekniikä 1la esim. kromatografi-sesti käyttäen selektiivistä kiteytystä jne.
Tässä etusijalla olevan keksinnön toteutusmuodon mukaisesti C. roseus -kudos hajotetaan entsyymillä solun seinämien rikkomiseksi ja alkaloidien vapauttamiseksi mahdollisimman suuressa määrin.
4 91639
On huomattava, että tässä keksinnössä vältetään hapettavien aineiden käyttöä aina, kun se on mahdollista. Näin ollen tässä on erittäin edullista suorittaa uuttoprosessi inertissä atmosfäärissä aina kun se on mahdollista, vaikka merkittävät AVLB-saannot voidaan saada normaa1iatmosfäärissä.
Näin ollen tämän keksinnön erään kohdan mukaisesti aikaansaadaan menetelmä AVLB:n uuttamiseksi C. roseus -kudoksesta, joka menetelmä käsittää ensimmäisen vaiheen, jossa kudos uutetaan pH-arvoltaan happamaan vesipitoiseen väliaineeseen, ja toisen vaiheen, jossa liukoinen komponentti uutetaan orgaanisella 1iuott imellä.
Uuttoprosessi voidaan suorittaa tuoreella, ts. juuri kasvatetulla tai pakastetulla C. roseus -kudoksella. Kuivattua kudosta on edullista välttää, sillä kuivausprosessi11a arvellaan olevan hapettava vaikutus kudoksessa olevaan AVLB:iin ja tämän vuoksi se pienentää kuivatussa kudoksessa saatavissa olevan AVLB:n määrää.
Tuore tai pakastettu kudos on edullista hienontaa ennen uuton ensimmäistä vaihetta solukudoksen paljastamiseksi. Tuore kudos voidaan homogenoida esimerkiksi hapossa standardisekoit-timessa. Pakastettu kudos on sopivaa jauhaa nestemäisessä ty-pessä. Koska kuitenkin tässä on aina tarkoituksena prosessoida C. roseus -kudosta ei-hapettavissa olosuhteissa, on mitä sopivinta käyttää jauhatusta inertissä atmosfäärissä kudoksen valmistelemiseksi uuttoa varten valittiinpa tuore tai pakastettu kudos lähtömateriaaliksi.
Arvellaan, että AVLB liittyy soluseinämän matriisiin mahdollisesti kasvikudoksessa tai kun solut rikotaan ja sisältö sekoitetaan. Tämän vuoksi on mahdollista, että vaikka jauhatus paljastaa kudoksesta osan AVLB:stä ensimmäiselle uuttoväliai- 91639 5 neelle, jäljelle jäävä osa AVLB:stä on yhtä sitoutuneena ja välttää uuton. Näin ollen tässä on edullista altistaa joko jauhamaton kudos tai jauhettu kudos entsyymeille, jotka kykenevät hajottamaan solun seinämän komponentteja, kuten sellu-laasille, peptinaasi1le, ksylanaasi1le ja laminaraasille, ennen kuin uutto suoritetaan. Tähän tarkoitukseen käyttökelpoisia kaupallisia valmisteita on runsaasti ja niitä ovat esimerkiksi Macerozyme ja Driselase (molemmat yhtiön Yakult Honsha Co. Ltd., Japani, tuotteita).
Kun kudos on valmistettu, se uutetaan ensin vesipitoisella väliaineella, jolla on hapan pH. Vettä sellaisenaan, esim. vesijohtovettä, tislattua tai kahteen kertaan tislattua vettä, voidaan käyttää ja se saattaa olla etusijalla kustannusten pitämiseksi minimissä. Kokeellinen tutkimus osoittaa kuitenkin, että pH-arvon alentaminen lisäämällä happoa vesipitoiseen väliaineeseen voi parantaa AVLB:n uuttoa. Esimerkiksi kun käytetään vesipitoista väliainetta, jonka pH on n. 2, AVLB-saannon on havaittu olevan suurempi kuin vastaava saanto pH-arvolla n. 6 kaikkien muiden olosuhteiden ollessa samat. pH-arvon laskemiseen voidaan käyttää mitä tahansa happoa mukaan luettuna orgaaniset hapot, kuten etikkahappo ja epäorgaaniset hapot, kuten rikkihappo. Mineraalihapot kuten kloorive-tyhappo ovat edullisia ja niitä voidaan sekoittaa veteen halutun pH-arvon saavuttamiseksi ennen kudoksen uuttoa sillä. Saatu vesipitoisen väliaineen pH voi olla välillä 1,5-7.
Vesipitoisen väliaineen pH muuttuu emäksisemmäksi sen jälkeen, kun C. roseus -kudos on suspendoitu siihen. Kudoksen aiheuttama pH-arvon kohoaminen vaihtelee riippuen kudoksen määrästä ja koostumuksesta, vaikka 1-2 pH-yksikön nousua voidaan odottaa tyypillisissä olosuhteissa. Kuitenkin edellyttäen, että vesipitoisen väliaineen pH alussa on hapan, AVLB:n saanto on tyydyttävä. Väliaineen pH pysyy edullisesti kudoksen lisäyksen jälkeen happamana, esimerkiksi pH-arvossa 3,5-6,5, jotta saataisiin edulliset saannot. Tämä voidaan toteuttaa hapotta- 6 91639 maila vesipitoinen väliaine ennen kudoksen altistamista sille, aIku-pH-arvon synnyttämiseksi, joka on n. 1 tai 2 pH-yksikköä alempi kuin kudoksen uuton jälkeen haluttu pH. Vaihtoehtoisesti laimeaa happoa voidaan lisätä haluttaessa suoraan kudos-uutteeseen. Tärkeää on pitää mielessä, että emäksen lisäystä pH-arvon korjaamiseksi tulee välttää, sillä tämä järkyttää AVLB:n hapetustilaa ja saattaisi pienentää saantoa.
Vaikka hapon vaikutusta uuttoprosessiin ei täysin tiedetä, arvellaan, että happo toimii dissosisoimalla AVLB:a eri makromolekyyleistä, kuten polysakkarideista, proteiineista, poly-fenoleista jne. Samantapainen vaikutus näyttää esiintyvän, kun suolaa hapon asemesta lisätään alussa vesipitoiseen väliaineeseen tämän keksinnön vaihtoehtoisen toteutustavan mukaisesti. Vaikka happoa ei lisätä, suolaiseksi tehdyn vesipitoisen väliaineen katsotaan tässä yhä olevan pH-arvoltaan hapan vesipitoinen väliaine, koska suolan lisäys esimerkiksi veteen sellaisenaan johtaa yhä väliaineeseen, jonka pH on 7 tai alempi. Suoloja, jotka ovat sopivia lisättäväksi veteen, ovat erittäin ionisoituvat suolat, kuten ammoniumsulfaatti, kalium-kloridi ja erityisesti natriumkloridi. Suolapitoisuus vedessä voi olla välillä 0,01-5,0-M, vaikka erityisesti tapauksessa, jossa käytetään natriumkloridia, mooliväkevyydet välillä 0,9-3,0-M ovat etusijalla. Suola voidaan lisätä suoraan veteen <pH n. 6,0) ja käyttää sitä uuttoväliaineena, kun suolan moo-liväkevyys on haluttu.
Tämän keksinnön lisätoteutusmuodossa vetyperoksidia lisätään C. roseus -kudoksen tappamaan vesiuutteeseen AVLB-saantojen parantamiseksi. Lisätty vetyperoksidin määrä on edullisesti yli 8 mM, kaikkein edullisemmin se on 20 mM.
Kun jauhettu ja entsyymin hajottama kudos on suspendoitu vesipitoiseen väliaineeseen, käytettiinpä vettä sellaisenaan, hapotettua vettä tai suolattua vettä, edullisesti sekoittaen ja valinnaisesti sekoittaen siihen vetyperoksidia, alkaloidit
II
91639 7 sisältävä liukoinen komponentti erotetaan solujätteestä, ts. liukenemattomasta komponentista esimerkiksi suodattamalla tai edullisemmin sentrifugoimalla. Liukenemattoman komponentin vesiuutto voidaan toistaa 1isäalkaloidin ta1teenottamiseksi liukoiseen komponenttiin, joka voidaan sitten kerätä yhteen aikaisemmin talteenotettujen liukoisten komponenttien kanssa.
Ennen uuttoa orgaanisella liuottimena pelkistysainetta lisätään tässä edullisen toteutusmuodon mukaisesti liukoiseen komponenttiin. Tässä suhteessa natriumboorihydridi on erityisen sopiva riittävinä määrinä esimerkiksi n. 0,05-4,0 mg/ml:n ja edullisemmin 0,1-3,0 mg/ml:n pitoisuuden aikaansaamiseksi liukoiseen komponenttiin. Pelkistysaineen arvellaan parantavan AVLB—uuton saantoa joko pelkistämällä AVLB:n iminiumana-logia tai estämällä AVLB:n hapettuminen liukoisessa komponentissa. Parhaat tulokset saadaan liukoisen komponentin erotuksen jälkeen liukenemattomasta komponentista. Pelkistysaineen lisäys ennen erottamista, ts. uuton aikana, osoittaa alentavan AVLB-tasoja lopullisessa uutteessa.
Vesipitoinen väliaine, johon alkaloidit alussa uutetaan, voidaan haluttaessa pakastaa ainakin jopa noin kolmeksi viikoksi ennen seuraavaa uuttoa orgaanisella liuottimena.
Liukoisen, vesipitoinen komponentin uutto orgaanisella liuottimena, toinen uuttovaihe, on edullista suorittaa kaksifaasi-systeemissä käyttäen esimerkiksi orgaanista liuotinta, joka on valittu bentseenistä, tolueenista ja etyyliasetaatista, joista etyyliasetaatin käyttö on etusijalla. Sarja orgaanisia uuttoja voidaan suorittaa samalle vesiuuttee1le ja orgaaniset jakeet kerätä haluttaessa yhteen jatkoprosessointia varten.
Orgaaniseen jakeeseen sisältyvän AVLB:n puhdistus voidaan suorittaa käyttäen tekniikkaa, joka on nykyään alalla standardina, kuten kromatografiaa, kiteytystä jne. Tässä kuvatusta uuttoprosessista saatava uute sisältää runsaasti kataran- 8 91639 tiini- ja vindo1iinimonomeereja . Todettavia määriä vinblas-tiinia on myös läsnä. Erityinen merkitys tässä on sillä, että uutteessa on kasvanut määrä AVLB:a, joka käyttäen tässä edullisia uuttomenettelyjä voi lähennellä 0,2 % kudoksen kuiva-painosta. Tätä voidaan verrata hyväksyttyihin n. 0,0003 %:n kuivapainoarvoihin vinblastiini- ja vinkristiinialkaloideil-la, jotka voidaan valmistaa käyttäen AVLB:a edeltäjäyhdistee-nä .
Näin ollen aikaansaamalla menetelmä AVLB:n uuttosaannon parantamiseksi tätä edeltäjäyhdistettä hyväksikäyttävät prosessit voivat tulla taloudellisesti houkuttelevammiksi.
Tämän keksinnön toteutusmuotoja kuvataan seuraavassa ainoastaan esimerkinomaisesti.
Esimerkki 1 - ph-vaikutuksen laaiaspektrinen analyysi Suspension väliaineeseen, joka sisälsi 7,5 ml vettä (pH 5,9) ja 1 g NaCl, lisättiin 2,5 g tuorepainoksi mitattuna C. ro-seus -lehtijauhetta, joka oli valmistettu jauhamalla lehdet nestemäisessä typessä. NaCl:a sisältävän suspensioväliaineen alku-pH hapotettiin pH-arvoon 2,0 yhdessä kokeessa, tehtiin emäksiseksi pH-arvoon 9,0 toisessa kokeessa ja oli muuttumaton <pH 6,2) kolmannessa kokeessa ja jokainen koe ajettiin kaksinkertaisena. Näytteitä ultraäänikäsiteltiin 10 minuuttia ja sentrifugoitiin sitten 30 minuuttia kiihtyvyydellä 23 000 G. Yläpuolinen neste poistettiin ja uutettiin 3 kertaa yhtä suurilla tilavuusmäärillä etyyliasetaattia. Tämä kuivattiin ja jäännös liuotettiin metanoliin HPLC-analyysiä varten. HPLC suoritettiin käänteisfaasisella 5 /Um:n C-8-kolonni1la käyttäen metanolin ja veden liuotingradienttia ja t-butyyliammo-niumf osfaattia modi f i o int iaineena.
Il 91639 9
Tulokset AVLB:n saanto
Alku-pH (.% kuivapainosta) 2.0 0,099 6,2 0,066 9.0 0,000 Näin ollen hapan pH parantaa anhydrovinblastiinin saantoa.
Esimerkki 2 - pH-vaikutuksen kapeaspektrinen analyysi Kaksinkertaiset 1 g:n näytteet tuorepainoksi laskettua lehti-jauhetta, jota kuvattiin esimerkissä 1, uutettiin aluksi 3 ml :11a eri väkevyyksisiä HCl-liuoksia, mitä seurasi sentri-fugointi ja orgaaninen uutto esimerkissä 1 hahmotetulla tavalla. TLC:n avulla analysoidut tulokset esitetään seuraavas-sa. pH-arvot on annettu sekä ennen lehti jauheen lisäystä että lehtijauheen lisäyksen jälkeen.
Tulokset HCl:n väkevyys pH AVLB <% kuivapainosta) CM)_ennen_jälkeen_ 1.00 ei mitattu ei mitattu 0 0,50 0,68 0,85 0 0,10 1,26 2,28 0 0,005 1,53 3,62 0,04 0,025 2,05 4,52 0,122 0,010 2,37 5,18 0,101 0,005 2,59 5,55 0,078 0,0011 3,18 6,05 0,065 Näistä tuloksista ilmenee, että vaaditaan suspensioväliaineen aIku-pH-arvoa n. 1,5 anhydrovinblastiinin talteenottamiseen. Tämä merkitsee lehtijauheen lisäyksen jälkeen suspensioväliaineen minimi-pH-arvoa n. 3,5. Edelleen havaitaan, että pH-arvo n. 4-5 lehtisuspensiovällaineessa saa aikaan halutut AVLB-saannot.
10 91639
Erillisessä kokeessa eri happojen vaikutukset AVLB:n saantoon analysoitiin edellä kuvatuissa olosuhteissa:
Tulokset ilmenevät seuraavasta:
Happo Väkevyys pH AVLB
_(M)_ennen_jälkeen_ HC1 0,025 2,05 4,52 0,122 0,010 2,37 5,18 0,101 0,005 2,59 5,55 0,078 0,0011 3,18 6,05 0,065 H2S04 0,010 2,16 4,67 0,100 0,001 2,92 5,82 0,062 CH3COOH 0,010 3,56 5,36 0,091 0,001 4,20 5,95 0,067
On ilmeistä, että useita eri happoja voidaan menestyksellä käyttää pH-arvon säätöön reaktioväliaineessa vaikuttamatta haitallisesti saantoon.
Esimerkki 3 - Natriumkloridi
Kun lehtiä uutettiin samalla menetelmällä kuin esimerkissä 1 kuvattiin käyttäen normaali-pH-arvoista <n. 5,9) vettä, uutetun anhydrovinblastiinin tasoja voitiin nostaa käyttämällä vedessä natriumkloridia.
Tulokset
NaCl:n väkevyys (M) AVLB-saanto <% kuivapainosta) 0,00 0,041 0,23 0,049 0,91 0,059 li 91639 11 < jatkoa ) 1,14 0,050 2,28 0,066 4,56 0,021
Optimaaliset AVLB-saannot saatiin 1 g:lla NaCl 7,5 ml:ssa vettä Cts. 2,28-M väkevyyksillä), jolloin saatiin 61 %:n kasvu verrattuna näytteisiin, jotka uutettiin ilman natriumklo-r idia.
Kun laimeaa happoa käytettiin AVLB:n uuttamiseen esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, enempää kasvua ei tapahtunut, kun lisättiin natriumkloridia.
NaCl-väkevvvs (M) AVLB:n saanto (¾ kuivapainosta? 0,00 0,104 1,14 0,105 1,71 0,095 2,28 0,079 2,85 0,078 Nämä tulokset osoittavat, että alempi pH saattaa myös aiheuttaa jonkinlaista AVLBtn dissosioitumista siten, että natrium-kloridilla ei ole lisävaikutusta. Alempi pH saattaa antaa myös paremman stabiilisuuden AVLB:lie. AVLB-saantojen lasku, kun NaCl:n väkevyys kasvaa, saattaa johtua vähemmän liukoisen AVLB:n suolautumisesta pois.
Esimerkki 4 - Natriumboorihvdridin lisäys
Lehtiä jauhettiin nestemäisessä typessä ja 1 g:n annokset sekoitettiin^ ml:aan 0,025-M HC1. 0,1 moolia magnesiumkloridia ja 3 x 10 % vetyperoksidia lisättiin kumpaakin tähän seok seen. Sentrifugoinnin jälkeen yläpuolinen liuos poistettiin ja natriumbocrihydridia lisättiin siten, että loppuväkevyyk-sier. alue 0-3,33 mg/ml voitiin testata. HPLC-ana lyy s in tulokset AVLB:lie esitetään seuraavassa: 12 91639
Natriumboorihydridin AVLB:n saanto loppuväk. (ma/ml) (% kuivapainosta) 0 0,102 0,067 0,161 0,167 0,172 0,333 0,171 0,666 0,207 1,667 0,164 3,333 0,167 Näin ollen natriumboorihydridin lisäys happamaan uutteeseen parantaa AVLB:n saantoja. Tämä on tehtävä sentrifugointi-vaiheen jälkeen - jos NaBH4 lisätään ennen sentrifugointia, yhtään AVLB:a ei kyetä uuttamaan.
Magnesiumkloridin ja vetyperoksidin havaittiin tämän jälkeen olevan tarpeettomia boorihydridivaikutuksen kannalta.
Esimerkki 5 - Spektrianalyysi
Kaksinkertaiset 1 g:n tuorepainonäytteet lehti jauhetta (valmistettu jauhamalla nestemäisessä typessä) sekoitettiin kumpikin 3 ml:aan 0,03-M HCl:a, joka sisälsi 0,4 g natriumklori-dia. Näitä sentrifugoitiin 23 000 G:n kiihtyvyydellä 30 min ja yläpuolinen neste uutettiin etyyliasetaatilla kahdesti. Etyyliasetaatti kuivattiin pois ja jäljelle jäänyt jäännös liuotettiin 500 /ul:aan metanolia analysoitavaksi TLC:lla ja HPLC:11a.
HPLC: Näytteet analysoitiin C-8-HPLC-kolonni1la edellä kuvatulla tavalla. 3',4'-anhydrovinblastiini identifioitiin sen retentioajän, UV-spektrin ja spektrin ensimmäisen derivaatan avulla, jotka kaikki vastasivat tunnetun standardin arvoja. AVLB:n saannoksi laskettiin 0,089 % kuivapainosta. Vindoliini, katarantiini ja hivenmääriä leurosiir.ia tunnistettiin myös niiden retentioaikojen ja spektrien perusteella. Näiden kolmen alkaloidin lasketut saannot annetaan seuraavassa.
91639 13 % kuivapainosta
Leurosiini 0,001
Vindoliini 0,148
Katarantiini 0,142 TLC: Suoritettiin normaalifaasinen ohut 1evykromatografia—ana lyysi käyttäen piidioksidigee1iä ja liikkuvana faasina to-lueeni:asetoni:metanoli:ammoniumhydroks idia <20:10:2:0,5). Anhydrovinblastiini, katarantiini ja vindoliini tunnistettiin kaikki niiden Rf-arvoista ja UV-spektristä, jotka vastasivat tunnettujen standardien arvoja. Lisäksi TLC:11a eluoidut täplät ruiskutettiin serium-ammoniumsulfaattisuihkeella, joka paljasti luonteenomaiset värireaktiot kaikille kolmelle alkaloidille .
Rf-arvot TLC:lla
Anhydro-VLB Katarantiini Vindoliini Näyte 0,37 0,59 0,45
Standardi 0,37 0,59 0,44
Esimerkki 6 - Ultraäänikäsittelvn vaikutus 2,5 g:n näytteet tuoretta lehtijauhetta uutettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla happamalla pH-arvolla käyttäen laimeaa HCl:a <0,03-M). Kaksinkertaisia hauteita ultraäänikäsiteltiin eri ajanjaksoja, minkä jälkeen ne suodatettiin miracloth-kan-kaan läpi. Suodos sentrifugoitiin ja tuloksena oleva yläpuolinen neste uutettiin etyyliasetaatilla kuten edellä.
Tulokset
Ultraäänikäsittely- AVLB:n saanto <.% kuivapainosta) aika (min)_ 0 0,104 15 0,094 30 0,090 60 0,067 14 91639 Nämä tulokset osoittavat, että uitraäänikäsittely on turha ja että jos tällaista hautomista pidennetään, tapahtuu itse asiassa AVLB:n saannon lasku johtuen mahdollisesti ilman aiheuttamasta hapettumisesta. Näin ollen uitraäänikäsittelyä on edullista välttää AVLB:n uuttoprosessissa.
Esimerkki 7 - Lehtimateriaa1 in entsvvmiha iotus Jauhettuja lehtimateriaalinäytteitä (1 g:n tuorepaino) haudottiin eri entsyymivalmisteiden kanssa huoneenlämpötiloissa tunnin ajan. Kahdesti tislattua vettä käytettiin vesipitoisena uuttoväliaineena, joka sentrifugoitiin ja uutettiin orgaanisella liuottimena tavalliseen tapaan. Tulokset ilmenevät seuraavasta:
Entsyymi Väk. AVLB Alkaloidiväk. (% kuivapainosta) __Katarant i ini_Vindoliini
Macerozyme 0,2 % 0,045 0,122 0,393 < epäpuhdas peptinaasi) o,4 % 0,073 0,163 0,382
Driselase 2,0 % 0,049 0,126 0,328 (laminaraasin, 4,0 % 0,039 0,128 0,342 ksylanaasin ja sellulaasin epäp. valmiste >
Beeta-glukosi- daasi 10 yks. 0,020 0,068 0,260 20 yks. 0,008 0,044 0,204
Tarkistus 0,010 0,054 0,209 li 91639 15
Parantunut alkaloidisaanto, joka seuraa, kun käytetään Mace-rozyme- ja Driselase-entsyymejä (molemmat yhtiön Yakult Hons-ha Co. Ltd, Japani, tuotteita), on mitä todennäköisemmin seurausta alkaloidien vapautumisesta C. roseus -kudoksen solusei-nämämatriisista.
Esimerkki 8 - Entsvvmihaiotus ia hapotus
Kaksinkertaisia 1 g:n annoksia lehtiä (jauhettu nestemäisessä typessä) joko: 1. haudottiin yhdessä 0,4 :n kanssa Macerozyme-entsyymiä 3 ml-.ssa vettä 1 tunti, mitä seurasi sentr i f ugoint i ja yläpuolisen nesteen uutto tavalliseen tapaan tai 2. 0,1-M HCl:a lisättiin lehtien ja veden (3 ml) seokseen loppu-pH-arvon 4,5 saamiseksi ja se sentrifugoitiin ja uutettiin normaaliin tapaan, tai 3. suoritettiin entsyymihaudonta kuten kohdassa 1, mitä seurasi hapon lisäys kuten kohdassa 2, sentrifugointi ja uutto normaaliin tapaan.
Alkaloidipitoisuus (mg) Käsittely_AVLB_Katarant i ini_Vindol i ini 0,4 % Macerozyme 93,1 433,5 323,1
Happo 90,6 402,6 307,2 0,4 % Macerozyme + happo 132,9 428,8 328,1 Näin ollen yhdistetty entsyymikäsittely ja sen jälkeinen hapotus paransi AVLB:n saantoa 43 %:lla verrattuna pelkkään entsyymikäsittelyyn.
Esimerkki 9 - Massaspektrofotometria
Lehdistä uutettu AVLB-näyte puhdistettiin keräämällä asianomainen jae HPLC-menetelmäl lä . Normaali HLPC-gradier.tt i ajet- 9Ί639 16 tiin metanolilla, vedellä ja 0,l-%:sella trietyy1iamiini 1la. Kerätty jae kuivattiin sitten ja analysoitiin elektroni-isku-massaspektrofotometrisesti. Saatu fragmentointikuvio oli sama kuin 3',4'-anhydrovinblastιinin tunnetulla näytteellä. Korkean erottelukyvyn tulokset osoittavat, että sillä oli 792,4107 yksikön massa (± 0,9 % poikkeaman ollessa 0,9 mi 11imassayksikköä teoreettisesta arvosta).
Esimerkki 10 - Vinblastiinin tunnistaminen 100 g (tuorepainosta) lehtiä jauhettiin 300 ml:ssa 0,025-M HCl:a Waring-sekoittimessa. Jäte poistettiin sentrifugoimalla ja yläpuolinen neste uutettiin etyyliasetaatilla. Etyyliasetaatti haihdutettiin pois ja liuotettiin pieneen tilavuusmää-rään metanolia, joka juovitettiin preparatiiviselle TLC-levyl-le käyttäen tolueeni:asetonitmetanoli:NH^OH (28:10:2:0,5). Vyöhyke, jolla oli sama Rf-arvo kuin VLB-standardi1la, todettiin ja raaputettiin pois levyltä. Tämä uutettiin piidioksidista käyttäen metanoli:dikloorimetaania (2:1), jossa oli 1,5 % trietyyliamiinia. Liuotin poistettiin sitten haihduttamalla ja jäljelle jäänyt alkaloidi puhdistettiin uudelleen preparatiivise1la TLC-levyllä käyttäen dietyylieetteri:kloroformi : metano 1 ia (50:35:20). Kaista, jolla oli sama Rf-arvo kuin VLB-standardi11a, poistettiin ja uutettiin kuten edellä. Liuotin haihdutettiin pois ja jäljelle jäänyt alkaloidi liuotettiin pieneen määrään dikloorimetaania, suodatettiin ja kuivattiin sitten uudelleen. Alkaloidi analysoitiin desorptio-elektroni-iskumassaspektrofotometrisesti ja VLB:a vastaava ioni todettiin. Korkean erottelukyvyn tulokset antoivat tarkan massan, joka oli 0,8 mi 11imassayksikön sisällä vinblas-tiinin teoreettisesta arvosta.
Esimerkki 11 - Natriumhvdroksidi- ia ammoniumhvdroksidili-sävksen vaikutus 1 g:n annokset lehtiä (jauhettu nestemäisessä typessä) uutettiin 0,025-M HCl:lla normaaliin tapaan. Sentrifugoinnin jälkeen yläpuolisen nesteen pH nostettiin arvoon 7,3 tai 9,0 jo- 91639 17 ko NaOHrlla tai NH4OH:lla. Lisäksi happoon (0,025-M HC1) sus-pendoituja lehtiä käsiteltiin 0,5 g:lla NaCl ja sentrifugoin-nin jälkeen pH nostettiin arvoon 7,3 NH4OH:lla tai NaOH:lla. Asianmukaiset tarkistukset (ts. ilman emästä) ajettiin myös.
Tulokset <HPLC-analyysistä) _pH_AVLB (% kuivapainosta)
Tarkistukset 0,124 + NH4OH 7,3 0,116 + NaOH 7,3 0,090 + NH4OH 9,0 0,076 + NaOH 9,0 0,084
NaC1 (0,5 g) 0,89
NaC1 + NH4OH 7,3 0,70
NaC1 + NaOH 7,3 0,68 Näin ollen kun on määrä uuttaa AVLB:a, on edullista nostaa vesipitoisen väliaineen pH-arvoa ennen kaksifaasiuuttoa.
Esimerkki 12 - Vetvperoksidi1isävksen vaikutus 1 g:n erät 1ehtijauhetta sekoitettiin 3 ml:aan 0,025-M HCl:a ja lisättiin eri H202~väkevyyksiä. Sentrifugoinnin jälkeen natriumboorihydridiä lisättiin yläpuoliseen nesteeseen 0,67 mg/ml:n loppuväkevyyteen ja uutto etyyliasetaatilla suoritettiin tavalliseen tapaan.
Tulokset (HPLC-analyysistä)
^2®2-v^*ceV- AVLB
_(mM)_( /ua) 0 372 1 359 2 360 4 375 91659 18 (jatkoa ) 8 445 12 461 20 444 Näin ollen yli 8 mM:n ^C^-väkevyyden lisäys toimii parantaen AVLB:n saantoja lehdistä.
Claims (10)
1. Förfarande för extrahering av en alkaloid ur en löslig komponent av Catharanthus roseus -vävnadens syrliga vat-tenextrakt, vilken vävnad är antingen fräsch eller fryst, kannetecknat av att den lösliga komponenten behandlas med ett reduceringsämne och den behandlade lösliga komponenten extraheras med ett organiskt lösningsmedel.
1. Menetelmä alkaloidin uuttamiseksi Catharanthus roseus -kudoksen happaman vesiuutteen liukoisesta komponentista, joka kudos on joko tuore tai pakastettu, tunnettu siitä, että käsitellään liukoista komponenttia pelkistysaineella ja uutetaan käsitelty liukoinen komponentti orgaanisella liuottimena .
2. Förfarande enligt patentkrav 1, kannetecknat av att 3',4'-anhydrovinblastin extraheras ur Catharanthus roseus -vävnaden, och att förfarandet omfattar stegen, i vilka: A) vävnaden extraheras med ett vattenhaltigt medium med ett syrligt pH; B) den lösliga komponenten av det erhällna extraktet sepa-reras väljbart frän den olösliga komponenten med sentrifuge-ring; C) den lösliga komponenten behandlas med ett reduceringsämne ; och II 91659 D) den behandlade lösliga komponenten extraheras med ett organiskt lösningsmedel.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 3',4'-anhydrovinblastiinia uutetaan Catharanthus roseus -kudoksesta, ja että menetelmä käsittää vaiheet, joissa A) uutetaan kudos vesipitoisella väliaineella, jolla on hapan pH; B) erotetaan saadun uutteen liukoinen komponentti liukenemattomasta komponentista valinnaisesti sentrifugoimalla; C) käsitellään liukoista komponenttia pelkistysaineella; ja D) uutetaan käsitelty liukoinen komponentti orgaanisella liuottimena.
3. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att reduceringsämnet är natriumborhydrid.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pelkistysaine on natriumboorihydridi.
4. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att koncentrationen av natriumborhydriden i den behandlade lös-ningen är 0,05-4,0 mg/ml.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että natriumboorihydridin väkevyys käsitellyssä liuoksessa on 0,05-4,0 mg/ml.
5. Förfarande enligt vilket som heist av patentkrav ovan, kännetecknat av att det organiska lösningsmedlet är etylace-tat.
5. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että orgaaninen liuotin on etyyliasetaatti.
6. Förfarande enligt vilket som heist av patentkrav ovan, kännetecknat av att pH-värdet av den lösliga komponenten är 3,5-6,5.
6. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liukoisen komponentin pH on 3,5-6,5. 91639
7. Förfarande enligt vilket som heist av patentkrav ovan, kännetecknat av att det vattenhaltiga mediet innehäller syra eller salt.
7. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen väliaine sisältää happoa tai suolaa.
8. Förfarande enligt patentkrav 7, kännetecknat av att syran är klorvätesyra och saltet är natriumklorid, varvid molariteten av natriumkloridlösningen är 0,9-3,0 M.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happo on kloorivetyhappo ja suola on natriumklori-di, natriumkloridiliuoksen molaarisuuden ollessa 0,9-3,0 M.
9. Förfarande enligt vilket som heist av patentkrav ovan, kännetecknat av att efter extraheringen av vävnaden med det vattenhaltiga mediet med syrligt pH väteperoxid tillsätts, företrädesvis i en mängd av minst 8 mM.
9. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kudoksen uuton jälkeen vesipitoisella väliaineella, jolla on hapan pH, lisätään vetyperoksidia, edullisesti vähintään 8 mM:n määrä.
10. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että C. roseus -kudos jauhetaan ja hajotetaan sellulolyyttisillä entsyymeillä ennen uuttoa.
10. Förfarande enligt vilket som heist av patentkrav ovan, kännetecknat av att C. roseus -vävnaden mals och sön-derdelas med cellulolytiska enzymer före extraheringen.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/045,621 US4831133A (en) | 1987-05-01 | 1987-05-01 | Extraction of alkaloids of Catharanthus roseus tissue |
| US4562187 | 1987-05-01 | ||
| PCT/JP1988/000413 WO1988008425A1 (en) | 1987-05-01 | 1988-04-27 | Extraction of alkaloids |
| JP8800413 | 1988-04-27 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI886053L FI886053L (fi) | 1988-12-30 |
| FI91639B true FI91639B (fi) | 1994-04-15 |
| FI91639C FI91639C (fi) | 1994-07-25 |
Family
ID=21938973
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI886053A FI91639C (fi) | 1987-05-01 | 1988-12-30 | Alkaloidien uutto |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4831133A (fi) |
| EP (1) | EP0312609B1 (fi) |
| JP (1) | JP2550405B2 (fi) |
| KR (1) | KR950013574B1 (fi) |
| CA (1) | CA1262443A (fi) |
| DE (1) | DE3881819T2 (fi) |
| FI (1) | FI91639C (fi) |
| WO (1) | WO1988008425A1 (fi) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5753507A (en) * | 1995-09-22 | 1998-05-19 | Novartis Finance Corporation | Plant geraniol/nerol 10-hydroxylase and DNA coding therefor |
| NL1009437C2 (nl) * | 1998-06-18 | 1999-12-21 | Xenobiosis | Extractiewerkwijze. |
| AU5240999A (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-21 | Goldsmith Seeds Inc. | Trimeric and polymeric alkaloids |
| CA2477739A1 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-12 | Mallinckrodt Inc. | Method and system for separation and purification of at least one narcotic alkaloid using reverse phase preparative chromatography |
| CN103936769B (zh) * | 2014-04-30 | 2016-10-05 | 淮海工学院 | 一种制备高光学纯脱水长春碱的方法 |
| JP7282350B2 (ja) * | 2017-12-06 | 2023-05-29 | 国立大学法人高知大学 | タンパク質糖化反応阻害物質の製造方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU178084B (en) * | 1977-05-31 | 1982-03-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | New process for the extraction of native vindoline,catharantine,3',4'-anhydrovinblastine,leurosine and,if desired,of other diinodle alkaloids from vinca rosea l.drogue |
| US4749787A (en) * | 1986-10-23 | 1988-06-07 | Harbor Branch Oceanographic Institution, Inc. | Process of isolating vinblastine from the plant catharanthis roseus |
-
1987
- 1987-05-01 US US07/045,621 patent/US4831133A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-20 CA CA000544980A patent/CA1262443A/en not_active Expired
-
1988
- 1988-04-27 JP JP63503609A patent/JP2550405B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-27 EP EP88903929A patent/EP0312609B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-27 KR KR1019880701770A patent/KR950013574B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-27 WO PCT/JP1988/000413 patent/WO1988008425A1/en not_active Ceased
- 1988-04-27 DE DE88903929T patent/DE3881819T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-30 FI FI886053A patent/FI91639C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1262443A (en) | 1989-10-24 |
| JP2550405B2 (ja) | 1996-11-06 |
| KR950013574B1 (ko) | 1995-11-09 |
| US4831133A (en) | 1989-05-16 |
| KR890701596A (ko) | 1989-12-21 |
| EP0312609A1 (en) | 1989-04-26 |
| FI886053L (fi) | 1988-12-30 |
| EP0312609B1 (en) | 1993-06-16 |
| FI91639C (fi) | 1994-07-25 |
| DE3881819D1 (de) | 1993-07-22 |
| DE3881819T2 (de) | 1994-02-03 |
| WO1988008425A1 (en) | 1988-11-03 |
| JPH01503236A (ja) | 1989-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pettit et al. | Antineoplastic agents, 99. Amaryllis belladonna | |
| Mínguez-Mosquera et al. | High-performance liquid chromatographic study of alkaline treatment of chlorophyll | |
| FI91639B (fi) | Alkaloidien uutto | |
| SU867313A3 (ru) | Способ получени алкалоидов-лейрозина,винкристина,винбластина,дезацетоксивинбластина,N-дезметилвинбластина,дезацетилвинбластина,виндолина,катарантина,3',4'-ангидровинбластина | |
| FI91067B (fi) | Alkaloididimeerien valmistus käyttäen ferri-ionia | |
| Crespi-Perellino et al. | Biosynthetic relationship between indole alkaloids produced by cell cultures of Ailanthus altissima | |
| Wasley et al. | CMorophyllides c | |
| Crespi-Perellino et al. | Occurrence of indole alkaloids in Ailanthus altissima cell cultures | |
| CA2354847C (en) | A process for the isolation of 10-deacetyl baccatin iii from the recoverably part of a plant of taxus species | |
| SI20820A (sl) | Metoda za pripravo aloina z ekstrakcijo | |
| CN101781345A (zh) | 田蓟苷的制备方法 | |
| CN110790777B (zh) | 一种长春新碱类化合物杂质及其制备方法与应用 | |
| DE60102399T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von 5'-Nor-anhydrovinblastinditartrat aus Pflanzen der Gattung Catharanthus | |
| CN113980485A (zh) | 一种生物酶复合物及应用于植物提取过程中的方法 | |
| CN108558913B (zh) | 一种硫酸长春新碱的制备方法 | |
| PL95570B1 (pl) | Sposob oczyszczania dimerycznych alkaloidow indolu | |
| KR0134641B1 (ko) | 4-히드록시-5-메틸-3[2h]-퓨라논의 제조방법 | |
| Hoogewijs et al. | Ion-pair extraction of basic drugs with di (2-ethylhexyl) phosphoric acid | |
| US7179927B2 (en) | Extraction method | |
| WO2019222817A1 (en) | Method for preparation of purified galantamine hydrobromide | |
| CN110746419A (zh) | 新化合物及其制备方法和应用、药物 | |
| US4237291A (en) | Process for the isolation of ergot alkaloids from culture suspensions | |
| Verdeil et al. | Papaverine biotransformation by Silene alba cell suspension | |
| US4209443A (en) | Process for separating pharmaceutically active diindole alkaloids | |
| CN106977484A (zh) | 一种茶黄素复合物的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| TC | Name/ company changed in patent |
Owner name: MITSUI CHEMICALS, INC. |
|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: MITSUI CHEMICALS, INC. |