CN112830949A - 海洋曲霉菌产生的抗真菌化合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物领域，涉及采用共培养(又称混合培养)技术，从海洋来源的花斑曲霉菌的发酵产物中获得5个新结构抗真菌化合物(式I‑V所示)及其制备方法；本发明还涉及所述化合物抗真菌感染的应用。

Description

海洋曲霉菌产生的抗真菌化合物及其制备方法

技术领域：

本发明属于医药生物领域，涉及采用共培养(又称混合培养)技术，从海洋 来源的花斑曲霉菌的发酵产物中获得5个新结构抗真菌化合物(式I-V所示)及 其制备方法；本发明还涉及所述化合物抗真菌感染的应用。

背景技术：

海洋微生物是药物先导化合物发现的重要来源。真菌基因组通常携带有 20～50种次级代谢生物合成基因。大多数次级代谢相关基因，在常规实验条件 下，表达量极低或完全处于沉默状态，称为“沉默基因”。在自然环境中，不同 种类的微生物(细菌、放线菌、真菌)共存于同一复杂体系。微生物之间通过产 生代谢产物进行资源竞争、化学防御或信息交流。在共培养(混合培养)条件下， 由于受到其它微生物的竞争压力，可能使处于沉默状态的基因得到激活，从而产 生新的次级代谢产物。研究表明，共培养有助于增加微生物次级代谢产物的化学 多样性，诱导产生良好的生物活性，其中最常见的是由化学防御机制产生的抗菌 和细胞毒活性。本发明利用共培养技术，从来源于海洋花斑曲霉菌 IMB17-055(Aspergillus versicolor)与其它真菌的共培养发酵液中，发现5个新结 构的化合物，命名为共生霉素A-E(英文名称：cocultimycin A-E，如式I-V所示)。 涉及式I-V所示化合物的化学结构、制备方法及抗真菌应用，迄今为止，尚未见 有关报道。

发明内容：

本发明目的之一是，提供一株共生霉素A-E(cocultimycin A-E)的产生菌。

该菌株为一种海洋真菌，优选为花斑曲霉菌IMB17-055，系分离自三亚红树 林采集的海泥样品，为该菌株于2019年7月12日送交北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心保藏，保藏编号：CGMCCNo.18107，建议的分类命名：花斑曲霉 Aspergillus versicolor，参据的生物材料：IMB17-055。

本发明目的之二是，提供五种新结构的化合物共生霉素I-V(如式I-V所示)。

本发明从海洋真菌花斑曲霉菌IMB17-055(Aspergillus versicolor)与其它真菌的共培养发酵产物中发现5个新结构化合物，其结构如式I-V所示。

分子式C₄₁H₇₁NO₁₂,分子量770.0。

分子式C₄₁H₇₁NO₁₁,分子量754.0。

分子式C₄₁H₆₉NO₁₂,分子量768.0。

分子式C₄₁H₇₃NO₁₂,分子量772.0。

分子式C₃₅H₆₁NO₆,分子量591.9。

本发明目的之三是，提供式I-V所示化合物共生霉素A-E的制备方法。

本发明所述的式I-V所示化合物共生霉素A-E的制备方法，包括以下步骤：

(1)将活化的保藏编号为CGMCC No.18107的花斑曲霉菌IMB17-055和其 它一种丝状真菌分别接种于马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)的发酵培养基中，制 作种子液。随后，将两种菌株的种子液按等比例混合，然后转接于PDB发酵培养 基中，进行共培养；

(2)将共培养发酵产物过滤得到上清液和菌丝体，上清液用溶剂进行萃取， 得到上清液提取物，菌丝体用溶剂超声提取，得到菌丝体提取物；

(3)将上述两部分提取物合并，通过C18反相柱色谱分离，依次用10％、 30％、50％、70％、100％甲醇溶液梯度洗脱。将100％洗脱组分经HPLC制备得 到式I-V所示的化合物。

优选的，本发明所述的化合物共生霉素A-E的制备方法，包括以下步骤：

(1)将活化的保藏编号为CGMCC No.18107的花斑曲霉菌IMB17-055与另 外一种丝状真菌接种于配方为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)的发酵培养基中， 28℃，200r/min，摇瓶培养3天制作种子液。将两株菌的种子液按1:1的比例混 合，随后按10％的接种量接种到装有100mL PDB发酵培养基的500mL锥形瓶中， 28℃，200r/min震荡培养10天；

(2)将共培养发酵产物过滤得到澄清发酵液和菌丝体，发酵液减压浓缩至 5L后用乙酸乙酯进行萃取(5×5L)，得到上清液提取物(4g)。菌丝体用丙酮超 声提取，得到菌丝体提取物(50g)；

(3)通过C18反相闪式柱(55mm×400mm)色谱分离，依次用10％、30％、 50％、70％、100％甲醇溶液梯度洗脱，得到14个馏分F₁-F₁₄。取100％洗脱组分 经凝胶柱分离，然后经HPLC制备得到式I-V。

其中，步骤(1)中，所述的液体培养基选自：包括但不限于PDB培养基。

其中，步骤(1)中，所述的共培养(混合培养)所需的其它丝状真菌选自： 包括但不限于青霉属、曲霉属、支顶孢属、枝孢属的任何菌株。

其中，步骤(2)中，有机溶剂选自：氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙 酸等碳链≤4的醇类、丙酮、丁酮、或以上溶剂的混合溶液。优选为，乙酸乙酯 和丙酮。

其中，步骤(3)中，馏分F₁-F₁₄别为10％、30％、50％、70％、100％浓度的有 机溶剂依次洗脱得到；其中，所述溶剂选自：包括但不限于丙酮水溶液、碳链≤4 的醇溶液、乙腈水溶液、或甲醇中一种或以上混合。

其中，式I-V所示化合物的HPLC分离纯化过程如下：

溶剂选自：丙酮水溶液、碳链≤4的醇溶液、乙腈水溶液。

色谱柱选自：包括但不限于C18、C8、C3、苯基键合柱。

优选为：C-18色谱柱，10mm×250mm,30％MeCN,4mL/min。

进一步优选的，本发明所述的化合物共生霉素A-E的制备方法，包括以下步 骤：

(1)真菌IMB17-055(Aspergillus versicolor)共培养(混合培养)发酵：

将活化的保藏编号为CGMCC No.18107的花斑曲霉菌IMB17-055接种于马 铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上，置于28℃恒温培养箱培养7-14天，用无 菌铁铲取约1cm²的含菌琼脂块接种于100mL液体马铃薯葡萄糖肉汤培养基 (PDB)发酵培养基，在500mL三角瓶中，28℃，200r/min，摇瓶培养3d制作 种子液；采用以上相似实验过程，制备谢瓦氏曲霉菌IMB18-208的种子液。随后， 将两种真菌的种子液进行等比例混合，按10％的接种量转接于PDB发酵培养基， 28℃，200rpm震荡培养10天；

(2)发酵产物的提取与浸膏的获得：

将共培养发酵产物(30L)过滤得到发酵上清液和菌丝体，上清液减压浓缩 至5L后用乙酸乙酯进行萃取(5×5L)，得到上清液提取物。菌丝体用丙酮超声 提取，得到菌丝体提取物；

(3)式I-V所示化合物的分离

将上述提取物合并，通过C18反相闪式柱(55mm×400mm)色谱分离， 依次用10％、30％、50％、70％、100％甲醇溶液梯度洗脱，得到14个洗脱馏分 (F₁-F₁₄)。取100％洗脱组分F₁₂经凝胶柱分离，得到5个馏分(F_12-1-F_12-5)，F_12-2经HPLC色谱纯化(Capcell C18 MG-Ⅱ5μm，20mm×250mm，50％乙腈-1‰甲 酸水，10mL/min)得到2个组分，F_12-2-2为式I所示化合物；F_12-2-1经HPLC色 谱纯化(YMC-Pack ph 5μm，10mm×250mm，45％乙腈-1‰甲酸水，4mL/min)得到式Ⅲ化合物。取100％洗脱组分F₁₃经凝胶柱分离，得到3个馏分(F_13-1-F_12-3)。 F_13-1经HPLC色谱纯化(Capcell C18 MG-Ⅱ5μm，20mm×250mm，50％乙腈-1‰ 甲酸水，10mL/min)得到8个组分，F_13-1-5经HPLC色谱纯化(YMC-Pack ph 5μm， 10mm×250mm，55％乙腈-1‰甲酸水，4mL/min)得到式IV所示化合物；F_13-1-6经HPLC色谱纯化(YMC-Pack ph 5μm，10mm×250mm，55％乙腈-1‰甲酸水， 4mL/min)得到式Ⅱ所示化合物；F_13-1-8经HPLC色谱纯化(YMC-Pack ph 5μm，10mm×250mm，55％乙腈-1‰甲酸水，4mL/min)得到式V所示化合物。

本发明目的之四是，提供式I-V所示化合物或以其为活性成分的药物组合物 在治疗真菌感染的药物中的应用。

本发明测试了所述共生霉素A-E抗真菌活性。实验结果显示该化合物对所试 验真菌具有较好的抑制活性。表明所述化合物可用于制备抗真菌感染的药物。而 以所述化合物作为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料 配伍，可制成抗真菌感染的药物组合物。所述药物及药物组合物可用于真菌感染 的临床治疗。所述化合物也可与已知药物组成复方制剂用于真菌感染的治疗。

本发明中经微生物发酵制备式I-V所示化合物的方法，可适用于其他能产生 此类化合物的任何微生物。

而以所述衍生物作为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体、赋性剂 或辅料配伍，可制成抗真菌感染的药物组合物。所述药物以及药物组合物可用于 真菌感染的临床治疗。所述化合物也可与已知药物组成复方制剂用于真菌感染的 治疗。

本发明的目的之五在于，提供以式I-V所示化合物为活性成分的药物组合物。

本发明的药物组合物，包括式I-V所示化合物，以及药学上可接受的载体。

其中，药学上可接受的载体以重量计是药物组合物总重量的0.1-99.9％。

其中，药学上可接受的载体包括甘露醇、山梨醇、山梨酸或钾盐、焦亚硫酸 钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素A、 维生素C、维生素E、维生素D、氮酮、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属 的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯 化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、 淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土温60-80、司班-80、蜂蜡、羊毛脂、 液体石蜡、十六醇、没食子酸酯类、琼脂、三乙醇胺、碱性氨基酸、尿素、尿囊 素、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类 材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微晶中一种或以上；优选所述的 载体为微晶纤维素、乳糖、淀粉、羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、滑石 粉中一种或以上。

本发明的药物组合物，可以制备成任何要用剂型。所述的制剂为片剂、糖衣 片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含 剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏 剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、贴剂任意一种；优选所述的制剂为胶囊剂、颗粒剂 或片剂。

附图说明：

图1：菌株IMB17-055 ITS DNA系统进化树分析

图2：式I所示化合物的高分辨电喷雾质谱

图3：式I所示化合物的¹H NMR谱

图4：式I所示化合物的¹³C NMR谱

图5：式Ⅱ所示化合物的高分辨电喷雾质谱

图6：式Ⅱ所示化合物的¹H NMR谱

图7：式Ⅱ所示化合物的¹³C NMR谱

图8：式Ⅲ所示化合物的高分辨电喷雾质谱

图9：式Ⅲ所示化合物的¹H NMR谱

图10：式Ⅲ所示化合物的¹³C NMR谱

图11：式IV所示化合物的高分辨电喷雾质谱

图12：式IV所示化合物的¹H NMR谱

图13：式IV所示化合物的¹³C NMR谱

图14：式V所示化合物的高分辨电喷雾质谱

图15：式V所示化合物的¹H NMR谱

图16：式V所示化合物的¹³C NMR谱

具体实施方式：

本发明实施方案适用于从任何微生物，而不限于从花斑曲霉菌的发酵产物中 制备共生霉素A-E及其衍生物。以下所列实施例是为帮助本领域技术人员更好 的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>菌株IMB17-055(Aspergillus versicolor)的鉴定

a)菌株来源：菌株花斑曲霉IMB17-055(Aspergillus versicolor)从三亚红沙 红树林采集的海泥样品(18°24′09.00″N，109°51′08.00″E)中分离获得。

b)菌株鉴定：根据ITS区域DNA序列在微生物种属中的保守性，对真菌 IMB17-055(Aspergillus versicolor)进行鉴定。提取菌株基因组，PCR扩增其ITS 基因并进行测序，提交到NCBI GenBank数据库获得登陆号为MN294468。

SEQ ID NO.1

>IMB17-055 ITS

1 agtcgttacg tagtgacctg cggaaggatc attactgagt gcgggctgcc tccgggcgcc

61 caacctccca cccgtgacta cctaacactg ttgcttcggc ggggagccct ctcgggggcg

121 agccgccggg gactactgaa cttcatgcct gagagtgatg cagtctgagt ctgaatataa

181 aatcagtcaa aactttcaac aatggatctc ttggttccgg catcgatgaa gaacgcagcg

241 aactgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgagtctt tgaacgcaca

301 ttgcgccccc tggcattccg gggggcatgc ctgtccgagc gtcattgctg cccatcaagc

361 ccggcttgtg tgttgggtcg tcgtcccccc cgggggacgg gcccgaaagg cagcggcggc

421 accgtgtccg gtcctcgagc gtatggggct ttgtcacccg ctcgatttag ggccggccgg

481 gcgccagccg acgtccaacc atttttcttc aggttgacct cggatcaggt agggataccc

541 gctgaactta agcatatcat aagcggggga agga

表明，菌株IMB17-055属于曲霉科曲霉菌属中的一种，据此将该菌命名为 花斑曲霉菌(Aspergillus versicolor)，并于2019年保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18107。

<实施例2>花斑曲霉菌(Aspergillus versicolor)IMB17-055的共培养筛选

将菌株花斑曲霉菌IMB17-055及其它共培养菌株，包括支顶孢属 Acremoniumpersicinum IMB17-217，曲霉属Aspergillus oryzae IMB17-008、 Aspergillussp.IMB17-028、Aspergillus sp.IMB17-036、Aspergillus sp.IMB17-078、 Aspergillusjensenii IMB17-079、Aspergillus chevalieri IMB18-208，枝孢属 Cladosporiumxanthochromaticum IMB17-002，青霉属Penicillium raistrickii IMB17-035、Penicillium glabrum IMB18-209、Penicillium chrysogenum IMB17-065 等11种菌株的孢子液分别接种于PDA培养基平板[配方为：葡萄糖2.0g，马铃 薯浸出粉0.3g，琼脂粉18g，去离子水100mL]上，置于28℃恒温培养箱培养7-14 天。用无菌铁铲取约1cm²的含菌琼脂块接种于20mL液体PDB发酵培养基[配 方为：葡萄糖2.0g，马铃薯浸出粉0.3g，去离子水100mL]，在100mL三角瓶 中，28℃，200r/min，摇瓶培养3d，制备各菌株的种子发酵液。

量取花斑曲霉菌IMB17-055的种子液0.5mL，分别与上述其它11种菌株的 种子液进行等比例混合。将所得的11种混合种子液分别接种于含10mL PDB培 养基的50mL离心管中，28℃，200r/min，振荡7d，进行共培养(混合培养)。 将各组共培养发酵液加载于C18固相萃取柱(5ml,含反相C18硅胶2g)，分别 用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱馏分，真空离心浓缩后得到甲醇提取物。将甲醇 提取物进行LC-MS分析，结果表明，菌株IMB17-055分别与其它11种菌株的 共培养(混合培养)产物中均产生了式I-V所示的5个化合物(表1)。其中， 以与谢瓦氏曲霉IMB18-208的共培养产物中，所诱导产生的共生霉素A含量最 高。

表1.花斑曲霉菌IMB17-055与11株真菌共培养发酵产物分析结果

<实施例3>花斑曲霉菌(Aspergillus versicolor)IMB17-055的共培养大量发 酵制备

将菌株IMB17-055菌种孢子液接种于PDA培养基平板[配方为：葡萄糖2.0g， 马铃薯浸出粉0.3g，琼脂粉18g，去离子水100mL]上，置于28℃恒温培养箱培 养7-14天，用无菌铁铲取约1cm²的含菌琼脂块接种于100mL液体PDB发酵培 养基，在500mL三角瓶中，28℃，200r/min，摇瓶培养3d，制作种子液。

采用以相同的步骤，制备菌株谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri)IMB18-208的种子液。将两株菌的种子液按1:1的比例混合，然后将混合后种子液按10％的 接种量，转接于PDB发酵培养基，共30L，28℃，200rpm震荡培养10天。

<实施例4>式I-V所示化合物的分离制备

将共培养发酵产物过滤得到上清液和菌丝体。上清液减压浓缩至5L后用乙 酸乙酯进行萃取(5×5L)，得到上清液提取物。菌丝体用丙酮超声提取，得到菌 丝体提取物。将两部分提取物合并，通过C18反相闪式柱(55mm×400mm) 色谱分离，依次用10％、30％、50％、70％、100％甲醇溶液梯度洗脱，得到14 个洗脱馏分(F₁-F₁₄)。取100％洗脱组分F₁₂经Sephadex LH-20凝胶柱层析，二 氯甲烷：甲醇(1：1)洗脱，得到5个馏分(F_12-1-F_12-5)，F_12-2经HPLC色谱纯 化(Capcell C18 MG-Ⅱ5μm，20mm×250mm，50％乙腈-1‰甲酸水，10mL/min)得到2个组分，F_12-2-2为化合物I；F_12-2-1经HPLC色谱纯化(YMC-Pack ph 5μm， 10mm×250mm，45％乙腈-1‰甲酸水，4mL/min)得到化合物Ⅲ。取100％洗脱 组分F₁₃经经Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷：甲醇(1：1)洗脱，得到 3个馏分(F_13-1-F_12-3)。F_13-1经HPLC色谱纯化(Capcell C18 MG-Ⅱ5μm，20mm ×250mm，50％乙腈-1‰甲酸水，10mL/min)得到8个组分，F_13-1-5经HPLC色 谱纯化(YMC-Pack ph 5μm，10mm×250mm，55％乙腈-1‰甲酸水，4mL/min)得到化合物IV；F_13-1-6经HPLC色谱纯化(YMC-Pack ph 5μm，10mm×250mm， 55％乙腈-1‰甲酸水，4mL/min)得到化合物Ⅱ；F_13-1-8经HPLC色谱纯化 (YMC-Pack ph 5μm，10mm×250mm，55％乙腈-1‰甲酸水，4mL/min)得到 化合物V。

<实施例5>式I-V所示化合物结构鉴定

式Ⅰ所示化合物：共生霉素A的结构鉴定

白色粉末状,易溶于甲醇、DMSO。高分辨电子喷雾质谱(HRESIMS)显示 出准分子离子峰770.5029[M+H]⁺(图1)，结合NMR数据确定其分子式为 C₄₁H₇₁O₁₂N(C₄₁H₇₂O₁₂N理论值为770.5049)，不饱和度为7。化合物Ⅰ的UV光 谱在225nm和282nm处显示最大吸收峰，提示结构中含有不饱和酮结构单元。 IR光谱在3331、1660、1609cm^-1显示出羟基、不饱和羰基或双键的特征吸收峰。 式I所示化合物的¹H NMR谱(CD₃OD，图2)在高场区显示出2个双峰甲基信号δ_H 1.11(d,CH₃-4)，δ_H 0.89(d,CH₃-6)，在δ_H 1.24～2.15区间显示出一组共39个 质子的脂肪亚甲基或次甲基质子信号；在低场区显示出一对反式双键质子信号δ_H 5.47(dt,J＝15.0,6.0Hz,H-14)，5.45(dt,J＝15.0,6.0Hz,H-15)，1个糖端基质子 信号δ_H 4.49(brs,H-1″)，以及在δ_H 3.10～4.60区间显示出14个连氧或连氮次甲基 和亚甲基信号。式I所示化合物的¹³C NMR谱(图3)DEPT和HSQC谱显示出38个碳信号，其中包括1个典型的吡喃六碳糖信号(δ_C 101.7,72.6,75.2,68.4,78.2, 62.8)，两个sp²杂化次甲基碳δ_C 134.0(C-14),127.6(C-15)，3个连氧次甲基δ_C 72.5 (C-17),72.4(C-21),74.3(C-4′)，1个连氮次甲基δ_C 67.5(C-2′)，两个脂肪次甲基δ_C 35.9(C-4)和30.9(C-6)，1个连氧亚甲基δ_C 70.6(C-28)，1个连氮亚甲基δ_C 53.8 (C-5′)，19个其它亚甲基信号以及1个季碳δ_C 103.8(C-2)。此外通过分析HMBC 谱数据，提示化合物Ⅰ中还含有3个季碳信号δ_C 178.0(C-1),196.6(C-4)和198.4 (C-1′)。

通过对化合物I的2D NMR(COSY、HSQC和HMBC谱)的相关信号详细分 析，证实结构中含有1个β-甘露糖、1个长链脂肪烯醇、以及1个tetramic acid 结构单元。在HMBC谱中，H-1″与C-28相关表明β-甘露糖单元连接在脂肪链的 C-28位。分析其HMBC谱相关峰数据，我们发现H₂-27(δ_H 1.61,m)与两个亚甲 基碳信号δ_C 27.1和30.7具有明显的相关峰信号。其中，δ_C 27.1与H-28a、H-28b 亦有HMBC相关信号，说明δ_C 27.1的碳信号应归属于C-26，而δ_C30.7的碳信号 应归属于C-25。依据C-25的化学位移，表明该化合物结构中C-25处于远离羟基β-位的位置。将化合物I进行臭氧化裂解得到两个双键断裂的降解产物，通过 对降解产物HRESIMS和2D NMR等数据分析，确定双键在C-14和C-15位，两 个羟基分别取代在C-17和C-21位，因而确定了化合物I的平面结构。利用蜗牛 酶对化合物Ⅰ进行酶水解，得到苷元，其NMR数据与从发酵产物中分离得到的 化合物V一致。利用Mosher酯衍生化确定苷元中羟基取代碳C-17、18的构型为 17R,18R，通过高级Marfey’s法确定C-2′、4′构型为2′S、4′R，通过NMR和ECD 计算确定C-4、6的构型为4S,6R。利用LC-MS手性分析化合物I的酸水解产物 2,3-萘二胺衍生物，并与标准L/D-甘露糖对照，确定甘露糖的构型为D-型。因此， 化合物I的结构确定如式I所示。

式Ⅱ所示化合物：共生霉素B的结构鉴定

白色粉末，HRESIMS显示出准分子离子峰m/z 776.4920[M+Na]+ (C₄₁H₇₁O₁₁NNa计算值776.4919)，确定其分子式为C₄₁H₇₁O₁₁N，比化合物Ⅰ少 1个氧原子。化合物2的UV、IR以及NMR数据与化合物Ⅰ类似。主要不同之处 在于，化合物Ⅱ的¹³C NMR谱中，δ74.3的连氧次甲基C-4′信号消失，被高场δ28.0 的亚甲基信号所代替，C-3′和C-5′均高场位移9.5ppm。化合物Ⅱ的¹H NMR谱中， 连氧次甲基质子(H-4′)被一对亚甲基质子δ2.11(H-4a)和2.06(H-4b)所代 替。以上数据表明，化合物Ⅱ为Ⅰ的4′-脱羟基衍生物,通过2D NMR(COSY、HSQC、 HMBC、TOCSY、ROESY)数据分析进一步确定了Ⅱ的结构，命名为共生霉素B (cocultimycin B)。

表2.化合物I-V的¹H NMR数据(600MHz,CD₃OD)

表3化合物I-V的¹³C NMR数据(150MHz,CD₃OD)

式Ⅲ所示化合物：共生霉素C的结构鉴定

白色粉末，HRESIMS显示出准分子离子峰m/z 790.4726[M+Na]⁺ (C₄₁H₆₉O₁₂NNa计算值790.4717)，确定其分子式为C₄₁H₆₉O₁₂N，比化合物Ⅰ 少两个氢原子。化合物Ⅲ的¹H NMR谱在低场区比化合物Ⅰ多了2个双键质子信 号δ_H 5.56(dt,J＝15.0,7.2Hz)和5.99(dd,J＝15.0,10.8Hz)，同时H-14和H-15也 较Ⅰ中分别向低场位移0.57和0.13ppm。相应地，化合物Ⅲ的¹³C NMR在低场区 较化合物Ⅰ多出2个sp2杂化碳信号δ_C 133.8和131.8。以上数据表明，化合物Ⅲ 中存在额外的双键。通过2D NMR(COSY、HSQC、HMBC、TOCSY、ROESY) 数据分析，确定该额外的双键取代在C-12和C-13，命名为共生霉素C (cocultimycin C)。

式IV所示化合物：共生霉素D的结构鉴定

白色粉末，HRESIMS显示出准分子离子峰m/z 794.5032[M+Na]⁺ (C₄₁H₇₃O₁₂NNa计算值794.5025)，确定其分子式为C₄₁H₇₃O₁₂N，比化合物Ⅰ多 两个氢原子。在化合物IV的¹H NMR谱中，低场区的烯键质子信号消失；而在 其¹³C NMR谱中，化学位移为δ_C 127.6(C-15)和134.0(C-14)的sp²杂化碳信号 消失，而在高场区δ_C 30.8～31.0多了2个亚甲基信号，表明在化合物IV中，C-15 和C-16的双键碳被饱和亚甲基所取代。通过2D(COSY、HSQC、HMBC、TOCSY、 ROESY)数据分析进一步确证了以上推测,命名为共生霉素D(cocultimycin D)。

共生霉素A(Ⅰ)的理化数据:白色粉末状。[α]²⁰ _D-40.7(c 1.01,MeOH)；UV (MeOH)λ_max(logε)225(3.86),282(4.16)nm；ECD(c 0.65×10^-3M)λ_max(Δε)212 (-20.04),244(+2.36),285(+2.86)nm；¹H-NMR(CD₃OD,600MHz)，见表2；¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)数据见表3；HRESIMS:m/z 770.5029[M+H]⁺(C₄₁H₇₂NO₁₂理论值为770.5049)。

共生霉素B(Ⅱ)的理化数据:白色粉末状。[α]²⁰ _D-35.7(c 0.57,MeOH)；UV (MeOH)λ_max(logε)227(3.64),282(3.91)nm；ECD(c 0.75×10^-3M)λ_max(Δε)215 (-13.28),252(+0.38),291(+1.74)nm；¹H-NMR(CD₃OD,600MHz)，见表2；¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)数据见表3；HRESIMS:m/z 776.4920[M+Na]+ (C₄₁H₇₁O₁₁NNa计算值776.4919)。

共生霉素C(Ⅲ)的理化数据:白色粉末状。[α]²⁰ _D-28.0(c 0.27,MeOH)；UV (MeOH)λ_max(logε)231(4.17),282(3.76)nm；ECD(c 0.65×10^-3M)λ_max(Δε)219 (-9.53),249(+1.20),289(+2.58)nm；¹H-NMR(CD₃OD,600MHz)，见表2；¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)数据见表3；HRESIMS:m/z 790.4726[M+Na]+ (C₄₁H₆₉O₁₂NNa计算值790.4712)。

共生霉素D(IV)的理化数据:白色粉末状。[α]²⁰ _D-42.5(c 0.41,MeOH)；UV (MeOH)λ_max(logε)282(4.09)nm；ECD(c 0.65×10^-3M)λ_max(Δε)214(-16.64),247 (+2.46),289(+2.98)nm；¹H-NMR(CD₃OD,600MHz)，见表2；¹³C NMR(CD₃OD, 125MHz)数据见表3；HRESIMS:m/z794.5032[M+Na]+(C₄₁H₇₃O₁₂NNa计算值 794.5025)。

共生霉素E(V)的理化数据:白色粉末状。[α]²⁰ _D-18.0(c 1.00,MeOH)；UV (MeOH)λ_max(logε)281(4.12)nm；ECD(c 0.82×10^-3M)λ_max(Δε)217(-17.80),249 (+0.41),287(+3.04)nm；¹H-NMR(CD₃OD,600MHz)，见表2；¹³C NMR(CD₃OD, 125MHz)数据见表3；HRESIMS:m/z630.4315[M+Na]⁺(C₃₅H₆₁O₇NNa理论值为 630.4340)

<实施例5>共生霉素A-E的抗真菌活性试验

1.实验材料

检定菌：Fusarium sp.(CPCC 400381)，Fusarium sp.(CPCC 400307)，Alternaria sp.(CPCC 400323)，Curvularia lunata(CPCC 400186)，Fusarium sp. (CPCC400381)，Curvularia sp.(CPCC 400307)，白色念球菌(Canidia Albicans ATCC 10231)、Aspergillus chevalieri IMB18-208,Aspergillus versicolor IMB17-055 为本所菌种中心或本室保藏菌株。

2.实验方法

将各检定菌株在PDA平板上进行复苏5d，使用平板上的真菌利用PBD培 养基制作孢子悬液，测定OD600为0.1，麦氏比浊度为0.5(菌落数约为1.5×10⁸ CFU/mL)；随后取出100μL上述稀释好的菌液稀释50倍(菌落数约为1.5×10⁶ CFU/mL)备用。

将上述稀释好的菌液加入96孔板中，每孔100μL,第一列加入198μL。在第 一列孔中加入2μL溶解的化合物和阳性对照药制霉菌素，随后进行二倍稀释， 分别得到一下8个浓度梯度：64、32、16、8、4、2、1和0.5μg/mL；另外在每 块孔板中设置4个阳性对照孔即加不含药的菌液，4个阴性对照孔即只含空白培 养基，8个DMSO对照孔。随后将96孔板放入28℃培养箱中培养24h，当阳性 对照与阴性对照有明显区别是，观察个孔细菌生长状态，并用酶标仪测定个孔的 OD600值，记录实验结果。

3.实验结果

除共生霉素E外，共生霉素A-D所测试真菌均显示出抑制活性。其中，对 白色念球菌显示出较好的抑制活性，其最低抑菌浓度(MIC)分别为0.5-4μg/mL， 强于制霉菌素(表4)，表明这些化合物具有抗白色念球菌感染的应用潜能。此 外，共生霉素A-D对其他丝状真菌，如植物致病菌镰刀菌属真菌(Fusarium sp.)、 链格孢属真菌(Alternaria sp.)、月状弯孢菌(Curvularia lunata)也显示出一定的抑 制作用，可应用于由有关真菌引起的植物病害的防治。

此外，共生霉素A-D对菌株IMB18-208显示出显著的抑制活性，MIC值为 4-8μg/mL，但对菌株IMB17-055没有抑制作用(MIC均>64μg/mL)。这一结果 也证实共生霉素A-E是由菌株IMB17-055因防御机制所产生的抗真菌产物。通 过基因组测序及分析，进一步确定共生霉素A-E是来自菌株IMB17-055。

表4共生霉素A-E的抗真菌活性(MIC,μg/mL)

序列表

<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所

<120> 海洋曲霉菌产生的抗真菌化合物及其制备方法

<160> 2

<210> 1

<211> 574

<212> DNA

<213> Aspergillus versicolor IMB17-055

<220>

<223> ITS

<400> 1

1 agtcgttacg tagtgacctg cggaaggatc attactgagt gcgggctgcc tccgggcgcc

61 caacctccca cccgtgacta cctaacactg ttgcttcggc ggggagccct ctcgggggcg

121 agccgccggg gactactgaa cttcatgcct gagagtgatg cagtctgagt ctgaatataa

181 aatcagtcaa aactttcaac aatggatctc ttggttccgg catcgatgaa gaacgcagcg

241 aactgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgagtctt tgaacgcaca

301 ttgcgccccc tggcattccg gggggcatgc ctgtccgagc gtcattgctg cccatcaagc

361 ccggcttgtg tgttgggtcg tcgtcccccc cgggggacgg gcccgaaagg cagcggcggc

421 accgtgtccg gtcctcgagc gtatggggct ttgtcacccg ctcgatttag ggccggccgg

481 gcgccagccg acgtccaacc atttttcttc aggttgacct cggatcaggt agggataccc

541 gctgaactta agcatatcat aagcggggga agga

Claims (10)

1.五种化合物共生霉素A-E，其特征在于，其结构如式I-V所示：

2.权利要求1所述共生霉素A-E的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将活化的保藏编号为CGMCC No.18107的花斑曲霉菌IMB17-055与另外一种丝状真菌接种于配方为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)的发酵培养基中，培养制备种子液，将两株菌的种子液等比例混合，随后按10％的接种量接种到装有PDB发酵培养基的锥形瓶中，进行共培养；

(2)将共培养发酵产物过滤得到上清液和菌丝体，上清液减压浓缩后用溶剂进行萃取，得到上清液提取物物，菌丝体用溶剂超声提取，得到菌丝体提取物；

(3)将上清液和菌丝体提取物合并，通过C18反相柱色谱分离，依次用10％、30％、50％、70％、100％甲醇溶液梯度洗脱，得到14个馏分(F₁-F₁₄)，取100％洗脱组分经凝胶柱分离，然后经HPLC制备得到式I-Ⅴ所示五个化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的液体培养基包括但不限于PDB培养基。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的共培养所需的其它丝状真菌，包括但不限于青霉属、曲霉属、支顶孢属、枝孢属的任何菌株。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵液上清液和菌丝体提取物分别为乙酸乙酯和丙酮提取得到；

其中所述的溶剂包括但不限于：氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯、甲醇、乙酸等碳链≤4的醇类，丙酮、丁酮，或以上溶剂的混合溶液。

6.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，

步骤(3)中，馏分F₁-F₁₄别为10％、30％、50％、70％、100％浓度的有机溶剂依次洗脱得到；

其中，所述溶剂包括但不限于：丙酮水溶液、碳链≤4的醇溶液、乙腈水溶液、或甲醇中一种或以上混合。

7.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，

步骤(3)中，化合物的HPLC分离纯化过程如下：

C-18色谱柱，10mm×250mm,30％MeCN,4mL/min，

其中，所述溶剂包括但不限于：丙酮水溶液、碳链≤4的醇溶液、乙腈水溶液，

其中，所述色谱柱选自：包括但不限于C18、C8、C3、苯基键合柱。

8.权利要求1所述的式I-V所示化合物共生霉素A-E，或者以式I-V所示的化合物为活性成分的药物组合物在制备治疗真菌感染的药物中的应用。

9.以式I-V所示的化合物为活性成分的药物组合物。

10.一种产生共生霉素A-E的海洋真菌菌株，其特征在于，该菌株的保藏编号为CGMCCNo.18107。

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