KR19980018741A - 폴리엔 항생제 3874 H 1 내지 H6, 이의 제조방법 및 용도 (Polyene antibiotics, 3874 H1 to H6, processes for their preparation and use) - Google Patents

폴리엔 항생제 3874 H 1 내지 H6, 이의 제조방법 및 용도 (Polyene antibiotics, 3874 H1 to H6, processes for their preparation and use) Download PDF

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KR19980018741A
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레쓰즐오 베르테지
미하엘 쿠르츠
요아힘 빈크
아스트리트 마르쿠스
빌헬름 슈탈
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야코비, 쿤켈
훽스트 아크티엔게젤샤프트
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Abstract

본 발명은 폴리엔 항생제 3874 H1 내지 H6, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
다음 구조식의 화합물, 3874 H1, 분자식: C58H86N2O18, MW 1099.3
다음 구조식의 화합물, 3874 H2, 분자식: C59H88N2O18, MW 1113.3
다음 구조식의 화합물, 3874 H3, 분자식: C57H87NO18, MW 1074.3
화합물, 3874 H4, 분자식: C58H84N2O18, MW 1097.3
화합물, 3874 H5, 분자식: C59H86N2O18, MW 1111.3
화합물, 3874 H6, 분자식: C57H85NO18, MW 1072.3은 진균성 질환을 치료하고 증가된 스테로이드 농도와 연관된 질환을 치료하는데 적합하다.

Description

폴리엔 항생제 3874 Ｈ1 내지 Ｈ6, 이의 제조방법 및 용도
본 발명은 신규의 헵타엔 항생제, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
수 많은 헵타엔 항생제가 이미 공지되어 있다. 헵타엔 항생제는 이의 특징적인 양상으로서, 함께 공액된 7개의 이중 결합을 포함하는 매크로사이클릭 락톤이다. 이들 항생제는 미생물로부터 수득되는 천연 물질이고, 항진균제, 항트리코모나제 또는 스테로이드(콜레스테롤) 결합용 제제로서 사용된다. 그러나, 이들중 일부는 매우 독성인 화합물이어서, 시판품인 암포테리신 B(The Merck Index, 제11판, 1989, 93page)를 제외하고는 폴리엔 항생제의 원형을 전신 투여(주입)에 사용하지 못한다. 진균성 질환의 증가로 인해, 공지된 폴리엔 항생제보다 유효하거나 보다 내성이 강한 신규의 항진균성 항생제에 대한 필요성이 상당히 지속적으로 대두되고 있다.
놀랍게도, 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spec.) HAG 3874, DSM 11007이 매우 효과적일 뿐만 아니라 몇몇 경우에서는 내성이 매우 강한, 고도의 활성을 지닌 신규의 헵타엔 항생제를 생산할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다.
도 1은 메탄올 중에서 기록된 3874 H1의 자외선 흡수 스펙트럼이다.
도 2는 메탄올 중에서 기록된 3874 H3의 자외선 흡수 스펙트럼이다.
따라서, 본 발명은 다음 구조식 및 분자식을 갖는 화합물 3874 H1 내지 H6, 및 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 이들의 명백한 화학적 등가물에 관한 것이다.
화합물 3874 H1, 분자식: C58H86N2O18, MW 1099.3
화합물 3874 H2, 분자식: C59H88N2O18, MW 1113.3
화합물 3874 H3, 분자식: C57H87NO18, MW 1074.3
화합물 3874 H4, 분자식: C58H84N2O18, MW 1097.3
화합물 3874 H5, 분자식: C59H86N2O18, MW 1111.3
화합물 3874 H6, 분자식: C57H85NO18, MW 1072.3.
항생제 3874 H1 내지 H6은 언급된 구조식과 분자식 및 본 발명에 따르는 모든 화합물에서 동일한 △28/29 및 △30/31 위치에서 2개의 시스 이중 결합으로 인해, 당해 선행 기술 분야에서 공지된 물질과는 상이하다. 본 발명에 따르는 화합물은 특징적인 자외선 스펙트럼을 지닌다.
본 발명은 추가로, 당해 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 당해 화합물을 제조하는 한가지 방법은 스트렙토마이세스 종 HAG 3874(DSM 11007) 미생물을 수성 영양 배지에서 배양한 다음, 표적 화합물을 분리 및 정제시킴을 포함한다. 상기 미생물은 부다페스트 조약하에 1996년 6월 18일자로 국제기탁기관[Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig]에 수탁번호 DSM 11007로 기탁되었다.
스트렙토마이세스 종(DSM 11007)은 백색의 호기성 균사체와 회색의 포자 쇄를 갖는다. 이는 스트렙토마이세스의 특징적인 포자 쇄를 형성한다. 탄소 공급원과 질소 공급원에 덧붙여 통상의 무기 염을 함유하는 영양 용액에서 스트렙토마이세스 종(DSM 11007)은 당해 화합물 3874 H1 내지 H6를 생산한다.
또한, 균주 DSM 11007 대신 이의 돌연변이체 및 변이체가 본 발명에 따르는 화합물을 합성하는 한 이들을 사용하는 것도 가능하다. 이들 돌연변이체는 물리적 수단, 예를 들면, 자외선 또는 X-선과 같은 조사, 또는 화학적 변이유발원, 예를 들면, 에틸 메탄설포네이트(EMS); 2-하이드록시-4-메톡시벤조페논(MOB) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG)에 의해 공지된 방법으로 생성시킬 수 있다.
본 발명에 따르는 항생제를 생산하는 돌연변이체 및 변이체에 대한 스크리닝은, 예를 들면, 다음에 기술된 방법으로 항진균성 활성을 시험하여, 배양 브로쓰에 축적된 활성 물질의 생물학적 활성을 측정함으로써 수행할 수 있다.
호기성 발효에 적합하고도 바람직한 탄소 공급원은 적응 가능한 탄수화물 및 당 알콜, 예를 들면, 글루코즈, 락토즈 또는 D-만니톨, 및 탄수화물 함유 천연 생성물, 예를 들면, 맥아 추출물이다. 적합한 질소 함유 영양분은 아미노산, 펩타이드 및 단백질, 및 이들의 분해 생성물, 예를 들면, 펩톤 또는 트립톤, 또한 고기 추출물, 본쇄된 종자(예: 옥수수, 밀, 콩, 대두 또는 면 식물), 알콜 생성으로부터의 증류 잔사, 고기 밀 또는 효모 추출물뿐만 아니라 암모늄 염 및 질산염이다. 영양 용액내에 함유될 수 있는 무기 염은, 예를 들면, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속, 철, 아연, 코발트 및 망간의 염화물, 탄산염, 황산염 또는 인산염이다.
당해 헵타엔 3874 H1 내지 H6의 생산은, 예를 들면, 각 경우에 있어서 완전한 영양 용액의 중량을 기준으로 하여 글루코즈 약 0.5 내지 5%, 바람직하게는 1 내지 2%, 대두 밀 0.5 내지 5%, 바람직하게는 1 내지 2%, 옥수수액, 바람직하게는 0.2 내지 1%, CaCO30.05% 내지 1.0%, 바람직하게는 0.1 내지 0.5%, 및 NaCl 0.1% 내지 0.5%, 바람직하게는 0.2 내지 1%를 함유하는 영양 용액에서 특히 잘 수행된다.
배양은 호기적으로, 즉 예를 들면, 경우에 따라 공기 또는 산소를 도입하면서 진탕 플라스크 또는 발효기에서 진탕 또는 교반시키면서 침지시킨다. 발효는, 예를 들면, 각종 용적의 목이 넓은 병 또는 환저 플라스크, 유리 발효기 또는 스텐레스 스틸 탱크에서 수행할 수 있다. 이는 약 20 내지 35℃, 바람직하게는 약 25 내지 30℃에서 수행할 수 있다. pH는 4 내지 10, 유리하게는 5.5 내지 8.5이어야 한다. 상기 미생물은 일반적으로 이들 조건하에서 20 내지 300시간, 바람직하게는 24 내지 140시간 동안 배양한다. 배양은 유리하게는 여러 단계로 수행하는데, 즉 초기에는 하나 이상의 예비배양물을 액체 영양 배지에서 준비한 다음, 실제 생산 배지, 즉 주 배양물에, 예를 들면, 1:10용적비로 옮긴다. 예비배양물은, 예를 들면, 포자 형성된 균사체를 영양 용액에 옮긴 다음, 이를 약 20 내지 120시간, 바람직하게는 24 내지 72시간 동안 성장시킴으로써 수득한다. 포자 형성된 균사체는, 예를 들면, 균주를 고체 또는 액체 영양 배지, 예를 들면, 효모-맥아 한천 또는 감자-덱스트로즈 한천에서 약 1 내지 40일, 바람직하게는 3 내지 10일 동안 성장시킴으로써 수득할 수 있다.
발효의 진행 및 당해 항생제 3874 H1 내지 H6의 생산은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면, 생검정법으로 생물학적 활성을 시험하거나 박층 크로마토그래피(TLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등의 크로마토그래피 방법으로 수행할 수 있다.
균주 HAG 3874(DSM 11007)의 특징은 이러한 균주가 헵타엔 이외에도, 당해 분야에 공지된 항생제인 카바조마이신 B 및 핌프리닌을 생산할 수 있다는 것이다.
당해 항생제 3874 H1 내지 H6는 균사체와 배양 여액 모두에 존재할 수 있으나, 대부분의 양은 통상적으로 바이오매스(균사체)에서 발견된다. 따라서, 균사체를 여과 또는 원심분리시킴으로써 여액으로부터 분리시키는 것이 편리하다. 여액은 물과 비혼화성인 용매, 예를 들면, 1-부탄올, 에틸 아세테이트, 클로로포름 등으로 추출한다. 균사체는 메탄올 또는 아세톤으로 추출하는 것이 편리하지만, 물과 비혼화성인 상기 언급된 염을 사용할 수도 있다.
이러한 추출은 광범위한 pH 범위에서 수행할 수 있지만, 중성 배지, 바람직하게는 pH 5 내지 9에서 작동시키는 것이 편리하다. 유기 추출물을 농축시킨 다음 예를 들면 진공하에 건조시킬 수 있다.
헵타엔 3874 H1 내지 H6을 분리하는 한가지 방법은 공지된 방법으로 용액을 분별시키는 것이다.
또 다른 정제 방법은 흡착 수지, 예를 들면, 디아이온(Diaion) HP-20(Mitsubishi Casei Corp., Tokyo), 앰버라이트(Amberlite) XAD 7(Rohm and Haas, USA), 앰버크롬(Amberchrom) CG(Toso Haas, Philadelphia, USA) 상에서 크로마토그래피하는 것이다. 이러한 분리는 광범위한 pH에서 수행할 수 있다. pH 1 내지 13의 범위가 바람직하고, pH 2 내지 12의 범위가 특히 바람직하다. 또한, 예를 들면, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 분야에서 일반적으로 공지된 바와 같이 수 많은 역상 지지체(예: RP18)가 적합하다.
본 발명에 따르는 항생제를 정제하는 또다른 가능한 방법은 소위 정상 크로마토그래피 지지체, 예를 들면, 실리카겔 또는 Al2O3등을 공지된 방법으로 사용하는 것이다. 많은 용액 및 이들의 혼합물, 예를 들면, 피리딘 등의 염기성 용매가 첨가된 클로로포름/메탄올 혼합물이 상기와 같은 목적에 적합하다.
또다른 분리 방법은 분자체, 예를 들면, 프락토겔(Fractogel) TSK HW-40, 세파덱스(Sephadex) LH-20 등을 공지된 방법으로 사용하는 것이다. 더욱이, 당해 헵타엔을 증균된 물질로부터 결정화시킴으로써 분리할 수 있다. 이에 적합한 것은, 예를 들면, 유기 용매, 또는 무수이거나 물이 첨가된 이들 유기 용매의 혼합물이다. 본 발명에 따르는 항생제를 분리 및 정제하는 부가의 방법은 바람직하게는 pH 7 내지 10의 범위의 음이온성 교환체, 및 바람직하게는 pH 3 내지 7의 범위의 양이온 교환체를 사용하는 것을 포함한다. 일정 비율의 유기 용매가 첨가된 완충 용액이 상기 목적에 특히 적합하게 사용된다.
당해 항생제 3874 H1 내지 H6 또는 이의 화학적 유도체는 당업자에게 공지된 방법으로 상응하는 약리학적으로 적합한 염으로 전환시킬 수 있다.
본 발명에 따르는 화합물의 명백한 화학적 등가물은 약간의 화학적 차이를 지닌, 즉 동일한 활성을 지니거나 또는 온화한 조건하에서 본 발명에 따르는 화합물로 전환되는 화합물이다. 이러한 등가물로는, 예를 들면, 본 발명에 따르는 화합물의 또는 이러한 화합물과의 에스테르, 아미노 유도체, 복합체 또는 부가물이 있다.
본 발명에 따르는 화합물의 약리학적으로 적합한 염은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, page 1418, 1985]에 기술된 바와 같은 무기 및 유기 염 모두를 의미한다. 알칼리 금속, 암모늄 및 알칼리 토금속 염, 생리학적으로 허용되는 아민과의 염, 및 무기 또는 유기산, 예를 들면, HCl, HBr, H2SO4, 말레산 및 푸마르산과의 염이 특히 적합하다.
본 발명에 따르는 항생제의 물리화학적 특성 및 분광측정에 의한 특성은 다음과 같이 요약될 수 있다.
화합물 3874 H1
외관:
메탄올, 아세토니트릴 및 클로로포름에 가용성인 황녹색 물질. 중성 및 약 알칼리성 매질에서는 안정하지만, 산성 및 강알칼리성 용액에서는 불안정하고 또한 빛, 열 및 산소에 대한 노출에 불안정하다.
분자식: C58H86N2O18
분자량: 1099.3
1H-NMR: 표 1 참조
UV 최대(log ε): 232nm(4.49), 286nm(4.32), 338nm(4.64), 357nm(4.86), 377nm(5.00), 398nm(4.98)
화합물 3874 H2
외관:
메탄올, 아세토니트릴 및 클로로포름에 가용성인 황녹색 물질. 중성 및 약 알칼리성 매질에서는 안정하지만, 산성 및 강알칼리성 용액에서는 불안정하고 또한 빛, 열 및 산소에 대한 노출에 불안정하다.
분자식: C59H88N2O18
분자량: 1113.3
UV 최대(log ε): 232nm(4.49), 286nm(4.32), 338nm(4.64), 357nm(4.86), 377nm(5.00), 398nm(4.98)
화합물 3874 H3
외관:
메탄올 및 기타 저급 알콜, 아세토니트릴 및 클로로포름에 가용성인 황녹색 물질. 중성 및 약알칼리성 매질에서는 안정하지만, 산성 및 강알칼리성 용액에서는 불안정하고 또한 빛, 열 및 산소에 대한 노출에 불안정하다.
분자식: C57H87NO13
분자량: 1074.3
1H-NMR: 표 1 참조
UV 최대(log ε): 233nm(4.39), 241nm(4.39), 249nm(4.28), 275nm(4.41), 341nm(4.54), 358nm(4.82), 378nm(5.00), 399nm(4.94)
화합물 3874 H4
외관:
메탄올, 아세토니트릴 및 클로로포름에 가용성인 황녹색 물질. 중성 및 약 알칼리성 매질에서는 안정하지만, 산성 및 강알칼리성 용액에서는 불안정하고 또한 빛, 열 및 산소에 대한 노출에 불안정하다.
분자식: C58H84N2O18
분자량: 1097.3
UV 최대(log ε): 232nm(4.49), 286nm(4.32), 338nm(4.64), 357nm(4.86), 377nm(5.00), 398nm(4.98)
화합물 3874 H5
외관:
메탄올, 아세토니트릴 및 클로로포름에 가용성인 황녹색 물질. 중성 및 약 알칼리성 매질에서는 안정하지만, 산성 및 강알칼리성 용액에서는 불안정하고 또한 빛, 열 및 산소에 대한 노출에 불안정하다.
분자식: C59H86N2O18
분자량: 1111.3
UV 최대(log ε): 232nm(4.49), 286nm(4.32), 338nm(4.64), 357nm(4.86), 377nm(5.00), 398nm(4.98)
화합물 3874 H6
외관:
메탄올 및 기타 저급 알콜, 아세토니트릴 및 클로로포름에 가용성인 황녹색 물질. 중성 및 약알칼리성 매질에서는 안정하지만, 산성 및 강알칼리성 용액에서는 불안정하고 또한 빛, 열 및 산소에 대한 노출에 불안정하다.
분자식: C57H85NO13
분자량: 1072.3
1H-NMR: 표 1 참조
UV 최대(log ε): 233nm(4.39), 241nm(4.39), 249nm(4.28), 275nm(4.41), 233nm(4.39), 341nm(4.54), 358nm(4.82), 378nm(5.00), 399nm(4.94)
우수한 용해도는 본 발명에 따르는 항생제가 유리하게는, 상기 용매 등에서 극히 낮은 용해도만을 나타내므로 사용할 때 상당한 문제점을 야기시키는 암포테리신 B와는 상이하다는 것을 의미한다.
17℃에서 듀테로메탄올중에서 기록된 3874 H3 및 3874 H1의1H-NMR 스펙트럼의 화학적 이동
C 원자상의 위치 3874 H3 3874 H1 C 원자상의 위치 3874 H3 3874 H1
1 - - 29 6.61 6.61
2 2.49/2.14 2.45/2.15 30 6.51 6.51
3 4.28 4.28 31 6.06 6.06
4 1.66/1.41 1.66/1.41 32 6.82 6.82
5 3.36 3.37 33 6.22 6.20
6 1.30 1.30 34 6.19 6.20
7 1.84/1.12 1.85/1.11 35 5.38 5.38
8 1.31 1.30 36 2.48 2.48
9 3.69 3.70 36-Me 1.02 1.02
10 1.44 1.43 37 4.76 4.77
11 4.04 4.05 38 1.85 1.86
12 1.52/1.25 1.51/1.38 38-Me 0.98 0.98
13 4.43 4.42 39 1.36 1.40
14 1.72/1.56 1.72/1.55 40 1.58/1.46 1.62/1.51
15 - - 41 3.97 4.06
16 2.00/1.24 1.99/1.24 42 2.68 2.98/2.92
17 4.25 4.25 43 - -
18 1.99 1.99 44 6.10 -
18-CO - - 45 7.23 7.75
19 4.38 4.39 46 6.26 6.62
20 2.24/1.68 2.24/1.67 47 6.28 -
21 4.37 4.38 48 1.87 -
22 6.10 6.10 1' 4.53 4.54
23 6.17 6.17 2' 3.85 3.88
24 6.50 6.49 3' 2.71 2.80
25 6.35 6.35 4' 3.12 3.17
26 6.50 6.49 5' 3.21 3.23
27 6.79 6.79 5'-Me 1.24 1.25
28 6.28 6.28
더욱이, 본 발명에 따르는 화합물은 극도로 강력한 살진균성 효과를 나타내고, 또한 이러한 활성은 광범위한 진균 속 및 효모에 대해서도 적용된다는 것이 밝혀졌다. 다음 표 2는 예로써 3874 H1 및 3874 H3의 최소 억제 농도를 요약한 것이다.
피부사상균, 효모 및 사상균에 대한 시험관내 활성
최소 억제 농도, MIC(㎍/ml)
균주 3874 H1 3874 H3
피부사상균
티. 멘타그로파이트 100/25 4 8
티. 루브륨 101/58 16 16
이. 플로코슘 190/143 16 16
효모
씨. 알비칸스 ATCC 90028 2 4
씨. 알비칸스 ATCC 90029 2 4
씨. 글라브라타 ATCC 90030 4 4
씨. 글라브라타 베를린 12 2 4
씨. 크루세이 203/230 4 4
씨. 크루세이 베를린 1 2 2
씨. 트로피칼리스 201/201 2 4
씨. 트로피칼리스 201/202 2 4
씨. 슈도트로피칼리스 202/218 2 4
씨. 파랍실로시스 ATCC 90018 4 4
씨. 네오포르만스 ATCC 90112 2 2
곰팡이
에이. 니거 ATCC 16404 2 8
에이. 푸미가투스 ATCC 9197 4 4
에이. 플라부스 ATCC 9643 8 16
배양: 35℃에서 48시간(효모) 또는 30℃에서 6일(피부사상균 및 곰팡이)
본 발명에 따르는 항생제의 우수성은 특히, 당해 화합물이 시험 미생물을 함유하는 한천 층에서 확산되는 소위 확산 시험에서 나타났다. 이때, 억제 영역의 직경이 당해 항생제의 활성에 대한 측정치이다(표 3).
암포테리신 B와 비교한, 항생제 3874 H1 및 H3에 의해 야기된 농도-의존성 억제 영역(mm)
농도(mg/ml) 3874 H1 3874 H3 암포테리신 B
0.2 26 22 14
0.1 25 20 12
0.05 24 18 10
0.025 21 14 8
0.0125 19 13 0
0.0063 17 12 0
본 발명에 따르는 화합물의 효과는 몇몇 경우에서는 시판품인 암포테리신 B의 효과보다 상당히 더 탁월하므로 매우 유용한 제제임을 나타낸다. 이러한 당해 화합물의 효과는 아마도 헵타엔/에르고스테롤 복합체로서 에르고스테롤과 결합하는 신규 헵타엔의 능력으로부터 기인된 것이다. 에르고스테롤은 진균 원형질 막의 필수 구성분이다. 이러한 복합체 형성은 막내의 에르고스테롤을 변형시켜 원형질 막의 구조가 손상되고 진균 세포가 사멸하게 된다.
온혈 동물 세포에서의 에르고스테롤에 상응하는 막 구성분은 콜레스테롤이다. 문헌에 기술된 많은 헵타엔은 콜레스테롤뿐만 아니라 에르고스테롤과 결합하므로, 독성 화합물이다. 당해 항생제 3874 H3 및 H6은 특히, 콜레스테롤 보다는 에르고스테롤과 강하게 결합하기 때문에, 이들 화합물은 사람 및 동물에 있어서 진균 감염을 억제시키는데 특히 적합하다.
항진균성 효과 이외에도, 본 발명에 따르는 항생제는 원충류, 예를 들면, 트리코모나스(Trichomonas) 종에 대해 탁월한 억제 효과를 나타낸다.
그러나, 콜레스테롤 또는 스테롤 결합 능력으로 인해, 당해 화합물 3874 H1 내지 H6은 또한 과도하게 높은 농도의 스테로이드가 바람직하지 않은 경우에는 언제든지 의약으로서 사용될 수도 있다. 이의 예는 일반적으로 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것이거나, 보다 구체적으로는 양성의 전립선 비대증을 치료하는 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 약제로서의 본 발명에 따르는 화합물의 용도, 및 진균성 감염을 치료 및/또는 예방하고 증가된 스테로이드 농도와 연관된 질환을 치료하기 위한 약제 제조용의 관련 화합물의 용도에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 본 발명에 따르는 화합물을 하나 이상 함유하는 약제에 관한 것이다.
본 발명에 따르는 약제는 경구, 비경구(정맥내), 직장 또는 국소(국부)적으로 사용할 수 있다. 이들은 용제, 산제, 정제, 캅셀제(미소캅셀제 포함), 연고(크림 또는 겔), 리포좀 생성물, 지질 복합제, 콜로이드성 현탁제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 이들 유형의 제형에 적합한 보조 물질은 통상의 액체 또는 고체 약제학적 벌크제 및 증량제, 용매, 유화제, 윤활제, 차단 향료, 염료 및/또는 완충 물질이다. 편리한 투여량은 0.1 내지 10mg/체중 kg, 바람직하게는 0.2 내지 8mg/체중 kg이다. 당해 약제는 적어도 본 발명에 따르는 화합물의 유효한 1일 투여량, 예를 들면, 30 내지 3000, 바람직하게는 50 내지 1000mg을 함유하는 용량 단위로 투여하는 것이 편리하다.
본 발명은 다음 실시예 및 특허청구의 범위에 의해 보다 상세히 설명되어야 한다.
실시예 1
생산자 균주의 포자 현탁액의 제조
500ml 들이 멸균 에를렌마이어 플라스크중의 영양 용액 100ml(맥아 추출물 20g, 효모 추출물 2g, 글루코즈 10g, 수돗물 1L중의 (NH4)2HPO40.5g, 살균전의 pH 6.0)을 균주에 접종한 다음 25℃에서 72시간 동안 140rpm하에 회전 진탕기상에서 배양한다. 연속적으로, 배양액 120ml를, 고형화를 위해 한천 15g/l를 또한 첨가시킨 영양 배지 오트밀을 2.0g/l로 주입하면서 500ml 들이 멸균 에를렌마이어 플라스크에 균질하게 분산시키고, 경사한다. 이러한 배양물을 25℃에서 10 내지 14일 동안 배양한다. 이 후에 하나의 플라스크중의 생성된 포자를 시판되고 있는 비이온성 계면활성제(예를 들면, Serva에 의해 공급된 Triton × 100) 1방울을 함유하는 탈이온수 500ml로 세정하고, 다음 단계에 즉시 사용하거나 50% 글리세롤중에서 -22℃하 또는 10% 디메틸 설폭사이드중에서 -140℃하에 저장한다.
실시예 2
에를렌마이어 플라스크에서 생산자 균주의 배양물 또는 예비배양물의 제조
실시예 1에 기술된 영양 용액 100ml을 함유하는 500ml 들이 멸균 에를렌마이어 플라스크에, 사면 튜브중에서 성장시킨 배양물 또는 포자 현탁액 0.2ml를 접종한 다음, 암실에서 25℃하에 140rpm으로 진탕기상에서 배양한다. 약 72시간 후에 본 발명에 따르는 화합물의 최대 생산에 도달하게 된다. 동일한 배양 용액으로부터 72시간 동안 침지된 배양물은 10 및 100L 발효기에 접종되기에 충분하다(접종물 약 5%).
실시예 3
항생제 3874 H1 내지 H6의 생산
10L 발효기는 다음 조건하에서 작동시킨다:
영양 배지: 글루코즈 15g/l
대두 밀 15g/l
옥수수액 5g/l
CaCO32g/l
NaCl 5g/l
pH 7.0 (멸균 전)
배양 시간: 24 또는 48시간
배양 온도: 25℃
교반 속도: 200rpm, 빛을 배제시킴
통기율: 공기 5L/min
발포 형성은 여러 방울의 에탄올성 폴리올 용액의 반복된 첨가에 의해 억제될 수 있다. 48시간 후에 최대 생산에 도달하게 된다.
실시예 4
항생제 3874 H1 내지 H6의 분리
실시예 3에서 수득된 배양 용액 9L를 원심분리시키고, 각각 메탄올 2.2L로 2회 교반시킴으로써 바이오매스(약 1.1L)를 추출시킨다. 합한 추출물을 진공하에 농축 건조시키며, 건조 물질을 디에틸 에테르로 분해시킨다. 이와 같은 방식으로 세척하여 탈지시킨 잔사(41g)을 25% 이소프로판올/75% 물에 용해시키고, 용량이 3L이고 MCl Gel CHP20P 흡착 수지가 팩킹된 칼럼상에 부하한다. 이러한 칼럼의 치수는 다음과 같다: 폭 × 높이: 11.3cm × 30cm. 수중 25% 이소프로판올로부터 100% 이소프로판올까지의 용매 구배는 용출을 위해 사용하고, 칼럼으로부터의 유출액을 2L 분획으로 수집한다.
HPLC 분석에 의해 검사된 헵타엔 함유 분획을 수집하고 진공하에 건조시킨 다음, 동결 건조시킨다(3.2g).
실시예 5
헵타엔 3874 H1 내지 H6의 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)
칼럼: Nucleosil 100 - 5 C18AB, 250/4
이동 상: 10mM 인산칼륨중의 37.5% 아세토니트릴, pH 7.0
유동율: 1ml/분
320nm에서 UV 흡광에 의한 검출
개개의 성분에 대해 밝혀진 보유 시간은 다음 표 4에서와 같다. HPLC/질량 분광계에 의해 측정된 상응하는 분자량(M+H)+가 또한 지시된다. HPLC-MS에 대하여 인산염 완충액 대신 10mM 암모늄 아세테이트가 사용된다.
보유 시간 화합물 (M+H)+
7.05분 3874 H1 1099.6
8.64분 3874 H4 1097.7
13.93분 3874 H2 1113.7
17.90분 3874 H5 1111.8
19.23분 3874 H3 1074.5
24.28분 3874 H6 1072.5
실시예 6
3874 H 성분의 증균
실시예 4에서 수득된 생성물 2g을 용량이 3L이고 Fractogel TSK MW-40s(폭 × 높이=10cm × 50cm)로 팩킹된 칼럼에 부하한다. 이동상 메탄올을 50ml/분의 유동율로 칼럼내로 펌핑하고, 칼럼으로부터의 유출액을 여러 분획으로 수집한다(65ml). 분획 28 내지 35는 주로 항생제 3874 H3(건조 후: 210mg)을 함유하고, 분획 39 내지 43은 3874 H6(9mg)을 함유하며, 분획 50 내지 60은 3874 H1 및 H2(280mg)을 함유하고, 최종적으로 분획 71 내지 78은 화합물 3874 H4 및 H5(17mg)을 함유한다.
실시예 7
3874 H1, H2 및 H3의 최종 정제
실시예 6에서 수득된 증균된 항생제 3874 H1 및 H2(280mg) 및 3874 H3(210mg)을 각각 수중 25% 내지 50% 아세토니트릴을 이용한 구배 방법으로 Nucleosil 12C18AB HPLC 칼럼(폭 × 높이=3.2cm × 25cm)상에서 분획화한다. 이러한 분획을 HPLC(실시예 5 참조)하여 검사하고 적당하게 합하며, 진공하에 건조시킨 다음 동결 건조시킨다. 이로써,
95% 순도의 3874 H1 29mg,
94% 순도의 3874 H2 11mg,
97% 순도의 3874 H3 65mg가 생성되었다.
실시예 8
인산염 완충액/이소프로판올 시스템중에서 제조용 HPLC에 의한 최종 정제
10mM 인산칼륨 완충액(pH 7)을 사용하고 이동상으로서 이소프로판올을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 7에서와 같이 수행한다. 실시예 7에서와 같이 분리된 성분을 탈염시킨다.
97% 순도의 3874 H1 38mg,
96% 순도의 3874 H2 21mg,
98% 순도의 3874 H3 83mg.
본 발명에 따르는 항생제 3874 H1 내지 H6은 진균성 질환을 치료하고 증가된 스테로이드 농도와 연관된 질환을 치료하는데 적합하다.

Claims (10)

  1. 다음 구조식 및 분자식을 갖는 화합물 3874 H1, H2, H3, H4, H5 또는 H6, 및 이의 생리학적으로 허용되는 염 및 이의 명백한 화학적 등가물.
    3874 H1, 분자식: C58H86N2O18, MW 1099.3
    3874 H2, 분자식: C59H88N2O18, MW 1113.3
    3874 H3, 분자식: C57H87NO18, MW 1074.3
    3874 H4, 분자식: C58H84N2O18, MW 1097.3
    3874 H5, 분자식: C59H86N2O18, MW 1111.3
    3874 H6, 분자식: C57H85NO18, MW 1072.3.
  2. 제1항에 있어서, 미생물 DSM 11007, 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체중의 하나를 적합한 조건하에서 발효시키고, 화합물 H1 내지 H6중의 하나 이상을 분리시킨 다음, 이들을 경우에 따라 이들의 염 또는 화학적 등가물로 전환시킴으로써 제조될 수 있는 화합물.
  3. 미생물 DSM 11007, 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체중의 하나를 적합한 조건하에서 발효시키고, 화합물 H1 내지 H6중의 하나 이상을 분리시킨 다음, 이들을 경우에 따라 이들의 염 또는 화학적 등가물로 전환시킴을 포함하여, 제1항에 따르는 화합물을 제조하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 발효를 20 내지 35℃ 및 pH 4 내지 10에서 호기성 조건하에 수행하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 화합물.
  6. 진균성 질환 또는 트리코모나드(trichomonad)에 의해 야기된 질환 치료용 약제를 제조하기 위한, 제1항 또는 제2항에 따르는 화합물의 용도.
  7. 증가된 스테로이드 농도와 연관된 질환 치료용 약제를 제조하기 위한, 제1항 또는 제2항에 따르는 화합물의 용도.
  8. 제1항 또는 제2항에 따르는 화합물을 하나 이상 함유하는 약제.
  9. 제1항 또는 제2항에 따르는 하나 이상의 화합물을 적합한 보조 물질 및/또는 부형제와 함께 적합한 투여형으로 전환시킴을 포함하여, 제8항에 따르는 약제를 제조하는 방법.
  10. 스트렙토마이세스 종(Streptomyces species) DSM 11007.
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