CN114933604A - 一种长春新碱类手性化合物杂质及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种长春新碱类手性化合物杂质及其制备方法与应用，包括如下步骤：按比例在长春花总碱硫酸盐中加入丙酮、乙酸和乙酸酐后搅拌；之后缓慢滴加已配制好浓硫酸、重铬酸钾和水的混合溶液，反应完全后调节至碱性，经过萃取、蒸发、浓缩、提纯后获得所述长春新碱类手性化合物杂质，为硫酸长春新碱杂质检测定量及定性分析提供了参比或对照。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种长春新碱类手性化合物杂质及其制备方法与应用。
背景技术
长春花(Catharanthus roseus)是夹竹桃科草本植物，在民间被广泛用于止血、止痛、清洗伤口以及坏血病和糖尿病的治疗。20世纪50年代末，Noble等人发现了具有显著抗肿瘤活性的长春碱(Vinblastine，VLB)和长春新碱(Vincristine，VCR)，并且临床使用至今。
长春新碱药物主要作用于细胞增殖周期的G1、S及M期,并对M期有延缓作用,能干扰增殖细胞纺锤体的形成,使有丝分裂停止于中期,并具有免疫抑制作用,为细胞周期特异性抗肿瘤药物。“通过抑制微管蛋白装配,防止纺锤体的形成,从而使有丝分裂停止于中期”这一机制被众多学者所认可。
欧洲药典记载了长春新碱合成过程中的含有的中间体杂质、异构体杂质、降解杂质及等8个杂质，各长春新碱杂质结构如下：
然而，长春新碱由于其结构与制备过程的复杂性，仍有一些容易产生的杂质未被充分认识与重视，对长春新碱合成工艺过程中产生的新颖结构的杂质的研究是一个动态发展和不断推进的过程。在药物研发和质量控制的过程当中，新杂质的发现和制备往往对于该药物品种的质量研究具有不容忽视的重要作用。
发明内容
本发明的一个目的在于，确定一种长春新碱类手性化合物杂质的化学结构，应用于长春新碱生产中的杂质定性及定量分析，从而可以提高长春新碱的质量标准，为长春新碱的安全用药提供重要指导意义。
本发明的另一个目的在于，提供一种长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，能够稳定地制备和供应该杂质，为相关研究与对照提供基础。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种长春新碱类手性化合物杂质，具有如下所示化学结构：
一方面，目前已知的长春新碱类化合物中，尚未发现呈手性异构的成对化合物存在；另一方面，目前已知的长春新碱类化合物中，也未见到17位置为纯粹的氢原子、不含有任何取代基的化合物存在。本发明一举填补上述两方面的空白，虽然现阶段仅将其视为杂质用于硫酸长春新碱原料和/或制剂中的含量分析与质量控制，但随着研究的进一步深入，也有望以此为契机发现长春新碱类化合物新的性能与效果，对长春新碱类化合物的研究具有里程碑式的意义。
一种上述长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，包括如下步骤：
A、粗品-Ⅰ的制备：按比例在长春花总碱硫酸盐中加入丙酮、乙酸和乙酸酐后搅拌；之后缓慢滴加已配制好浓硫酸、重铬酸钾和水的混合溶液，反应完全后调节至碱性，经过萃取、蒸发、浓缩、得到所述粗品-Ⅰ；
B、粗品-Ⅱ的制备：将所述粗品-Ⅰ用三氯甲烷进行溶解，完全溶解后，在硅胶层析柱上进行第一次梯度洗脱，使用三氯甲烷-甲醇以体积比99:1、98:2、97:3、96:4分四个梯度进行冲洗，每一个梯度冲洗5～8个层析柱体积，收集三氯甲烷-甲醇以体积比98:2梯度进行冲洗获得的柱层析流分，浓缩至干，得到所述粗品-Ⅱ；
C、长春新碱类手性化合物杂质的制备：将所述粗品-Ⅱ做进一步提纯，获得所述长春新碱类手性化合物杂质。
经过检测发现，通过本发明方法制备的长春新碱类手性化合物杂质，R构型与S构型按1:1较为稳定地存在，且彼此之间难以分离，这在过去的杂质中是不曾见过的现象。
硅胶是常用的正相色谱填料，极性小的化合物先被分离，极性大的后被分离。通过在更换洗脱梯度的同时，对每个梯度分离流分逐个进行薄层色谱点板测试，最终确定步骤B的操作中，目标产物主要在三氯甲烷-甲醇以体积比98：2的梯度中被分离。
优选的，步骤B中，将所述粗品-Ⅰ用3～4倍体积量的三氯甲烷进行溶解；浓缩温度为40±2℃。
优选的，步骤A的具体操作为：按比例在反应瓶中加入长春花总碱硫酸盐，加入丙酮、乙酸和乙酸酐后搅拌；将已配制好浓硫酸、重铬酸钾和水的混合溶液在-40℃～-45℃下缓慢滴加；滴加完毕后反应1～2小时，色谱跟踪检测至所述长春花总碱硫酸盐基本反应完全；保持-40℃～-45℃下缓慢搅拌，将浓氨水缓慢的滴加至反应罐中，待混合均匀后检测溶液的pH为8～9，静置0.5小时以上，之后将溶液抽至萃取罐用溶剂A进行萃取；萃取完成后进行洗涤、蒸发，控制温度在40±2℃，浓缩至干，得到所述粗品-Ⅰ。
步骤A所用调节pH的浓氨水，一般为含氨25％～28％的水溶液，调节至pH为8～9即可。反应过程保持-40～-45℃，低温环境可以使反应更温和地进行，有效降低副反应的发生。
优选的，步骤A中：所述色谱跟踪为薄层色谱跟踪，使用体积比60:30:5:6的石油醚-三氯甲烷-丙酮-二乙胺混合溶液进行展开。
优选的，步骤A中：所述溶剂A为三氯甲烷；所述洗涤为使用纯化水洗涤；所述蒸发为使用旋转蒸发器蒸发，减压浓缩至干，得到所述粗品-Ⅰ。
优选的，步骤A中，所述比例为：长春花总碱硫酸盐：丙酮：乙酸：乙酸酐：浓硫酸：重铬酸钾：水＝1g：9～14ml：1.5～2.5ml：3～6ml：0.5～0.8ml：0.5～1g：50～100ml；所述浓硫酸的摩尔浓度为18～19mol/L。
优选的，步骤C的具体操作为：将所述粗品-Ⅱ溶解，完全溶解后利用反相色谱柱进行第二次梯度洗脱，收集目标柱层析流分-Ⅱ，在40±2℃浓缩至干，得到所述长春新碱类手性化合物杂质。
优选的，步骤C中：将所述粗品-Ⅱ用2倍体积量的乙腈进行溶解；所述第二次梯度洗脱的具体操作是，在C18-ODS反相层析柱上，使用乙腈-水以体积比30:70、40:60、50:50分三个梯度进行冲洗，每一个梯度冲洗4-6个层析柱体积；所述目标柱层析流分-Ⅱ为乙腈-水以体积比50:50梯度进行冲洗获得的柱层析流分。
化学反应完成后制备出的粗品-Ⅰ，其目标产物含量仅在3～5％之间，需要进行进一步的纯化和分离。利用正相色谱柱完成第一次梯度洗脱后得到的粗品-Ⅱ，其目标产物含量达到30～40％，相对于粗品-Ⅰ已经有了较大程度的提高，但仍难以满足定性等研究试验的要求。再进一步地利用反相色谱柱完成第二次梯度洗脱，经过一反一正的二次色谱柱梯度洗脱，得到目标产物含量95％以上的长春新碱类手性化合物杂质，能满足各项检测研究的要求。
ODS填料与硅胶填料相反，是一种反相色谱填料，极性大的化合物先被分离，极性小的后被分离。通过在更换洗脱梯度的同时，对每个梯度分离流分逐个进行薄层色谱点板测试，最终确定步骤C的操作中，目标产物主要在乙腈-水以体积比50:50的梯度中被分离
经过一反一正的二次色谱柱梯度洗脱，严格选取所保留流分，最大程度地除去了极性与目标产物不同的物质，得到长春新碱类手性化合物杂质，检测结果长春新碱类手性化合物杂质含量为95.85％。
所用的高效液相色谱检测条件为：柱长及型号：SinoChrom ODS AP,4.6ⅹ250mm，5μm，柱温：35℃，HPLC检测方法：流动相为二乙胺溶液(取二乙胺14mL，加水986mL，混匀，用磷酸调节pH至7.5)-乙腈(42：58)。流速：1mL/min，检测波长：297nm。
长春新碱类手性化合物杂质的结构鉴定：根据高分辨TOF-MS、核磁共振H1-NMR和C13-NMR、核磁共振二维H1-H1COSY、HSQC、HMBC、NOESY等
现代化合物鉴定技术。鉴定出长春新碱杂质为1-氢代-17-去乙酰基脱氧长春新碱。该化合物在1位手性N原子的两种构型经过查阅文献均为新化合物，具体归属与结构如下：
表1 1-(R)氢代-17-去乙酰基脱氧长春新碱
1H NMR和13C NMR测试数据(500M，CDCl3)和归属
表2 1-(S)氢代-17-去乙酰基脱氧长春新碱
1H NMR和13C NMR测试数据(500M，CDCl3)和归属
一种上述长春新碱类手性化合物杂质的应用，作为标准品或对照品用于硫酸长春新碱原料和/或制剂中的含量分析与质量控制。
质量控制，例如利用色谱柱进行洗脱除去所述长春新碱类手性化合物杂质。尽管目前无法进行R构型与S构型的分离，但由于在合成步骤中利用色谱柱洗脱对该手性化合物杂质进行了提纯，获知其包括极性在内的相关信息，确定了其在正反色谱柱中的贮留流份，可以方便地利用这一性质将其除去。
与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
1、确认并表征了一种在硫酸长春新碱工业化生产中易产生的新杂质；
2、本申请通过以合成、分离的手段制备并验证了该手性化合物杂质的结构，为硫酸长春新碱杂质检测定量及定性分析提供了参比或对照。
3、本申请通过合成该新结构杂质，获知其部分性质特征，并针对已知的特征提供了一种除去该新杂质的方法。
4、本申请首次发现了长春新碱手性化合物杂质，有望以此为契机发现长春新碱类化合物新的性能与效果，对长春新碱类化合物的研究具有里程碑式的意义。
附图说明
图1为长春新碱类手性化合物杂质(1-氢代-17-去乙酰基脱氧长春新碱)高分辨质谱图；
图2为长春新碱类手性化合物杂质(1-氢代-17-去乙酰基脱氧长春新碱)1HNMR核磁图谱；
图3为长春新碱类手性化合物杂质(1-氢代-17-去乙酰基脱氧长春新碱)13CNMR核磁图谱；
图4为实施例1长春新碱类手性化合物杂质(1-氢代-17-去乙酰基脱氧长春新碱)HPLC图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
一种长春新碱类手性化合物杂质的其制备方法，包括以下步骤：
A、长春新碱杂质粗品-Ⅰ的制备：在30L反应罐中加入长春花总碱硫酸盐250g，加入3000ml丙酮，500ml乙酸，1000ml乙酸酐，搅拌。将已配制好150ml浓硫酸，200g重铬酸钾，15L饮用水的混合溶液在-40～-45℃下滴加。滴加完毕后反应1-2小时，TLC跟踪检测至原料长春碱基本反应完全(展开剂，石油醚：三氯甲烷：丙酮：二乙胺＝60:30:5:6)。保持-40～-45℃冰浴下缓慢搅拌，将1500ml浓氨水缓慢的滴加至反应罐中,待混合均匀后检测溶液的pH为8-9，静置半小时后将溶液抽至萃取罐，用10L×5三氯甲烷萃取。将萃取完的三氯甲烷溶液用30L纯化水分三次洗涤，洗涤后的三氯甲烷转至旋转蒸发器，控制温度在40±2℃，减压浓缩至干，得270g长春新碱杂质粗品-Ⅰ。
B、长春新碱杂质粗品-Ⅱ的制备：将长春新碱杂质粗品-Ⅰ用3-4倍量的三氯甲烷混合液进行溶解，完全溶解后加至4kg的硅胶层析柱上。用三氯甲烷-甲醇(99:1；98:2；97:3；96:4)梯度洗脱，每一个梯度冲洗5-8个层析柱体积。收集三氯甲烷-甲醇98:2的柱层析流分，40±2℃浓缩至干，得到33g长春新碱杂质粗品-Ⅱ。
C、长春新碱类手性化合物杂质：将得到的长春新碱杂质粗品-Ⅱ用60ml乙腈溶解后，加至600g的C18-ODS反相层析柱上。用乙腈-水(30:70；40:60；50:50)梯度洗脱，每一个梯度冲洗4-6个柱体积。收集乙腈-水50:50的柱层析流分，40±2℃浓缩至干，得到8.5g长春新碱类手性化合物杂质，HPLC含量检测为95.85％。高分辨质谱图如图1所示，1HNMR核磁图谱如图2所示，13CNMR核磁图谱如图3所示，可以确定其结构为：
R构型与S构型按1:1较为稳定地存在，且彼此之间难以分离。以实施例1为代表，HPLC图如图4所示。
实施例2
一种长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，包括以下步骤：
A、长春新碱杂质粗品-Ⅰ的制备：在30L反应罐中加入长春花总碱硫酸盐250g，加入3000ml丙酮，500ml乙酸，1000ml乙酸酐，搅拌。将已配制好150ml浓硫酸，200g重铬酸钾，15L饮用水的混合溶液在-40～-45℃下滴加。滴加完毕后反应1-2小时，TLC跟踪检测至原料长春碱基本反应完全(展开剂，石油醚：三氯甲烷：丙酮：二乙胺＝60:30:5:6)。保持-40～-45℃冰浴下缓慢搅拌，将1500ml浓氨水缓慢的滴加至反应罐中,待混合均匀后检测溶液的pH为8-9，静置半小时后将溶液抽至萃取罐，用10L×5三氯甲烷萃取。将萃取完的三氯甲烷溶液用30L纯化水分三次洗涤，洗涤后的三氯甲烷转至旋转蒸发器，控制温度在40±2℃，减压浓缩至干，得268g长春新碱杂质粗品-Ⅰ。
B、长春新碱杂质粗品-Ⅱ的制备：将长春新碱杂质粗品-Ⅰ用3-4倍量的三氯甲烷混合液进行溶解，完全溶解后加至4kg的硅胶层析柱上。用三氯甲烷-甲醇(99:1；98:2；97:3；96:4)梯度洗脱，每一个梯度冲洗5-8个层析柱体积。收集三氯甲烷-甲醇98:2的柱层析流分，40±2℃浓缩至干，得到31g长春新碱杂质粗品-Ⅱ。
C、长春新碱类手性化合物杂质的制备：将得到的长春新碱杂质粗品-Ⅱ用60ml乙腈溶解后，加至600g的C18-ODS反相层析柱上。用乙腈-水(30:70；40:60；50:50)梯度洗脱，每一个梯度冲洗4-6个柱体积。收集乙腈-水50:50的柱层析流分，40±2℃浓缩至干，得到7.9g长春新碱类手性化合物杂质，HPLC含量检测为96.44％。高分辨质谱图如图1所示，1HNMR核磁图谱如图2所示，13CNMR核磁图谱如图3所示，可以确定其结构为：
R构型与S构型按1:1较为稳定地存在，且彼此之间难以分离。
实施例3
一种长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，包括以下步骤：
A、长春新碱杂质粗品-Ⅰ的制备：在100L反应罐中加入长春花总碱硫酸盐750g，加入9L丙酮，1500ml乙酸，3000ml乙酸酐，搅拌。将已配制好450ml浓硫酸，600g重铬酸钾，45L饮用水的混合溶液在-40～-45℃下滴加。滴加完毕后反应1-2小时，TLC跟踪检测至原料长春碱基本反应完全(展开剂，石油醚：三氯甲烷：丙酮：二乙胺＝60:30:5:6)。保持-40～-45℃冰浴下缓慢搅拌，将4500ml浓氨水缓慢的滴加至反应罐中,待混合均匀后检测溶液的pH为8-9，静置半小时后将溶液抽至萃取罐，用30L×5三氯甲烷萃取。将萃取完的三氯甲烷溶液用90L纯化水分三次洗涤，洗涤后的三氯甲烷转至旋转蒸发器，控制温度在40±2℃，减压浓缩至干，得801g长春新碱杂质粗品-Ⅰ。
B、长春新碱杂质粗品-Ⅱ的制备：将长春新碱杂质粗品-Ⅰ用3-4倍量的三氯甲烷混合液进行溶解，完全溶解后平均加至三根4kg的硅胶层析柱上。用三氯甲烷-甲醇(99:1；98:2；97:3；96:4)梯度洗脱，每一个梯度冲洗5-8个层析柱体积。收集三氯甲烷-甲醇98:2的柱层析流分，40±2℃浓缩至干，得到96g长春新碱杂质粗品-Ⅱ。
C、长春新碱类手性化合物杂质的制备：将得到的长春碱杂质粗品-Ⅱ用180ml乙腈溶解后，平均加至三根600g的C18-ODS反相层析柱上。用乙腈-水(30:70；40:60；50:50)梯度洗脱，每一个梯度冲洗4-6个柱体积。收集乙腈-水50:50的柱层析流分，40±2℃浓缩至干，得到25.7g长春新碱类手性化合物杂质，HPLC含量检测为96.71％。高分辨质谱图如图1所示，1HNMR核磁图谱如图2所示，13CNMR核磁图谱如图3所示，可以确定其结构为：
R构型与S构型按1:1较为稳定地存在，且彼此之间难以分离。
实施例4
以本申请所制备长春新碱类化合物杂质做为标准品，对广州白云山汉方现代药业有限公司多个批次的硫酸长春新碱产品进行抽样检测，发现均存在一可疑杂质与本申请标准品具有相同出峰，疑似为本申请所制备长春新碱类化合物杂质，含量如下表所示：
| 品名 | 批号 | 可疑杂质含量 |
| 硫酸长春新碱 | B20190101 | 0.44％ |
| 硫酸长春新碱 | B20190201 | 0.57％ |
| 硫酸长春新碱 | B20190301 | 0.53％ |
| 硫酸长春新碱 | B20190501 | 0.54％ |
| 硫酸长春新碱 | B20191101 | 0.66％ |
| 硫酸长春新碱 | B20200401 | 0.70％ |
| 硫酸长春新碱 | B20201001 | 0.38％ |
| 硫酸长春新碱 | B20201101 | 0.48％ |
| 硫酸长春新碱 | B20210102 | 0.54％ |
| 硫酸长春新碱 | B20210401 | 0.45％ |
| 硫酸长春新碱 | B20210801 | 0.61％ |
| 硫酸长春新碱 | B20210802 | 0.52％ |
经分析确定，上述样品中的可疑杂质与本申请所制备长春新碱类化合物杂质具有相同结构，可判定其为1-氢代-17-去乙酰基脱氧长春新碱，含量约占产品0.3～0.7％之间，对产品质量有一定影响。若使用了本申请提供的除杂方法，可对样品质量做进一步地提升。
不难看出，通过与本申请所制备杂质进行比对与研究，可对今后硫酸长春新碱产品进行更精确地除杂，有效降低硫酸长春新碱产品中的杂质含量，提高硫酸长春新碱产品质量。而本申请所制备杂质可能存在的药理作用也可做进一步地研究。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种长春新碱类手性化合物杂质，其特征在于，具有如下所示化学结构：
2.一种根据权利要求1所述长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、粗品-Ⅰ的制备：按比例在长春花总碱硫酸盐中加入丙酮、乙酸和乙酸酐后搅拌；之后缓慢滴加已配制好浓硫酸、重铬酸钾和水的混合溶液，反应完全后调节至碱性，经过萃取、蒸发、浓缩、得到所述粗品-Ⅰ；
B、粗品-Ⅱ的制备：将所述粗品-Ⅰ用三氯甲烷进行溶解，完全溶解后，在硅胶层析柱上进行第一次梯度洗脱，使用三氯甲烷-甲醇以体积比99:1、98:2、97:3、96:4分四个梯度进行冲洗，每一个梯度冲洗5～8个层析柱体积，收集三氯甲烷-甲醇以体积比98:2梯度进行冲洗获得的柱层析流分，浓缩至干，得到所述粗品-Ⅱ；
C、长春新碱类手性化合物杂质的制备：将所述粗品-Ⅱ做进一步提纯，获得所述长春新碱类手性化合物杂质。
3.根据权利要求2所述长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，其特征在于，步骤B中，将所述粗品-Ⅰ用3～4倍体积量的三氯甲烷进行溶解；浓缩温度为40±2℃。
4.根据权利要求2所述长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，其特征在于，步骤A的具体操作为：按比例在反应瓶中加入长春花总碱硫酸盐，加入丙酮、乙酸和乙酸酐后搅拌；将已配制好浓硫酸、重铬酸钾和水的混合溶液在-40℃～-45℃下缓慢滴加；滴加完毕后反应1～2小时，色谱跟踪检测至所述长春花总碱硫酸盐基本反应完全；保持-40℃～-45℃下缓慢搅拌，将浓氨水缓慢的滴加至反应罐中，待混合均匀后检测溶液的pH为8～9，静置0.5小时以上，之后将溶液抽至萃取罐用溶剂A进行萃取；萃取完成后进行洗涤、蒸发，控制温度在40±2℃，浓缩至干，得到所述粗品-Ⅰ。
5.根据权利要求4所述长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，其特征在于，步骤A中：所述色谱跟踪为薄层色谱跟踪，使用体积比60:30:5:6的石油醚-三氯甲烷-丙酮-二乙胺混合溶液进行展开。
6.根据权利要求4所述长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，其特征在于，步骤A中：所述溶剂A为三氯甲烷；所述洗涤为使用纯化水洗涤；所述蒸发为使用旋转蒸发器蒸发，减压浓缩至干，得到所述粗品-Ⅰ。
7.根据权利要求2或4所述长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述比例为：长春花总碱硫酸盐：丙酮：乙酸：乙酸酐：浓硫酸：重铬酸钾：水＝1g：9～14ml：1.5～2.5ml：3～6ml：0.5～0.8ml：0.5～1g：50～100ml；所述浓硫酸的摩尔浓度为18～19mol/L。
8.根据权利要求2所述长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，其特征在于，步骤C的具体操作为：将所述粗品-Ⅱ溶解，完全溶解后利用反相色谱柱进行第二次梯度洗脱，收集目标柱层析流分-Ⅱ，在40±2℃浓缩至干，得到所述长春新碱类手性化合物杂质。
9.根据权利要求8所述长春新碱类手性化合物杂质的制备方法，其特征在于，步骤C中：将所述粗品-Ⅱ用2倍体积量的乙腈进行溶解；所述第二次梯度洗脱的具体操作是，在C18-ODS反相层析柱上，使用乙腈-水以体积比30:70、40:60、50:50分三个梯度进行冲洗，每一个梯度冲洗4-6个层析柱体积；所述目标柱层析流分-Ⅱ为乙腈-水以体积比50:50梯度进行冲洗获得的柱层析流分。
10.一种根据权利要求1所述长春新碱类手性化合物杂质的应用，其特征在于，作为标准品或对照品用于硫酸长春新碱原料和/或制剂中的含量分析与质量控制。
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