JP7282350B2

JP7282350B2 - タンパク質糖化反応阻害物質の製造方法

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Publication number: JP7282350B2
Application number: JP2017234600A
Authority: JP
Inventors: 充彦宮村; 智滉石田; 興平常風; 由喜男伊藤
Original assignee: Kochi University NUC
Current assignee: Kochi University NUC
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2023-05-29
Anticipated expiration: 2037-12-06
Also published as: JP2019099529A

Description

本発明は、タンパク質の糖化反応を有効に阻害することが可能で且つ非常に安全な物質の製造方法に関するものである。

最終糖化産物（ＡＧＥｓ）はタンパク質が非酵素的に糖化されることによって産生される物質であり、メイラード反応によって産生される物質としても知られている。ＡＧＥｓは、通常、分解により無害化された後に排出される。しかし、加齢などにより代謝機能が衰えると、ＡＧＥｓが組織に蓄積して種々の症状が引き起こされるといわれている。例えば皮膚を構成するコラーゲンが糖化されると、皮膚組織が衰えて弾力性が低下し、シワなどが生じる。また、ＡＧＥｓは褐色であるので、シミやクスミの原因となる。糖尿病患者では、高血糖によりＡＧＥｓが生じ易くなっており、ＡＧＥｓが白内障、動脈硬化、腎機能障害といった糖尿病性合併症の原因となり得る。

タンパク質の糖化反応を阻害する化学合成化合物としてはアミノグアニジンが知られており、かつて糖尿病性腎症の薬として開発されていた。しかし、臨床試験において明確な作用効果が認められなかったことと、貧血、肝障害、ビタミンＢ６欠乏症などの副作用が生じたことにより開発が中止されている。上述したように、ＡＧＥｓの蓄積は加齢などが大きな原因の一つであることから、糖化反応阻害物質としては、予防的に恒常摂取が可能であるよう化学合成化合物ではなく安全な物質が好ましい。
安全なタンパク質糖化反応阻害物質としては、例えば特許文献１にはドクダミ後発酵茶などが、特許文献２には後発酵ルイボス茶などが、特許文献３には碁石茶などが開示されている。

特開２０１３－２５３０７２号公報特開２０１５－２２４２０３号公報特開２０１７－４８１５２号公報

上述したように、茶が安全なタンパク質糖化反応阻害物質として検討された例はあった。しかし、より効果の高いタンパク質糖化反応阻害物質が望まれている。
そこで本発明は、タンパク質の糖化反応を有効に阻害することが可能で且つ非常に安全な物質を製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特定の発酵茶を更に特定の溶媒で抽出することにより、優れたタンパク質糖化反応阻害効果を示す物質が得られることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。

［１］タンパク質の糖化反応を阻害する物質の製造方法であって、
茶葉を好気的発酵した後に嫌気的発酵して発酵茶を得る工程、
上記発酵茶を水系溶媒により抽出して水系溶媒抽出物を得る工程、および、
上記水系溶媒抽出物をエステル系溶媒により抽出する工程を含むことを特徴とする方法。
［２］上記発酵茶が碁石茶である上記［１］に記載の方法。
［３］上記水系溶媒として熱水を用いる上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］上記水系溶媒抽出物の水溶液を上記エステル系溶媒により抽出する上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］上記エステル系溶媒として、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチル、酢酸ｓｅｃ－ブチル、酢酸メトキシブチル、酢酸アミル、酢酸ノルマルプロピル、酢酸イソプロピル、乳酸エチル、乳酸メチルおよび乳酸ブチルからなる群から選択される１以上のエステル系溶媒を用いる上記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］タンパク質の糖化反応を阻害する上記物質が飲食品の成分として用いられるものである上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］タンパク質の糖化反応を阻害する上記物質が外用剤の成分として用いられるものである上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。

本発明方法の原料である発酵茶は飲用にも付される非常に安全なものであることから、本発明方法により得られるタンパク質糖化反応阻害物質は毎日の恒常的な摂取も可能な安全なものであるといえる。よって本発明は、肌の老化や糖尿病性合併症などを抑制できるタンパク質糖化反応阻害物質を製造できる技術として、非常に有用である。

図１は、碁石茶の水抽出物や、その酢酸エチル画分などのタンパク質糖化反応阻害作用を比較するためのグラフである。

以下、本発明方法を工程毎に説明する。
１．茶葉の二段発酵工程
本工程では、茶葉を好気的発酵した後に嫌気的発酵して発酵茶を得る。

原料である茶の種類などは特に制限されず、一般的なものを使用することができる。例えば、茶としては主に低木のもの（学名：Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ）と高木のもの（学名：Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ．ａｓｓａｍｉｃａ）があるが、何れを使用してもよい。但し、日本で一般的な低木の茶を特に制限なく用いることができる。原料である茶葉は、特に新芽を含む２～３開葉期で摘採したものを用いることが好ましい。

本発明では、茶葉を二段発酵する。発酵前の準備として、茶葉の組織を適度に破壊するために茶葉を揉む等してもよいが、蒸煮してもよい。かかる蒸煮は、茶葉のみで行なってもよいが葉を含む枝ごと行なってもよい。蒸煮後には茶葉を枝からとり易くなるため、採取直後に分離するよりも手間がかからない。蒸煮は一般的な条件に従って行なえばよく、茶葉の層へ水蒸気および／または湯気を通じればよい。例えば、いわゆる蒸し器など、底面から水蒸気を通じることができる容器に茶葉あるいは茶葉と枝を密に詰め、その下方で水を沸騰させ、当該容器へ水蒸気および／または湯気を通じる。蒸煮の時間は、続いてそのまま発酵させることができる程度とすればよいが、例えば、水が沸騰してから１～４時間とすることができ、好ましくは２～３時間とする。実際には、茶葉の状態や蒸汁の色などを確認しつつ、時間を調節する。なお、蒸煮した場合には、その蒸汁にも有効成分が含まれていると考えられるため、これを発酵工程で必要な水分として用いることが好ましい。

上記前処理を行なった茶葉は、好気的に発酵させる。具体的には、茶葉を高湿下で静置すればよい。例えば、茶葉を容器に入れ、湿度を保つために水や蒸汁を散布した上でカバーをかけ、常温で５～１０日間程度静置すればよい。その間、適度な温度や湿度を保つことが必要であり、茶葉の状態等を確認しつつ、発酵条件を適宜調節する。また、好気的発酵に当たり、手で押さえたり或いは足で踏むなど適度な圧力をかけてもよい。更に、好気的発酵に適する好気性細菌および／または好気性真菌を添加してもよいが、これらを添加しない場合においても、茶葉自身の酸化酵素や自然に存在する好気性細菌などにより発酵は進行する。

続いて、茶葉を嫌気的に発酵させる。この嫌気的発酵の条件も特に制限されず、公知の方法を用いればよい。例えば、好気的発酵させた茶葉を、圧力をかけながら容器へ密に詰めていき、最終的には容器に蓋をした上でさらに圧力をかけつつ５～１５日程度常温で静置すればよい。嫌気的発酵においても、温度などの条件は、例えば重しの浮き上がり等により発酵の進行を確認しつつ、適宜調節する。また、上記蒸汁を散布したり、或いは茶葉が漬かるほど添加してもよい。更に、嫌気的発酵を行なうための嫌気性細菌などを添加してもよいが、添加せずに自然に嫌気的発酵を進行させてもよい。

嫌気的発酵の後においては茶葉は圧力のために一塊となっているために、適度な大きさに切断することが好ましく、続いて茶葉を乾燥することが好ましい。適度に切断することにより、かかる乾燥が円滑に進む。茶葉の乾燥は、機械的に行なってもよいが、天日干しでも十分である。また、乾燥の程度も特に制限されるものではないが、少なくとも保管時に腐敗などしない程度には乾燥させる必要がある。

上記方法と同様の方法で製造される発酵茶としては、高知県で伝統的に製造されている碁石茶（登録商標）を挙げることができる。このお茶は、生産者が一軒のみにまで減った時期もあったが、現在では特産品として生産者も増え、継続的に生産されているものである。よって、本工程で得られる発酵茶として碁石茶を利用してもよい。

２．水系溶媒による抽出工程
次に、本工程では、上記二段発酵工程で得られた発酵茶から、水系溶媒を使って水系溶媒抽出物を得る。

本工程で抽出に用いる水系溶媒は、水、または水と水溶性有機溶媒との混合溶媒をいう。水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノールやエタノール等のアルコール系溶媒；テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒：ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒を挙げることができる。人体に害が比較的少ないという観点から、水溶性有機溶媒としてはエタノールが好適である。また、水の種類は特に制限されず、精製水、蒸留水、純水、水道水などを特に制限なく使用することができる。好適には、水のみを抽出溶媒として用いる。

本工程における抽出条件は特に制限されず、常法を用いることができる。例えば、水系溶媒１００～１５００ｍＬに対して、二段発酵を経た茶葉を１～５ｇ程度混合し、１分間～１時間程度抽出すればよい。かかる抽出中、混合物は攪拌しても静置してもよく、また、継続的に加熱したり加熱還流してもよい。また、抽出効率の観点から抽出中に超音波を照射してもよい。有効成分がより多く抽出され、抽出物の効果が一層高いことから、好適には８０℃以上の熱水を用いる。

抽出後は、一般的な後処理を行ってもよい。例えば、抽出後の混合物から濾過や遠心分離により固形分を除去してもよい。更に、当該溶液を濃縮したり乾燥してもよい。

３．エステル系溶媒による抽出工程
本工程では、上記水系溶媒による抽出工程で得られた水系溶媒抽出物から、エステル系溶媒を使って本発明に係るタンパク質糖化反応阻害物質を得る。

本工程で用い得るエステル系溶媒は、構造中のカルボキシ基がエステル化されており、水と相溶することなく水層に対して有機層を形成することができ、常温常圧において液状であるものであれば特に制限されない。かかるエステル系溶媒としては、例えば、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチル、酢酸ｓｅｃ－ブチル、酢酸メトキシブチル、酢酸アミル、酢酸ノルマルプロピル、酢酸イソプロピル、乳酸エチル、乳酸メチルおよび乳酸ブチルからなる群から選択される１以上のエステル系溶媒を挙げることができる。なお、水と相溶しないことの基準としては、２０±５℃で１ｍＬのエステル系溶媒を水に加え、５分ごとに強く３０秒間振り混ぜるとき、３０分以内にエステル系溶媒を溶解できる水の量が１０ｍＬ以上であることを挙げることができる。

本工程における抽出条件は特に制限されず、常法を用いることができる。例えば、固体状態の水系溶媒抽出物１ｇに対して５０～３００ｍＬ程度の水を添加して溶解させ、得られた水溶液に対して５０～２００容量％程度のエステル系溶媒を加えて抽出すればよい。エステル系溶媒は２～５程度に分割して２～５回程度抽出を行ってもよい。抽出温度は常温、例えば１０～３５℃程度とすることができ、抽出は上記水溶液とエステル系溶媒とを激しく混合することにより行うことができる。抽出後はエステル系溶媒層を水層から分液し、更に無水硫酸ナトリウムや無水硫酸マグネシウムなどを使ってエステル系溶媒層を水層から分離した後、濃縮すればよい。

４．タンパク質糖化反応阻害物質の利用例
上記本発明方法で得られたタンパク質糖化反応阻害物質は、上記二段発酵茶の水系溶媒抽出物に比べてより一層優れたタンパク質糖化反応阻害活性を示す。また、本発明に係るタンパク質糖化反応阻害物質は、飲用にも付される二段発酵茶から更に有効成分を精製したものに相当することから非常に安全なものであり、恒常的で予防的な服用も可能である。

上記本発明方法で得られたタンパク質糖化反応阻害物質は、エステル系溶媒が残留しないよう、よく粉砕および乾燥することが好ましい。

本発明に係るタンパク質糖化反応阻害物質の剤形は特に制限されない。例えば、本発明に係るタンパク質糖化反応阻害物質の粉砕物を、散剤、顆粒剤、錠剤、トローチ剤、丸剤などの有効成分として用いることができる。また、その水溶液やアルコール溶液を、液剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤などとして用いることもできる。有効成分に体内吸収され難いものが含まれている場合には、注射剤として用いることもあり得る。また、ＡＧＥｓは皮膚の弾力性などに悪影響を与えるため、外用剤として皮膚に直接塗布することが考えられる。かかる外用剤の剤形としては、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、パップ剤、リニメント剤、エアゾール剤などを挙げることができる。

本発明に係るタンパク質糖化反応阻害物質は、製剤化などのために他の成分を添加混合してもよい。他の成分としては、例えば、基剤、賦形剤、着色剤、滑沢剤、矯味剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、安定剤、保存剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、抗酸化剤、佐薬、緩衝剤、ｐＨ調整剤、甘味料、香料などが挙げられる。

本発明に係るタンパク質糖化反応阻害物質の使用量は、予防的使用であるか治療的使用であるか、患者の重篤度、その他の状態、年齢、性別などに応じて適宜調整すべきであり、特に制限されない。例えば、本発明に係るタンパク質糖化反応阻害物質は、服用する場合には固形分換算で１日あたり１０ｍｇ以上、外用の場合には１００ｍｇ以上用いることができる。本発明に係るタンパク質糖化反応阻害物質は非常に安全なものであることから、使用量の条件は特に制限されないが、例えば、服用の場合で１日あたり２ｇ以下、外用の場合には５ｇ以下とすることができる。また、１日あたりの使用回数は、１回以上、５回以下程度とすることができる。

本発明に係るタンパク質糖化反応阻害物質は、極めて優れたタンパク質糖化反応阻害効果を示す。よって、タンパク質糖化反応が関与する疾患や症状の予防や治療に有効である。かかる疾患や症状としては、例えば、肌のシワ、シミ、クスミ、たるみ等；白内障、動脈硬化、腎機能障害などの糖尿病性合併症；記憶障害や認知症などの老化；がん等を挙げることができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

実施例１：碁石茶のＡＧＥｓ産生抑制効果
碁石茶粉末（スキンキュア・ラボ社製）４ｇと精製水１０００ｍＬを混合し、超音波を照射しつつ１００℃で５分間抽出した。次いで、容器を綿で栓をし、濾過することにより得た濾液を減圧濃縮し、水抽出物を得た。水抽出物４．８９ｇを精製水５００ｍＬに溶解し、得られた水溶液を酢酸エチル１８０ｍＬで３回抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムで水層と完全に分離した後に減圧濃縮し、酢酸エチル画分０．４７ｇを得た。

上記水層を減圧濃縮した後、精製水５００ｍＬに溶解し、得られた水溶液をｎ－ブタノール１８０ｍＬで３回抽出した。ｎ－ブタノール抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムで水層と完全に分離した後に減圧濃縮し、ｎ－ブタノール画分０．９４ｇを得た。また、残った水層を減圧濃縮し、水画分３．０２ｇを得た。

１％ウシ血清アルブミン水溶液５０μＬに、糖分解物である５００ｍＭグリセルアルデヒド水溶液１０μＬを加えた。更に、上記水抽出物と各画分を３００μｇ／ｍＬの割合で添加し、３７℃で２４時間インキュベートした後、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで蛍光強度を測定した。比較のために、ネガティブコントロールとして何も加えずに同様に蛍光強度を測定し、ポジティブコントロールとして２０μＭの割合でアミノグアニジンを添加して蛍光強度を測定した。測定は３例ずつ行った。ネガティブコントロールの蛍光強度を１００％として相対割合を算出し、ＡＧＥｓ産生抑制効果を評価した。結果を図１に示す。図１中、「＊」はＤｕｎｎｅｔ’ｓｔｅｓｔにおいてＰ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意差があることを示す。また、得られた結果より、糖化反応阻害活性ＩＣ₅₀（ｍｇ／ｍＬ）を求めた。結果を表１に示す。

図１と表１に示す結果の通り、化学合成化合物であるアミノグアニジンには及ばないものの、酢酸エチル画分は、碁石茶水抽出物や他の画分と比較して極めて優れたＡＧＥｓ産生抑制効果を示した。

Claims

タンパク質の糖化反応を阻害する物質の製造方法であって、
茶葉を好気的発酵した後に嫌気的発酵して碁石茶を得る工程、
上記碁石茶を水系溶媒により抽出して水系溶媒抽出物を得る工程、および、
上記水系溶媒抽出物をエステル系溶媒により抽出する工程を含み、
上記水系溶媒が、水、または水とメタノールもしくはエタノールとの混合溶媒であり、
上記エステル系溶媒が、酢酸エチル、酢酸ブチルおよび酢酸アミルからなる群から選択される１以上のエステル系溶媒であることを特徴とする方法。
上記水系溶媒として熱水を用いる請求項１に記載の方法。
上記水系溶媒抽出物の水溶液を上記エステル系溶媒により抽出する請求項１または２に記載の方法。
タンパク質の糖化反応を阻害する上記物質が飲食品の成分として用いられるものである請求項１～３のいずれかに記載の方法。
タンパク質の糖化反応を阻害する上記物質が外用剤の成分として用いられるものである請求項１～３のいずれかに記載の方法。