CN110790777B - 一种长春新碱类化合物杂质及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种长春新碱类化合物杂质及其制备方法与应用，包括如下步骤：按比例在长春花总碱硫酸盐中加入丙酮、乙酸和乙酸酐后搅拌；之后缓慢滴加已配制好浓硫酸、重铬酸钾和水的混合溶液，反应完全后调节至碱性，经过萃取、蒸发、浓缩、提纯后获得所述长春新碱类化合物杂质，为硫酸长春新碱杂质检测定量及定性分析提供了参比或对照。

Description

一种长春新碱类化合物杂质及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种长春新碱类化合物杂质及其制备方法与应用。
背景技术
长春花(Catharanthus roseus)是夹竹桃科草本植物，在民间被广泛用于止血、止痛、清洗伤口以及坏血病和糖尿病的治疗。20世纪50年代末，Noble等人发现了具有显著抗肿瘤活性的长春碱(Vinblastine，VLB)和长春新碱(Vincristine，VCR)，并且临床使用至今。
Figure BDA0002246043480000011
长春新碱药物主要作用于细胞增殖周期的G1、S及M期,并对M期有延缓作用,能干扰增殖细胞纺锤体的形成,使有丝分裂停止于中期,并具有免疫抑制作用,为细胞周期特异性抗肿瘤药物。“通过抑制微管蛋白装配,防止纺锤体的形成,从而使有丝分裂停止于中期”这一机制被众多学者所认可。
欧洲药典记载了长春新碱合成过程中的含有的中间体杂质、异构体杂质、降解杂质及等8个杂质，各长春新碱杂质结构如下：
Figure BDA0002246043480000021
然而，长春新碱由于其结构与制备过程的复杂性，仍有一些容易产生的杂质未被充分认识与重视，对长春新碱合成工艺过程中产生的新颖结构的杂质的研究是一个动态发展和不断推进的过程。在药物研发和质量控制的过程当中，新杂质的发现和制备往往对于该药物品种的质量研究具有不容忽视的重要作用。
发明内容
本发明的一个目的在于，确定一种长春新碱类化合物杂质的化学结构，应用于长春新碱生产中的杂质定性及定量分析，从而可以提高长春新碱的质量标准，为长春新碱的安全用药提供重要指导意义。
本发明的另一个目的在于，提供一种长春新碱类化合物杂质的制备方法，能够稳定地制备和供应该杂质，为相关研究与对照提供基础。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种长春新碱类化合物杂质，其特征在于，具有如下所示化学结构：
Figure BDA0002246043480000031
一种上述长春新碱类化合物杂质的制备方法，包括如下步骤：按比例在长春花总碱硫酸盐中加入丙酮、乙酸和乙酸酐后搅拌；之后缓慢滴加已配制好浓硫酸、重铬酸钾和水的混合溶液，反应完全后调节至碱性，经过萃取、蒸发、浓缩、提纯后获得所述长春新碱类化合物杂质。一般利用色谱柱进行二次洗脱提纯。
进一步的，包括如下步骤：
A、粗品-Ⅰ的制备：按比例在反应瓶中加入长春花总碱硫酸盐，加入丙酮、乙酸和乙酸酐后搅拌；将已配制好浓硫酸、重铬酸钾和水的混合溶液在-40～-45℃下缓慢滴加；滴加完毕后反应1～2小时，色谱跟踪检测至所述长春花总碱硫酸盐基本反应完全；保持-40～-45℃下缓慢搅拌，将浓氨水缓慢的滴加至反应罐中，待混合均匀后检测溶液的pH为8～9，静置0.5小时以上，之后将溶液抽至萃取罐用溶剂A进行萃取；萃取完成后进行洗涤、蒸发，控制温度在40±2℃，浓缩至干，得到所述粗品-Ⅰ；
B、粗品-Ⅱ的制备：将所述粗品-Ⅰ用3～4倍体积量的溶剂B进行溶解，完全溶解后利用正相色谱柱进行第一次梯度洗脱，收集目标柱层析流分-Ⅰ，在40±2℃浓缩至干，得到所述粗品-Ⅱ；
C、长春新碱类化合物杂质的制备：将所述粗品-Ⅱ用2倍体积量的溶剂C进行溶解，完全溶解后利用反相色谱柱进行第二次梯度洗脱，收集目标柱层析流分-Ⅱ，在40±2℃浓缩至干，得到所述长春新碱类化合物杂质。
步骤A所用调节pH的浓氨水，一般为含氨25％～28％的水溶液，调节至pH为8～9即可。反应过程保持-40～-45℃，低温环境可以使反应更温和地进行，有效降低副反应的发生。
化学反应完成后制备出的粗品-Ⅰ，其目标产物含量仅在8～10％之间，需要进行进一步的纯化和分离。利用正相色谱柱完成第一次梯度洗脱后得到的粗品-Ⅱ，其目标产物含量达到60～70％，相对于粗品-Ⅰ已经有了较大程度的提高，但仍难以满足定性等研究试验的要求。再进一步地利用反相色谱柱完成第二次梯度洗脱，经过一反一正的二次色谱柱梯度洗脱，得到目标产物含量95％以上的长春新碱类化合物杂质，能满足各项检测研究的要求。
进一步的，所述比例为：长春花总碱硫酸盐：丙酮：乙酸：乙酸酐：浓硫酸：重铬酸钾：水＝1g：9～14ml：1.5～2.5ml：3～6ml：0.5～0.8ml：0.5～1g：50～100ml；所述浓硫酸的摩尔浓度为18～19mol/L。
进一步的，步骤A所述色谱跟踪为薄层色谱跟踪，使用体积比60:30:5:6的石油醚-三氯甲烷-丙酮-二乙胺混合溶液进行展开。
进一步的，所述步骤A中：所述溶剂A为三氯甲烷；所述洗涤为使用纯化水洗涤；所述蒸发为使用旋转蒸发器蒸发，减压浓缩至干，得到所述粗品-Ⅰ。
进一步的，在所述步骤B中：所述溶剂B为三氯甲烷；所述第一次梯度洗脱的具体操作是，在硅胶层析柱上，使用三氯甲烷-甲醇以体积比99:1、98:2、97:3、96:4分四个梯度进行冲洗，每一个梯度冲洗5～8个层析柱体积；所述目标柱层析流分-Ⅰ为三氯甲烷-甲醇以体积比96:4梯度进行冲洗获得的柱层析流分。
硅胶是常用的正相色谱填料，极性小的化合物先被分离，极性大的后被分离。通过在更换洗脱梯度的同时，对每个梯度分离流分逐个进行薄层色谱点板测试，最终确定步骤B的操作中，目标产物主要在三氯甲烷-甲醇以体积比96：4的梯度中被分离。
进一步的，在所述步骤C中：所述溶剂C为乙腈；所述第二次梯度洗脱的具体操作是，在C18-ODS反相层析柱上，使用乙腈-水以体积比30:70、40:60、50:50分三个梯度进行冲洗，每一个梯度冲洗4～6个层析柱体积；所述目标柱层析流分-Ⅱ为乙腈-水以体积比40:60梯度进行冲洗获得的柱层析流分。
ODS填料与硅胶填料相反，是一种反相色谱填料，极性大的化合物先被分离，极性小的后被分离。通过在更换洗脱梯度的同时，对每个梯度分离流分逐个进行薄层色谱点板测试，最终确定步骤C的操作中，目标产物主要在乙腈-水以体积比40:60的梯度中被分离。
经过一反一正的二次色谱柱梯度洗脱，严格选取所保留流分，最大程度地除去了极性与目标产物不同的物质，得到长春新碱类化合物杂质，检测结果长春新碱类化合物杂质含量为95％以上。所用的高效液相色谱检测条件为：柱长及型号：SinoChrom ODS AP,4.6ⅹ250mm，5μm，柱温：35℃，HPLC检测方法：流动相为二乙胺溶液(取二乙胺14mL，加水986mL，混匀，用磷酸调节pH至7.5)-乙腈(42：58)。流速：1mL/min，检测波长：297nm。
长春新碱类化合物杂质的结构鉴定：根据高分辨TOF-MS、核磁共振H1-NMR和C13-NMR、核磁共振二维H1-H1COSY、HSQC、HMBC、NOESY等现代化合物鉴定技术。鉴定出长春新碱杂质为1-N-乙酰基-16-氨基-1-羟基长春碱。该结构经过查阅文献为新化合物，具体归属与结构如下：
Figure BDA0002246043480000061
表1 1H NMR和13C NMR测试数据(500M，CDCl3)和归属
Figure BDA0002246043480000071
长春新碱类化合物杂质结构—(1-N-乙酰基-16-氨基-1-羟基长春碱)
一种上述长春新碱类化合物杂质的应用，作为标准品或对照品用于硫酸长春新碱原料和/或制剂中的含量分析与质量控制。
进一步的，所述质量控制利用色谱柱进行洗脱除去所述长春新碱类化合物杂质。
由于在合成步骤中利用色谱柱洗脱对该杂质进行了提纯，获知其包括极性在内的相关信息，确定了其在正反色谱柱中的贮留流份，可以方便地利用这一性质将其除去。
与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
1、确认并表征了一种在硫酸长春新碱工业化生产中易产生的新杂质结构；
2、本申请通过以合成、分离的手段制备并验证了该杂质的结构，为硫酸长春新碱杂质检测定量及定性分析提供了参比或对照。
3、本申请通过合成该新结构杂质，获知其部分性质特征，并针对已知的特征提供了一种除去该新杂质的方法。
附图说明
图1为长春新碱类化合物杂质(1-N-乙酰基-16-氨基-1-羟基长春碱)高分辨质谱图；
图2为长春新碱类化合物杂质(1-N-乙酰基-16-氨基-1-羟基长春碱)1HNMR核磁图谱；
图3为长春新碱类化合物杂质(1-N-乙酰基-16-氨基-1-羟基长春碱)13CNMR核磁图谱；
图4为实施例1长春新碱类化合物杂质(1-N-乙酰基-16-氨基-1-羟基长春碱)HPLC图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
一种长春新碱类化合物杂质的其制备方法，包括以下步骤：
A、长春碱杂质粗品-Ⅰ的制备：在30L反应罐中加入长春花总碱硫酸盐250g，加入3000ml丙酮，500ml乙酸，1000ml乙酸酐，搅拌。将已配制好150ml浓硫酸，200g重铬酸钾，15L饮用水的混合溶液在-40℃下滴加。滴加完毕后反应1-2小时，TLC跟踪检测至原料长春碱基本反应完全(展开剂，石油醚：三氯甲烷：丙酮：二乙胺＝60:30:5:6)。保持-40℃冰浴下缓慢搅拌，将1500ml浓氨水缓慢的滴加至反应罐中,待混合均匀后检测溶液的pH为8-9，静置半小时以上后将溶液抽至萃取罐，用10L×5三氯甲烷萃取。将萃取完的三氯甲烷溶液用30L纯化水分三次洗涤，洗涤后的三氯甲烷转至旋转蒸发器，控制温度在40℃，减压浓缩至干，得265g长春碱杂质粗品-Ⅰ。
B、长春碱杂质粗品-Ⅱ的制备：将长春碱杂质粗品-Ⅰ用3-4倍量的三氯甲烷混合液进行溶解，完全溶解后加至4kg的硅胶层析柱上。用三氯甲烷-甲醇(99:1；98:2；97:3；96:4)梯度洗脱，每一个梯度冲洗5-8个层析柱体积。收集三氯甲烷-甲醇96:4的柱层析流分，40℃浓缩至干，得到29g长春碱杂质粗品-Ⅱ。
C、长春新碱类化合物杂质：将得到的长春碱杂质粗品-Ⅱ用60ml乙腈溶解后，加至600g的C18-ODS反相层析柱上。用乙腈-水(30:70；40:60；50:50)梯度洗脱，每一个梯度冲洗4-6个柱体积。收集乙腈-水40:60的柱层析流分，40℃浓缩至干，得到18g长春新碱类化合物杂质，HPLC含量检测为96.81％。高分辨质谱图如图1所示，1HNMR核磁图谱如图2所示，13CNMR核磁图谱如图3所示，可以确定其结构为：
Figure BDA0002246043480000091
。以实施例1为代表，HPLC图如图4所示。
实施例2
一种长春新碱类化合物杂质的制备方法，包括以下步骤：
A、长春碱杂质粗品-Ⅰ的制备：在30L反应罐中加入长春花总碱硫酸盐250g，加入2250ml丙酮，375ml乙酸，750ml乙酸酐，搅拌。将已配制好125ml浓硫酸，125g重铬酸钾，12.5L饮用水的混合溶液在-42℃下滴加。滴加完毕后反应1-2小时，TLC跟踪检测至原料长春碱基本反应完全(展开剂，石油醚：三氯甲烷：丙酮：二乙胺＝60:30:5:6)。保持-42℃冰浴下缓慢搅拌，将1500ml浓氨水缓慢的滴加至反应罐中,待混合均匀后检测溶液的pH为8-9，静置半小时以上后将溶液抽至萃取罐，用10L×5三氯甲烷萃取。将萃取完的三氯甲烷溶液用30L纯化水分三次洗涤，洗涤后的三氯甲烷转至旋转蒸发器，控制温度在42℃，减压浓缩至干，得268g长春碱杂质粗品-Ⅰ。
B、长春碱杂质粗品-Ⅱ的制备：将长春碱杂质粗品-Ⅰ用3-4倍量的三氯甲烷混合液进行溶解，完全溶解后加至4kg的硅胶层析柱上。用三氯甲烷-甲醇(99:1；98:2；97:3；96:4)梯度洗脱，每一个梯度冲洗5-8个层析柱体积。收集三氯甲烷-甲醇96:4的柱层析流分，42℃浓缩至干，得到28g长春碱杂质粗品-Ⅱ。
C、长春新碱类化合物杂质的制备：将得到的长春碱杂质粗品-Ⅱ用60ml乙腈溶解后，加至600g的C18-ODS反相层析柱上。用乙腈-水(30:70；40:60；50:50)梯度洗脱，每一个梯度冲洗4-6个柱体积。收集乙腈-水40:60的柱层析流分，42℃浓缩至干，得到19g长春新碱类化合物杂质，HPLC含量检测为97.13％。高分辨质谱图如图1所示，1HNMR核磁图谱如图2所示，13CNMR核磁图谱如图3所示，可以确定其结构为：
Figure BDA0002246043480000101
实施例3
一种长春新碱类化合物杂质的制备方法，包括以下步骤：
A、长春碱杂质粗品-Ⅰ的制备：在100L反应罐中加入长春花总碱硫酸盐750g，加入10.5L丙酮，1875ml乙酸，4500ml乙酸酐，搅拌。将已配制好600ml浓硫酸，750g重铬酸钾，75L饮用水的混合溶液在-45℃下滴加。滴加完毕后反应1-2小时，TLC跟踪检测至原料长春碱基本反应完全(展开剂，石油醚：三氯甲烷：丙酮：二乙胺＝60:30:5:6)。保持-45℃冰浴下缓慢搅拌，将4500ml浓氨水缓慢的滴加至反应罐中,待混合均匀后检测溶液的pH为8-9，静置半小时以上后将溶液抽至萃取罐，用30L×5三氯甲烷萃取。将萃取完的三氯甲烷溶液用90L纯化水分三次洗涤，洗涤后的三氯甲烷转至旋转蒸发器，控制温度在38℃，减压浓缩至干，得801g长春碱杂质粗品-Ⅰ。
B、长春碱杂质粗品-Ⅱ的制备：将长春碱杂质粗品-Ⅰ用3-4倍量的三氯甲烷混合液进行溶解，完全溶解后平均加至三根4kg的硅胶层析柱上。用三氯甲烷-甲醇(99:1；98:2；97:3；96:4)梯度洗脱，每一个梯度冲洗5-8个层析柱体积。收集三氯甲烷-甲醇96:4的柱层析流分，38℃浓缩至干，得到86g长春碱杂质粗品-Ⅱ。
C、长春新碱类化合物杂质的制备：将得到的长春碱杂质粗品-Ⅱ用180ml乙腈溶解后，平均加至三根600g的C18-ODS反相层析柱上。用乙腈-水(30:70；40:60；50:50)梯度洗脱，每一个梯度冲洗4-6个柱体积。收集乙腈-水40:60的柱层析流分，38℃浓缩至干，得到56g长春新碱类化合物杂质，HPLC含量检测为96.86％。高分辨质谱图如图1所示，1HNMR核磁图谱如图2所示，13CNMR核磁图谱如图3所示，可以确定其结构为：
Figure BDA0002246043480000111
实施例4
以本申请所制备长春新碱类化合物杂质做为标准品，对广州白云山汉方现代药业有限公司多个批次的硫酸长春新碱产品进行抽样检测，发现均存在一可疑杂质与本申请标准品具有相同出峰，疑似为本申请所制备长春新碱类化合物杂质，含量如下表所示：
Figure BDA0002246043480000112
Figure BDA0002246043480000121
经分析确定，上述样品中的可疑杂质与本申请所制备长春新碱类化合物杂质具有相同结构，可判定其为1-N-乙酰基-16-氨基-1-羟基长春碱，含量约占产品0.5～1.0％之间，对产品质量有一定影响。若使用了本申请提供的除杂方法，可对样品质量做进一步地提升。
不难看出，通过与本申请所制备杂质进行比对与研究，可对今后硫酸长春新碱产品进行更精确地除杂，有效降低硫酸长春新碱产品中的杂质含量，提高硫酸长春新碱产品质量。而本申请所制备杂质可能存在的药理作用也可做进一步地研究。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (4)

1.一种长春新碱类化合物杂质，其特征在于，具有如下所示化学结构：
Figure FDA0002947124170000011
。
2.一种根据权利要求1所述长春新碱类化合物杂质的制备方法，包括如下步骤：
A、粗品-Ⅰ的制备：按比例在反应瓶中加入长春花总碱硫酸盐，加入丙酮、乙酸和乙酸酐后搅拌；将已配制好浓硫酸、重铬酸钾和水的混合溶液在-40℃～-45℃下缓慢滴加；滴加完毕后反应1～2小时，色谱跟踪检测至所述长春花总碱硫酸盐基本反应完全；保持-40℃～-45℃下缓慢搅拌，将浓氨水缓慢的滴加至反应罐中，待混合均匀后检测溶液的pH为8～9，静置0.5小时以上，之后将溶液抽至萃取罐用溶剂A进行萃取；萃取完成后进行洗涤、蒸发，控制温度在40±2℃，浓缩至干，得到所述粗品-Ⅰ；
B、粗品-Ⅱ的制备：将所述粗品-Ⅰ用3～4倍体积量的溶剂B进行溶解，完全溶解后利用正相色谱柱进行第一次梯度洗脱，收集目标柱层析流分-Ⅰ，在40±2℃浓缩至干，得到所述粗品-Ⅱ；
C、长春新碱类化合物杂质的制备：将所述粗品-Ⅱ用2倍体积量的溶剂C进行溶解，完全溶解后利用反相色谱柱进行第二次梯度洗脱，收集目标柱层析流分-Ⅱ，在40±2℃浓缩至干，得到所述长春新碱类化合物杂质；
所述比例为：长春花总碱硫酸盐：丙酮：乙酸：乙酸酐：浓硫酸：重铬酸钾：水＝1g：9～14ml：1.5～2.5ml：3～6ml：0.5～0.8ml：0.5～1g：50～100ml；所述浓硫酸的摩尔浓度为18～19mol/L；
在所述步骤A中：所述色谱跟踪为薄层色谱跟踪，使用体积比60:30:5:6的石油醚-三氯甲烷-丙酮-二乙胺混合溶液进行展开；所述溶剂A为三氯甲烷；所述洗涤为使用纯化水洗涤；所述蒸发为使用旋转蒸发器蒸发，减压浓缩至干，得到所述粗品-Ⅰ；
在所述步骤B中：所述溶剂B为三氯甲烷；所述第一次梯度洗脱的具体操作是，在硅胶层析柱上，使用三氯甲烷-甲醇以体积比99:1、98:2、97:3、96:4分四个梯度进行冲洗，每一个梯度冲洗5～8个层析柱体积；所述目标柱层析流分-Ⅰ为三氯甲烷-甲醇以体积比96:4梯度进行冲洗获得的柱层析流分；
在所述步骤C中：所述溶剂C为乙腈；所述第二次梯度洗脱的具体操作是，在C18-ODS反相层析柱上，使用乙腈-水以体积比30:70、40:60、50:50分三个梯度进行冲洗，每一个梯度冲洗4～6个层析柱体积；所述目标柱层析流分-Ⅱ为乙腈-水以体积比40:60梯度进行冲洗获得的柱层析流分。
3.一种根据权利要求1所述长春新碱类化合物杂质的应用，其特征在于，作为标准品或对照品用于硫酸长春新碱原料和/或制剂中的含量分析与质量控制。
4.根据权利要求3所述长春新碱类化合物杂质的应用，其特征在于，所述质量控制为利用色谱柱进行洗脱除去所述长春新碱类化合物杂质。
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