CN110092809B - 一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法，包括以下步骤：粗提物的制备：巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04‑0.06MPa、温度为40‑60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/10‑1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；常压硅胶柱层析，再次常压硅胶柱层析，第三次常压硅胶柱层析，凝胶柱层析，重结晶。本发明底物廉价易得，工艺简单易行，生产过程环保。

Description

一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法。
背景技术
β-谷甾醇(β-sitosterol)是植物甾醇的主要成分之一，属于四环三帖类化合物，在常温下为白色晶体粉末，无臭无味，熔点可达130—140℃，不溶于水，在一定的有机溶剂中可以溶解，并具有较高的营养价值与生物活性，被广泛应用于医药、食品、保健品及化妆品等领域。近年的研究表明，β-谷甾醇具有明显地降胆固醇、止咳、抗癌、抗炎、抗氧化、防治高血压等药理作用，其分离方法主要有化学法和物理法。化学法存在反应步骤繁琐、操作难度大、成本高且回收率低等缺陷，不能达到理想的分离结果，因而难以实现规模化的工业生产；主要应用的物理法有分子蒸馏法、高效液相法、吸附法、溶剂结晶法等，其中溶剂结晶法具有操作简便、工艺流程短简单、产品纯度高、溶剂易于回收、适合工业化生产等优点，但仅适合溶解度随温度变化不大的物质。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种底物廉价易得，工艺简单易行，生产过程环保的利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法。
本发明目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明的一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）粗提物的制备
巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04-0.06MPa、温度为40-60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/10-1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；
（2）常压硅胶柱层析
将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与40-80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，70℃水浴挥干乙酸乙酯后上样，在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚，体积比为100%石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇进行梯度洗脱，流速为10-20 mL/min，分段收集洗脱液,通过薄层层析色谱（TLC）分析，Rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；
（3）再次常压硅胶柱层析
浓缩液进行抑菌活性测定，其中对青枯雷尔氏菌活性抑菌率为75%-85%的浓缩液再次进行常压硅胶柱层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=30:1、10:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；
（4）第三次常压硅胶柱层析
浓缩组分又再次进行硅胶层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=5:1、2:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；
（5）凝胶柱层析
将目标粗品先用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液溶解，然后进行葡聚糖凝胶柱层析，用体积比为氯仿：纯甲醇=1:1的氯甲溶液反复洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，其中洗脱组分中有肉眼可见的白色晶体析出；
（6）重结晶
对洗脱组分析出得到的白色晶体，采用重结晶的方法纯化，得到β-谷甾醇。
上述的一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β-谷甾醇的方法，其中：巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌L2（Bacillus megaterium L2），已于2012年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国 武汉 武汉大学），保藏号为：CCTCC NO：M2012381。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明利用巨大芽孢杆菌L2菌体制备β-谷甾醇，巨大芽孢杆菌L2（Bacillus megaterium L2）菌株来源可靠，对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，容易培养和保存，该技术生产操作简单，对环境友好。
附图说明
图1是实施例1提取的β-谷甾醇的1H NMR谱图；
图2是实施例2提取的β-谷甾醇的13C-NMR谱图。
具体实施方式
实施例1：
一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β-谷甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）粗提物的制备
巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04MPa、温度为40℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/10后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；
（2）常压硅胶柱层析
将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与40目硅胶按体积比为1:1.2拌样，水浴(70℃)挥干乙酸乙酯后上样，在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚，体积比为100%石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇进行梯度洗脱，流速为10 mL/min，收集洗脱液,通过薄层层析色谱（TLC）分析，Rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；
（3）再次常压硅胶柱层析
浓缩液进行抑菌活性测定，其中对青枯雷尔氏菌活性抑菌率为75%的浓缩液又进行常压硅胶柱层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=30:1、10:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；
（4）第三次常压硅胶柱层析
浓缩组分又再次进行硅胶层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=5:1、2:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；
（5）凝胶柱层析
将目标粗品先用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液溶解，然后进行葡聚糖凝胶柱层析，用体积比为氯仿：纯甲醇=1:1的氯甲溶液反复洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，其中洗脱组分中有肉眼可见的白色晶体析出；
（6）重结晶
对洗脱组分析出得到的白色晶体，采用重结晶的方法纯化，得到β-谷甾醇。
实施例2：
一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β-谷甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）粗提物的制备
巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.05MPa、温度为50℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/8后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；
（2）常压硅胶柱层析
将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与60目硅胶按体积比为1:1.2拌样，水浴(70℃)挥干乙酸乙酯后上样，在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚，体积比为100%石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1 ，100%甲醇进行梯度洗脱，流速为15 mL/min，收集洗脱液,通过薄层层析色谱（TLC）分析，Rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；
（3）再次常压硅胶柱层析
浓缩液进行抑菌活性测定，其中对青枯雷尔氏菌活性抑菌率为80%的浓缩液又进行常压硅胶柱层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=30:1、10:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；
（4）第三次常压硅胶柱层析
浓缩组分又再次进行硅胶层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=5:1、2:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；
（5）凝胶柱层析
将目标粗品先用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液溶解，然后进行葡聚糖凝胶柱层析，用体积比为氯仿：纯甲醇=1:1的氯甲溶液反复洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，其中洗脱组分中有肉眼可见的白色晶体析出；
（6）重结晶
对洗脱组分析出得到的白色晶体，采用重结晶的方法纯化，得到β-谷甾醇。
实施例3：
一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β-谷甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）粗提物的制备
巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.06MPa、温度为60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；
（2）常压硅胶柱层析
将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，水浴(70℃)挥干乙酸乙酯后上样，在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚，体积比为100%石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1 ，100%甲醇进行梯度洗脱，流速为10 mL/min，收集洗脱液,通过薄层层析色谱（TLC）分析，Rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；
（3）再次常压硅胶柱层析
浓缩液进行抑菌活性测定，其中对青枯雷尔氏菌活性抑菌率为85%的浓缩液又进行常压硅胶柱层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=30:1、10:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；
（4）第三次常压硅胶柱层析
浓缩组分又再次进行硅胶层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=5:1、2:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；
（5）凝胶柱层析
将目标粗品先用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液溶解，然后进行葡聚糖凝胶柱层析，用体积比为氯仿：纯甲醇=1:1的氯甲溶液反复洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，其中洗脱组分中有肉眼可见的白色晶体析出；
（6）重结晶
对洗脱组分析出得到的白色晶体，采用重结晶的方法纯化，得到β-谷甾醇。
试验例：
巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium L2）提取物β-谷甾醇的鉴定：
①样品的准备
取0.5 mL氯仿溶解实施例1、2所得白色针晶物纯样品，转入核磁管进行NMR扫描，得到1H-NMR（参见图1）、13C-NMR谱图（参见图2）。
②NMR分析条件
核磁共振：采用ID-PFG探头，扫描宽度（sw）16.0 ppm，中心频率（O1P）：4.9 ppm；脉冲序列s1pul；时间域数据点（td）：32 K；测定温度：303 K；延迟时间（dl）：20 s；采样次数（ns）：32次；窗函数（lh）：0.3 Hz。
③结论：通过NMR检测，从巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium L2）菌体分离提取得到的样品Rf值与标准品一致，该单体化合物为β-谷甾醇（β-sitosterol）。结果见图1、2，1H-NMR ( 500 MHz, CDCl3 ) δ: 5.30 ( 1H, br.d, H-6 ), 3.65 ( 1H, m, H-3 ),0.96 ( 3H, s, H-19 ), 0.88 ( 3H, d, J = 6.6 Hz, H-21 ), 0.82 ( 3H, t, J = 7.5Hz, H-29 ), 0.80 ( 3H, d, J = 6.8 Hz, H-27 ), 0.77 ( 3H, d, J = 6.8 Hz, H-26 ), 0.64 ( 3H, s, H-18 ); 13C-NMR ( 125 MHz, CDCl3 ) δ: 37.2 ( C-1 ), 31.4( C-2 ), 71.6 ( C-3 ), 42.1 ( C-4 ), 140.8 ( C-5 ), 121.6 ( C-6 ), 31.8 (C-7 ), 31.8 ( C-8 ), 50.0 ( C-9 ), 36.4 ( C-10 ), 21.0 ( C-11 ), 39.7 ( C-12 ), 42.2 ( C-13 ), 56.7 ( C-14 ), 24.2 ( C-15 ), 28.2 ( C-16 ), 55.9 (C-17 ), 11.8 ( C-18 ), 19.3 ( C-19 ), 36.1 ( C-20 ), 18.9 ( C-21 ), 33.8 ( C-22 ), 29.0 ( C-23 ), 45.7 ( C-24 ), 25.9 ( C-25 ), 18.7 ( C-26 ), 19.7 (C-27 ), 23.0 ( C-28 ), 11.8 ( C-29 )。故鉴定为β-谷甾醇。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (1)

1.一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法，包括以下步骤：
（1）粗提物的制备
巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04-0.06MPa、温度为40-60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/10-1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；
（2）常压硅胶柱层析
将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与40-80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，70℃水浴挥干乙酸乙酯后上样，在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚，体积比为100%石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇进行梯度洗脱，流速为10-20 mL/min，分段收集洗脱液,通过薄层层析色谱（TLC）分析，Rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；
（3）再次常压硅胶柱层析
浓缩液进行抑菌活性测定，其中对青枯雷尔氏菌活性抑菌率为75%-85%的浓缩液再次进行常压硅胶柱层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=30:1、10:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；
（4）第三次常压硅胶柱层析
浓缩组分又再次进行硅胶层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=5:1、2:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；
（5）凝胶柱层析
将目标粗品先用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液溶解，然后进行葡聚糖凝胶柱层析，用体积比为氯仿：纯甲醇=1:1的氯甲溶液反复洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，其中洗脱组分中有肉眼可见的白色晶体析出；
（6）重结晶
对洗脱组分析出得到的白色晶体，采用重结晶的方法纯化，得到β-谷甾醇；
其中：巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌L2，保藏号为：CCTCC NO：M2012381。
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