CN114409627B - 一种抗炎化合物Dalditone A及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有较好抗炎活性化合物Dalditone A，其结构式为：

Description

一种抗炎化合物Dalditone A及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗炎活性化合物Dalditone A，及其制备方法和应用。
背景技术
光炭轮菌（Daldinia eschscholtzii）属于子囊菌门真菌。该真菌可产生多种类型的化合物如萘酚类、色酮类、生物碱类、黄酮类、萜类等化合物，具有抗肿瘤，抗炎抑菌，降糖，抗HPV病毒等药理活性。
本发明所涉及的Dalditone A是大环醚类化合物，具有优异的抗炎活性，属于光炭轮菌代谢产物少有的一类。以往的研究发现：少数的微生物能够产生此类化合物。据文献报道，大环醚类化合物具有抗细胞毒、抗肿瘤以及抗菌等多种生物活性。
从植物来源获得该类化合物的成本高，周期长，使得大环醚类化合物的抗炎活性难以被充分利用，为了进一步推广应用大环醚类化合物，提供一种新的抗炎策略，对潜在抗炎药物的发现具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种可以通过微生物发酵得到的、新的大环醚类化合物Dalditone A。
本发明还提供了上述抗炎活性化合物Dalditone A的制备方法和在制备抗炎药物的应用。
一种抗炎化合物Dalditone A，分子式为C17H32O2，其结构式如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式1。
上述抗炎化合物Dalditone A的制备方法，其包括以下步骤：
1）真菌培养：将真菌接种在大米培养基上，于室温培养30±2天；所述大米培养基由80g大米与50-80ml质量浓度0.3%的盐水混合组成；
2）粗浸膏的制备：将步骤1）所得产物置于甲醇中室温浸泡提取，减压浓缩，获得粗浸膏；
3）乙酸乙酯部位浸膏的制备：粗浸膏水溶后，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，获得乙酸乙酯部位浸膏；
4）硅胶柱层析：乙酸乙酯部位浸膏用硅胶柱拌样，依次用体积浓度为0%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集30%石油醚-乙酸乙酯洗脱部分；
5）分离纯化：30%石油醚-乙酸乙酯洗脱部分减压浓缩后，用二氯甲烷溶解经Sephadex LH-20凝胶色谱柱分离，洗脱剂为体积比1：1的二氯甲烷-甲醇，所得组分按分子量由大到小依次标记为组分1和2；组分2经溶解用硅胶拌样后装柱，二氯甲烷洗脱，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分Fr.2.1至Fr2.6，组分Fr.2.6即为Dalditone A粗品。
进一步的，为提高纯度，将Dalditone A粗品用二氯甲烷溶解后经Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，获得Dalditone A纯品。Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化所用洗脱剂为体积比1：1的二氯甲烷-甲醇。所述洗脱剂流速为0.4～0.6mL/min，更优选为0.5mL/min。
如附图1所示的抗炎活性化合物Dalditone A的HR-ESI-MS(高分辨电喷雾电离质谱)谱图，m/z 268.2470[M+H]+。本发明通过1D/2D NMR(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及HR-ESI-MS对抗炎活性化合物Dalditone A结构进行鉴定，1H、13C、1H-1H COSY、HSQC、HMBC和NOESY核磁数据见附图2～7，可以确定其结构如式1所示，其化学名称为：(13S,14R)-3,3,13,14-tetramethyloxacyclotetradecan-4-one，即(13S,14R)-3,3,13,14-四甲基氧杂环十四烷-4-酮。
进一步的，步骤1）中，真菌预先经过活化和初级培养；所述活化具体为：将光炭轮菌（Daldinia eschscholtzii）接种到PDA培养基上，室温条件培育3-5天，即得到活化后的菌种；所用PDA培养基组成为：马铃薯浸粉3.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂14.0g/L，pH值5.6±0.2；
所述初级培养具体为：将活化后的菌种接种到PDB培养基上，在25~30℃条件下摇床培养4-6天，得到种子液；所用PDB培养基组成为：马铃薯浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖15g/L，氯化钠5g/L，pH值5.6±0.2。步骤2）中，步骤1）所得产物置于甲醇中室温浸泡提取2-4次，每次2-4天；优选浸泡提取3次，每次3天。所用甲醇的体积浓度为95-98%。
本发明提供的抗炎化合物Dalditone A具有显著的抗炎活性，能够应用于制备抗炎药物。本发明提供了上述抗炎化合物Dalditone A在制备抗炎药物中的应用。
本发明还提供了一种抗炎组合物，其包含上述的抗炎化合物Dalditone A。所述的抗炎组合物，还可以包括药用辅料，选择本领域常规药用辅料采用本领域熟知的制备方法制成片剂、颗粒剂、注射剂等剂型。所述的抗炎组合物，优选的包括质量百分数1～99％的抗炎化合物Dalditone A，更优选抗炎化合物Dalditone A的质量百分数为60～90％。
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1）本发明提供的抗炎活性化合物Dalditone A，其结构如式1所示。抗炎活性表明：Dalditone A具有显著的抗炎活性，抗炎活性化合物Dalditone A的NO(一氧化氮)抑制活性筛选试验表明，抗炎活性化合物Dalditone A对NO的生成表现出了明显的抑制活性，其半数抑制浓度(IC50值)为19.25μM，而阳性对照L-NMMA(总NOS抑制剂)的半数抑制浓度(IC50值)为32.88μM。同时通过WESTRN BLOT（免疫印记）实验，发现Dalditone A能抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞引起的NO过量生成及iNOS和COX-2 蛋白水平的过度表达、下调LPS刺激的RAW264.7细胞中NF-κB通路中p-IκBα及p- p65蛋白的过度表达，同时下调MAPK通路中p-JNK, p-EPK和p-p38蛋白的过度表达，其可能通过NF-κB和MAPK信号通路来发挥抗炎作用。本发明提供的抗炎活性化合物Dalditone A能够应用于制备抗炎药物，为开发抗炎药物提供新的选择；
2）本发明提供的抗炎活性化合物Dalditone A为光炭轮菌的代谢产物，可以通过微生物发酵制备得到，制备方法周期短、培养条件温和、副产物少、立体选择性强、成本低；
3）本发明提供的抗炎活性化合物光炭轮菌制备方法简单易行，绿色环保，成本较低，易于实现工业化，不仅符合现代环保和低碳经济的需求，还能够为潜在抗炎药物的发现提供新途径。
附图说明
图1为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A的HR-ESI-MS谱；
图2为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A的1H NMR谱；
图3为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A的 13C NMR谱；
图4为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A的 1H-1H COSY谱；
图5为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A的HSQC 谱；
图6为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A的HMBC谱；
图7为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A的NOESY谱；
图8为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A的ECD实验和计算光谱比较；
图9为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A对NO释放的影响；注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；与LPS组比较，# P<0.05，## P<0.01，### P < 0.001；
图10为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS和COX-2 蛋白表达的影响（左图为蛋白表达，右图为蛋白灰度计算比值）；注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；与LPS组比较，# P<0.05，## P<0.01，### P < 0.001；
图11为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A对LPS诱导的RAW264.7细胞内IκBα和p65蛋白表达的影响（左图为蛋白表达，右图为蛋白灰度计算比值）；注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；与LPS组比较，# P<0.05，## P<0.01，### P < 0.001；
图12为本发明所述抗炎活性化合物Dalditone A对LPS诱导的RAW264.7细胞内p-JNK,p-EPK和p-p38蛋白表达的影响（A图为蛋白表达，B,C,D图为蛋白灰度计算比值）；注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；与LPS组比较，# P<0.05，## P<0.01，### P <0.001。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
本发明中，室温指25±5℃。光炭轮菌属真菌（Daldinia eschscholtzii）为普通市售产品，实施例中所用光炭轮菌属真菌购买自宁波明舟生物科技有限公司，产品货号BCRC34046。所用大米为东北大米。石油醚，乙酸乙酯，二氯甲烷和甲醇，纯度优选为分析纯。
实施例中，购买的光炭轮菌属真菌预先经过活化和初级培养；所述活化具体为：将光炭轮菌（Daldinia eschscholtzii）接种到PDA培养基上，室温条件培育4天，即得到活化后的菌种；所用PDA培养基组成为：马铃薯浸粉3.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂14.0g/L，pH值5.6±0.2；
所述初级培养具体为：将活化后的菌种接种到PDB培养基上，在28℃条件下摇床（140r/min）培养5天，得到真菌种子液约4L；所用PDB（马铃薯葡萄糖肉汤）培养基组成为：马铃薯浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖15g/L，氯化钠5g/L，pH值5.6±0.2。
实施例1 制备抗炎化合物Dalditone A
一种抗炎化合物Dalditone A，分子式为C17H32O2，其结构式如下所示：
Figure 252300DEST_PATH_IMAGE001
。
上述抗炎化合物Dalditone A的制备方法，其包括以下步骤：
1）真菌培养：将真菌种子液约5ml接种在装有大米培养基的800 × 1000Erlenmeyer烧瓶，于室温培养30天；所述大米培养基由80g大米与70ml质量浓度0.3%的盐水混合组成；
2）粗浸膏的制备：将步骤1）所得产物置于甲醇中室温浸泡提取3次（每次浸提时甲醇的添加量为25L），每次3天，合并浸提液，减压浓缩以回收溶剂，获得粗浸膏约246.6g；所用甲醇的体积浓度为97%；
3）乙酸乙酯部位浸膏的制备：粗浸膏加水溶解后，用乙酸乙酯萃取3次（乙酸乙酯添加量为3L），减压浓缩以回收溶剂，获得乙酸乙酯部位浸膏约64.6g；
4）硅胶柱层析：乙酸乙酯部位浸膏溶解后，用硅胶柱拌样（200~400目硅胶按重量比1：30拌样后装柱），依次用体积浓度为0%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集30%石油醚-乙酸乙酯洗脱部分；
5）分离纯化：30%石油醚-乙酸乙酯洗脱部分减压浓缩后，用二氯甲烷溶解经Sephadex LH-20凝胶色谱柱分离，洗脱剂为体积比1：1的二氯甲烷-甲醇，所得组分按分子量由大到小依次标记为组分1和2；组分2经二氯甲烷溶解溶解用硅胶拌样（拌样所用硅胶为200-300目粗硅胶）后装柱，二氯甲烷洗脱，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分Fr.2.1至Fr2.6，组分Fr.2.6即为Dalditone A粗品。将Dalditone A粗品用二氯甲烷溶解后经Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化（所用洗脱剂为体积比1：1的二氯甲烷-甲醇，所述洗脱剂流速为0.5mL/min），获得Dalditone A纯品。
上述制备所得的Dalditone A纯品：性状呈黄色油状物，收率为0.0016%，纯度为99.2%；
实施例2 结构的鉴定
仪器材料：所述1D/2D NMR(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)图谱均由Bruker am-500 MHz核磁共振仪测定。TMS 为内标；溶剂为CDCL3，LC-MS由Aglient 1260Infinity-6120 型液相质谱联用仪测定。
取实施例1制备得到的抗炎化合物Dalditone A，通过1D/2D NMR(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及HR-ESI-MS(高分辨电喷雾电离质谱)鉴定得到的化合物Dalditone A及其结构。
Dalditone A的HR-ESI-MS图谱见附图1，1H NMR 谱图见附图2，13C NMR 谱图见附图3。
根据附图1 可看出Dalditone A的分子质量是268.2470[M +H]- (理论值为：268.2402)，并结合附图2和3可以推出该化合物的分子式为C17H32O2，不饱和度为2。
1H-NMR 显示该化合物有四个甲基信号峰δH 0.75(d, J=6.77 Hz, H-14),δH0.75(d, J=6.77 Hz,H-15), δH 1.02(s, H-16),δH 1.02(s,H-17 )，一个连氧亚甲基信号峰 δH 3.43(s,H-1)，一个连氧次甲基信号峰 δH 3.55 (td,6.27 Hz,10.25 Hz,H-13)，高场区有两个亚甲基信号峰δH 1.43(dd,6.96 Hz,14.03 Hz,H-5),δH 1.30(m,H-6)，一个次甲基信号峰δH 1.29(m,H-12)，除此之外高场区还有一个叠加态的单峰信号，积分值为10，初步推断为5个直链次甲基信号叠合在一起。结合HSQC谱图可得到化合物Dalditone A化学位移δ归属如表1所示。
表1化合物Dalditone A的1H NMR(500MHz)和13C NMR(125MHz)
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
根据1H-1H COSY谱图（图4）推断出该化合物的右半边结构，进一步根据HMBC谱图（图6）中H-14与C-11，C-12，C-13相关推断出甲基（δ C 14.24，δ H0.75）与C-12直接相连，同理推断出甲基（δ C20.00，δ H1.0）与C-13直接相连。根据H-1与C-2，C-3，C-16，C-17相关，H-4和C-13相关推断出次甲基（δ C 69.25，δ H 3.43）两个甲基（δ C21.49，δ H1.02）与C-2相连，羰基碳（δ C 216.86）位于3号位，结合C-1和C-13的化学位移值得出C-1和C-13通过氧原子相连，最终得出该化合物的平面结构。在甲醇中，在BVP86/LANL2MB水平下，计算得到的ECD光谱与实验光谱结果一致(图8)，确定化合物1的绝对构型为(12S,13R)。
综上所述，可以确定实施例1制备得到的化合物Dalditone A结构式为：
Figure 575966DEST_PATH_IMAGE001
。
实施例3化合物Dalditone A的抗炎活性
1，实验细胞
RAW264.7 巨噬细胞，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
2，仪器与试剂
分析天平 (赛多利斯科学仪器有限公司)；
全波长酶标仪 (Thermo Fisher，1510型)；
二氧化碳培养箱 (Thermo scientific，3111型)；
离心机 (上海手术器械厂，800型）；
多色荧光、化学发光和可见光成像仪 (ProteinsiMple FluorcheM Q)；
微型台式冷冻离心机 (D-37520 TherMo)；
电泳仪 (EPS600 Tanon)；
转印槽 (Mini-PROTEAN Tetra SysteM, BIO-RAD)；
梯度PCR仪 (MyCyclerTMThermal Cycler);
实时荧光定量PCR(Thermo Fisher)；
倒置显微镜 (Nikon ECLiPES TS100)；
96孔、24孔、6孔细胞培养板（Corning）；
改良Eagle培养基（DMEM，Solarbio）；
青霉素链霉素混合液（Solarbio）；
澳洲胎牛血清（FBS，Gibco）；
脂多糖（LPS，Sigma）；
PBS缓冲液（博士德）；
噻唑蓝（MTT，华蓝化学）；
二甲基亚砜（DMSO，Sigma）；
RIPA细胞裂解液（弱）（碧云天生物科技）；
一氧化氮试剂盒（南京建成生物工程研究所）；
Trizol Reagent（康为世纪生物科技有限公司）；
PCR引物（Thermo Fisher）；
PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser 试剂盒 （TaKaRa）；
SYBR® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（含Rox）（艾科瑞生物工程有限公司）；
BCA蛋白质定量试剂盒（Solarbio）；
蛋白酶磷酸酶抑制剂（Solarbio）；
PMSF蛋白酶抑制剂（Solarbio）
5×蛋白上样缓冲液（Solarbio）；
脱脂奶粉（Amresco）；
PVDF膜（Solarbio）；
IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、β-actin一抗（Cell signaling technology）；
辣根过氧化物酶标记的二抗（Cell signaling technology）；
N-单甲基-L-精氨酸单乙酸酯（L-NMMA） (sigma)；
TBS(Tris-HCl缓冲盐溶液)配置方法：在900mL双蒸水中溶解80g NaCl、24.2gTris-base，加浓HCl调至pH值至7.6，即可；
ECL发光液（Solarbio）。
3，一氧化氮(nitric oxide，NO)具有广泛而重要的生物学调控功能，在炎症、肿瘤及心血管系统等均有重要作用。当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶(induced NO synthase，iNOS)，产生NO进行免疫应答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标。将对数生长的RAW264.7细胞(购自中国典型培养物保藏中心)以5×104细胞/孔的密度接种于96孔板，并在37℃和5% CO2条件下与100µLDMEM共孵育。 当细胞融合达到70-80%时，取细胞培养液，分别用含有不同浓度(10、20、30、40、50µM) N-单甲基-L-精氨酸单乙酸酯(L- NMMA)或实施例1所得Dalditone A的100 µLDMEM和1µg/ml LPS刺激细胞24 h。 收集细胞培养液，按照生产厂家的说明书使用一氧化氮试剂盒测定NO水平。 然后在每孔中加入约10µL的MTT (0.5 mg/mL)和100µL的DMEM，在37◦C进一步孵育4 h。 丢弃细胞培养液，加入100µL的DMSO中。在490 nm处测定吸光度，计算细胞存活率。由图9可知，相比空白组，LPS组显著增加NO的释放，而药物组相比模型组可以降低NO的释放，且呈现剂量依赖性，在此基础上我们进行了IC50的计算。
IC50(半数抑制浓度)按Reed&Muench法计算，得到化合物Dalditone A的NO抑制活性的IC50为：19.25μM。
经计算可知：在对化合物Dalditone A的NO抑制活性(阳性对照为：L-NMMA)筛选试验中，化合物Dalditone A对一氧化氮(NO)的生成表现出了明显的抑制活性，其半数抑制率(IC50值)为：19.25μM。而阳性对照L-NMMA对一氧化氮(NO)的半数抑制率(IC50值)为：32.88μM。化合物Dalditone A对一氧化氮(NO)的生成抑制率要明显强于阳性对照L-NMMA。因此，Dalditone A具有作为先导化合物开发抗炎药物的研究价值。而基于微生物发酵的大量而简单的产生抗炎化合物Dalditone A的方法，不仅可以满足现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期该抗炎化合物工业化量产的进一步研究和开发打下了坚实的基础，具有显著的应用价值。
实施例4 化合物Dalditone A的抗炎作用通路验证
实验材料和器材与实施例3一致。
1，Western blot法检测iNOS和COX-2及NF-κB和MAPK信号通路中相关蛋白的表达
将 RAW264.7细胞接种于含有DMEM培养基的6孔板中（1×106个/孔），37℃、5%CO2的培养箱孵育24 h后弃去上清，空白组给予2 mL DMEM完全培养基，LPS组给予2mL DMEM完全培养基，实验组分别给予含有不同浓度Dalditone A （25、12.5、6.25 μM）的DMEM完全培养基2 mL，1 h后除空白组外均给予200 μL终浓度为1 µg/mL 的LPS。在37℃、5%CO2的培养箱内孵育24 h后收集细胞。给组中分别加入细胞裂解液（RIPA 细胞裂解液：蛋白酶磷酸酶抑制剂：PMSF蛋白酶抑制剂=100:1:1，体积比）在冰上裂解10 min。裂解产物于4℃离心机以12000 r/min离心10 min。BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度，定量后的蛋白质样品加入一定比例的5× 蛋白上样缓冲液使缓冲液稀释成1×，在100℃下高温变性，-20℃保存。蛋白质样品与10% SDS-聚丙烯凝胶电泳浓缩分离，分离后，蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜)，用5%的脱脂奶粉封闭2 h。将PVDF 膜放置于一抗（iNOS、COX-2、IκBα、p-p65、p-JNK、p-EPK、p-P38及GAPDH）溶液杂交孵育，4℃冰箱过夜。TBST（TBS:吐温20=200:1，体积比）洗膜5次，每次5 min。用TBST按5000:1 比例稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，进行二抗杂交，室温孵育2 h，用TBST洗膜4次，每次5 min。最后用ECL发光液显现 iNOS、COX-2、IκBα、p-P65、p-JNK、p-EPK、p-P38及GAPDH蛋白，并使用Image J软件进行分析。
2，数据处理
结果采用均值±SD值表示，数据统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法（One-Way ANOVA）比较其显著性差异。
3，试验结果
3.1 Dalditone A对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS和COX-2蛋白表达的影响
Dalditone A对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS和COX-2 蛋白表达的影响如图10所示。与空白组相比，LPS刺激后可显著促进RAW264.7细胞iNOS和COX-2 蛋白的表达，而不同浓度（25μM、12.5μM、6.25μM）的Dalditone A在LPS刺激后显著抑制了iNOS和COX-2 蛋白的表达（P<0.001）。说明，Dalditone A通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS和COX-2 蛋白表达而起到抗炎作用。
3.2 Dalditone A对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB和MAPK信号通路的影响
图11 给出了Dalditone A对LPS诱导的RAW264.7细胞内p-p65和p-IκBα蛋白表达的影响。如图11所示，与空白组相比，LPS可刺激RAW264.7细胞中IκBα和p65蛋白磷酸化明显上调（P<0.001），Dalditone A可以抑制LPS诱导后RAW264.7细胞内p-p65和p-IκBα蛋白表达。
图12 给出了Dalditone A对LPS诱导的RAW264.7细胞内p-JNK、p-EPK、p-p38蛋白表达的影响。如图12所示，与空白组相比，LPS可刺激RAW264.7细胞中JNK、EPK、p-38蛋白磷酸化明显上调（P<0.001），Dalditone A可以抑制LPS诱导后RAW264.7细胞内p-JNK、p-EPK、p-p38蛋白表达。可见，Dalditone A的抗炎作用可能与抑制RAW264.7细胞内NF-κB和MAPK信号通路有关。
综上: 本发明经试验证明了Dalditone A对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞具有抗炎作用。Dalditone A能抑制LPS刺激的RAW264.7细胞的NO产生，抑制iNOS和COX-2蛋白表达；此外证明了其能抑制NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白的表达。表明Dalditone A的抗炎作用是通过抑制NF-κB和MAPK信号通路来实现的。

Claims (8)

1.一种抗炎化合物Dalditone A，其特征在于，结构式如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.权利要求1所述抗炎化合物Dalditone A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）真菌培养：将真菌接种在大米培养基上，于室温培养30±2天；所述大米培养基由80g大米与50-80ml质量浓度0.3%的盐水混合组成；
真菌预先经过活化和初级培养；所述活化具体为：将光炭轮菌（Daldinia eschscholtzii）接种到PDA培养基上，室温条件培育3-5天，即得到活化后的菌种；所用PDA培养基组成为：马铃薯浸粉3.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂14.0g/L，pH值5.6±0.2；
所述初级培养具体为：将活化后的菌种接种到PDB培养基上，在25~30℃条件下摇床培养4-6天，得到种子液；所用PDB培养基组成为：马铃薯浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖15g/L，氯化钠5g/L，pH值5.6±0.2；
2）粗浸膏的制备：将步骤1）所得产物置于甲醇中室温浸泡提取，减压浓缩，获得粗浸膏；所用甲醇的体积浓度为95-98%
3）乙酸乙酯部位浸膏的制备：粗浸膏水溶后，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，获得乙酸乙酯部位浸膏；
4）硅胶柱层析：乙酸乙酯部位浸膏用硅胶柱拌样，依次用体积浓度为0%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集30%石油醚-乙酸乙酯洗脱部分；
5）分离纯化：30%石油醚-乙酸乙酯洗脱部分减压浓缩后，用二氯甲烷溶解经SephadexLH-20凝胶色谱柱分离，洗脱剂为体积比1：1的二氯甲烷-甲醇，所得组分按分子量由大到小依次标记为组分1和2；组分2经溶解用硅胶拌样后装柱，二氯甲烷洗脱，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分Fr.2.1至Fr2.6，组分Fr.2.6即为Dalditone A粗品。
3.根据权利要求2所述抗炎化合物Dalditone A的制备方法，其特征在于，将DalditoneA粗品用二氯甲烷溶解后经Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，获得Dalditone A纯品。
4.根据权利要求3所述抗炎化合物Dalditone A的制备方法，其特征在于，SephadexLH-20凝胶色谱柱纯化所用洗脱剂为体积比1：1的二氯甲烷-甲醇。
5.权利要求1所述抗炎化合物Dalditone A在制备抗炎药物中的应用。
6.一种抗炎组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的抗炎化合物Dalditone A。
7.根据权利要求6所述的抗炎组合物，其特征在于，选择药用辅料制成片剂、颗粒剂、注射剂。
8.根据权利要求7所述的抗炎组合物，其特征在于，抗炎化合物Dalditone A的质量百分数为60～90％。
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