TW514664B - Novel polyene antibiotics, 3874 H1 to H6, processes for their preparation and use - Google Patents

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514664 A7 B7 五、發明説明（i ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 敘述 新穎多烯抗生素3874H至，其製法及用途。 本發明相關於新穎庚烯抗生素，其製法及用途。 現已有所述及許多庚烯抗生素。庚烯抗生素為巨環内酯， 其特徵係包含經共軛而在一起的7個雙鍵&其係得自於微 生物之天然物質，且經作成抗真菌藥、抗毛滴蟲藥或用於 結合類固醇（膽固醇）試劑在使用β然而，其部分係非常 毒的化合物，為此原因，降商業產品兩性黴素(aniphotqicin) B (默克、索引(Merck index)，第 11 版，1989，第 93 貧） (多烯抗生素之原型）外，均不使用在全身性（經注射） 上。由於真菌性疾病的增加，對於能較已知抗生素有著更 為有效或更經耐受之新轉抗真菌悻抗生素，係有持續性的 需求。 令人驚奇地，現已發現到鏈黴菌種HAG 3874， DSM11007，能夠製造新穎、高活性之庚烯抗生素，其不 僅是非常有效，且在一些個例子中，耐受性亦是良好的， 因此，本發明係相關於化合物3874 H1-H6及其生理上可财 受之鹽類，以及其明顯之化學相等物。 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 514664 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

(讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用丰國搏家標^f€NS~^A4規 ί:·4- -^17 514664 Α7 Β7 五、發明説明（3 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 3874 H4，分子式：C58H84N20i$，分子量 1097.3 3874 H5，分子式：C59H86N2018，分子量 1U1.3 3S74H6，分子式：C57H85NO18，分子量 1072.3。 由於根罈本發明所有化合物所示之結構及分子式，以及位 於厶2幺/29和八30/31位置上之順式((^)雙鍵係相同，是故， 抗體3$74H1至H6 ’係不同於參考文獻中所揭示之物質。 根據本發明之化合物其係具有特牲紫外線光譜。 本發明進一步係相關於掣備該化合物之方法。一楂製備該 化合物之方法，係包含培養存於水性鲁養培養基之微生物 鏈黴菌種HAG3874(DSM 110〇7)，並於随後自其分離且純 佴出標的化合物。諫微生物係依布達佩斯(Budapest)條约之 條款，於1996年，六月廿一日，寄存於德國微生物及細胞 培養保存中心(Deutsche Sammlung von Mik^oofganiisnieii undZellkulturen)，不倫瑞克(Braunschweig)D-38124，馬什 爾歐德(Mascheroder)輅 lb，寄存號碼 I)SlVil l007 〇 鏈黴菌種DSM 11007係具有白色氣生菌絲體及灰色孢子 鏈。其形成鏈黴菌屬所具有孢子鏈夂特徵,。在令有碳來源 及氮來源，加上一般無機鹽類之營養溶液中，鍵徽菌種 DSM 11007可製造出化合物3874H1至H6。 只要能夠合成根據本發明之化合物，使用其突變株及變異 5 尽紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ΐ〇χ297公釐） ----------'哀-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 514664 A7 B7 五、發明説明（4 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 株(variants)，以替代菌株DSM 11007亦無不可。藉由物理 方法，以本質上為熟知之方式，請如照射，如紫外線或χ 射線，或化孥突變劑，如甲磺酸乙酯(EMS)，2-經-4-甲氧 二苯基Sl^(MOB)或Ν-甲基-Ν’-亞頌基確基脈(MNNG)而 製得該突變株。 用於篩選製造根據本發明抗生素之突變株及變異株，可由 測定聚積於培養肉湯中活性物質之生物活性所取代，例如 藉由底下所述之方法測定抗真菌作用。 適宜且較隹作為用於有氧發酵作用之碳來源，係可同化尤 碳水化合物及糖醇(sugar alcohols)，例如葡萄掩、乳糖或 1>甘露糖醇，以及含碳水化合物之天然物，諸如，例如麥 芽萃取物。適宜之含氮營養物為：胺基酸、肽及蛋白質以 及其降解產物，例如竦或胰化蛋白竦，肉類萃取物亦可， 研磨例如玉米、小麥、蠶豆、大豆或棉樹之種子，來自酒 精製造時之蒸餾殘餘物，肉粉或酵母菌萃取物，銨鹽友硝 酸鹽亦是。營養溶液之無機鹽類可包含，例如鹼金屬或鹼 土金屬、鐵、鋅、姑及錳之氣化物、碳酸犟、硫酸鹽或磷 酸鹽。 為使庚烯3874 H1至H6之產物生產得好，尤其是在於， 例如含有約0.5至5%葡萄糖（較佳為1至2%)，0.5至 5 0/〇大豆粉（較佳為1至2 %)，玉米漿(comsteep)(較佳 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ---^装· •訂 314664

i 1 - 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 〇·2 至 1 %)，0·05 至 1·0 % CaC〇3(較佳為 0.1 至 0.5 ο/。）， 以及0.1至2%NaCl (較佳為〇·2至1 之營養溶液中 (以上係依照全部營養溶液之重量計）。 於有氧下進抒培養，即，例如浸在經搖盪或攪拌之攪拌埯 瓶或發酵罐中，其中適時地將空氣或氡氣加入。發酵作用二 例心寸於具有各式容積之廣顧瓶或圓底繞瓶，破璃發酵罐 或不鏽鋼槽中堆行β此反應係自約2〇至35 $之溫度範圍 内，較佳為25至30 °C下埠行。ΡΗ值則係介於4及1〇之 間，較優者為5.5至8.5。通常，於此等條件下培養該微生 叙達20至300小時’較隹為24至140小時。較佳進行培 養係於數個步驟下進疗，即，最初於液體營養培養基下了 製備“或更多個前培養物，然後轉移至實際生產用之培養 f (主要培養基），例如以體積！ ： 1〇之比如卜將所得之 前培養物，例如，藉由將形成孢子之菌絲體轉移至營養溶 液中，並容許其生長達約20至120小時，較佳為24至72 小時。形成蹲子之菌絲體，例如可藉由容許將該株生長於 固體或液體營養垮養基，如酵母菌〜麥芽瓊脂或馬鈴薯一 右旋糖瓊脂中，達約1至40天，較佳為3至1〇天而獲得―。 於發酵作用進展及生產抗生素3874 H1至H6後，繼之以 I於該項技聲人士所熟知之方法，例&，諸如生物測定中 之备測生物雜或騎術，如薄騎層分浦(TLC)或高 效率液相色層分析術(HPLC)。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) :裝_ 訂 7 514664 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（6 ) 菌株HAG 3874 (DSM 11007)之特徵在於其可製造咔唑黴 素B及pimprinin (其係春考文獻中所熟知之抗生素），以 及康烯。 抗生素3874 H1至H6寸於菌絲體或培養基濾液二者中出 現，而主要產量一般係以生物量(biomass)(菌絲體）之方 式两經發現β因此，藉由過濾或離心作用，將後者自濾液 中分離出係權宜之處皇以與水不亙溶灸溶劑，例如，諸 如1·丁醇、ZV綾乙酯、氣仿等等來萃取該濾液。甲醇或丙 酮則適合於菌絲體之萃取，但亦可使用上迷所提之與水不 互溶之鹽類。 萃表係可於廣泛pH值之範圍下進行，但適宜之操作，係 於中性培養基中進行，較佳係介於pH 5及pH 9之間。譬 如，有機萃取物可於真空下綠濃縮及乾燥。 一種用於分離庚烯3874 H1至H6之方法，係按本質上為 已知之方式，以進行溶液分配。 另外之純化方法係於吸附樹脂，例如，諸如Diaino® HP， 20 (三菱經濟(Mitsubishi Casei)公司，東京(Tokyo))， Amerlite® XAD 7 (羅門(Rohm)及哈斯(Haas)，美國 (USA))，Amberchrom®CG (藤曾哈斯(TosoHaas)，費 城(Philadelphia)，美國(USA))等等之上進行層析術。分離 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 514664

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 係可於廣泛pH值之範圍下進行，較佳範圍係ρΗι至阳 13，而pH 2至pH 12之範圍尤其較佳。數種反相支持物， 例如於高效咖色層讀娜[pLC)賴帽膽遍所知 之，例如RP!8，亦適合。 另外純化根據本發魏生素之可雜，係使騎謂的正相 層析術支持物，例如，諸如矽膠戒Al2〇3或其、它本質上為 已知之方式。有許多的溶液及其混备物適合於此目的，例 如，諸如將驗性溶劑，譬如吡咬，加入氣仿/甲醇浥合物中。 可供選擇之分離方法，係使用分子篩，例如Fract〇gd@ TSK HW-40，^ρΜ(1βχ®Ιϋ-2〇，以及其它本質上為已知之方 式。此外，亦可藉由自當含物質之中，再結晶而分離出庚 烯。適合此目的係，例如有機溶劑及其混合物，無水或溱 加水。另外用於分離及純化根據本發明抗生素之方法，係 包含使用陰離子交換樹船，較佳係於自7至1〇之々Η範圍 下’以及陽離子交換樹脂，較佳係於自3至7之pH範圍 下。而尤其適合用於此目的者，係將有機溶劑按比例加入 之緩衝溶液。 抗生素3874 HI JLH6或其化學衍生物，可藉由習於該項 技藝人士所熟知之方法，轉化成相對應之醫藥上合適之鹽 類。 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） ------------------訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 514664 A7 B7 五、發明説明（8 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印袋 根據本發明化合物之明顯化學上之相等物，係具有些微許 化學差異之化合物，也就是具有相同活性，或於溫和條件 下，可經轉化而成根據本發明之你合物。該等柏等物係包 括，譬如酯_、胺基衍生物、複今物，或是具有或為根據 本發明化合物之加成物〇 根據本發明化合物之醫藥上合適之鹽類，意指如雷明頓醫 藥科學(Remington’s Pharmaceutical Science) ( 17 版，索 1418頁(1985))中所述之無機及有機二者之塗類。特別適 合之鹽類，係驗金屬、銨及給土金屬之鹽類，具有生理上 可耐受胺之鹽類，以及具有無機或有機酸，例如HC1、 HBr、H2SO4、順丁烯二鲮及反丁稀二酸之鹽類。 根據本發明抗生素之物理化學及光譜性質係經概述如下·· 3874 Η1 外表： 淺綠黃色物質，溶於甲醇、乙腈及氣仿中。於中性及弱驗 性介質中安定，但於酸性及強鹼性溶液中則不安定，並於 光、熱及氧氣下曝光。 分子式：C58H86N2OI8 分子量：1099.3 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 装· 514664 Α7 Β7 五、發明説明（9 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 b-NMR :參見表1 UV最大值(logs): 232nm(4.49)，286xim(4.32)，338rnn (4.64) ，357 nm (4·86)，377 nm (5.00)，39? nm (4.98) 3874 H2 外表： 淺綠黃色物f，滄於甲醇、6腈及氣仿中。於令性及弱鹼 性介質中安定，担於酸性及強鹼性溶液中則不安定，並於 光、熱及氧氣下曝光。 分子式：C59H&8N2O18 分子量：1113.3 UV最大值(l〇gS): 232 nm (4.49)，286 nm(4J2)，338 nm (4.64) ^ 357 mn (4.86) ^ 377 nm (5.00) ^ 398 nm (4.98) 3874 H3 外表： 淺綠黃色物質，溶於甲醇及其他低碳醇類、乙腈及氣仿中。 於中性及弱鹼性介質中安定，但於酸性及強鹼性溶液中則 不安定，並於光、熱及氧氣下曝光。 分子式·· C57H87NO13 11 本紙張尺度適用中國國定接也f 、A >44日/ Λ < Λ八枝 丁 J' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ 514664 Α7 Β7 五、發明説明（10 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 分子量：1074.3 :參見表1 UV 最大值(logs) : 233nm(4.39)，241 ηιή(4.39)，249nm (4.28)，275 nm(4.41)，341 pm (4·54)，358 nm (4.32)， 378 nm (5.00) » 399 nm (4.94) 3874 H4 外表： 淺綠黃色物質，溶於肀醇、乙賸及氣仿中。於中性及弱驗 性介質中寄定，但於酸性及強鹼性溶液中則不安定，並於 光、熱及氧氣下曝患。 分手式：0：58%4尺2〇18 分子量：1097.3 UV最大值(logs): 232nm(4.49)，286nm(4.32)，338nm (4·64) ★ 357 nm (4.86)，377 nm (5.00) ’ 398 nm (4·98) 3874 H5 外表： 淺綠黃色物質，溶於甲醇、乙腈及氣仿中。於中性及弱驗 性介質中安定，但於酸性及強鹼性溶液中則不安定，並於 光、熱及氧氣下曝光。 12 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 笨· 41Τ 514664 A7 B7 五、發明説明（H ) 分子式：C59H86N2〇i8 分子量：1111.3 UV最大偉(logs): 232nm(4.49)，286賺(4.32)，338nm (4.64)，357 nm (4.86)，377 nm (5.00)，398 nm(4.98) 3374 H6 外表（ 淺綠黃色物質，溶於申醇及其他低碳醉類、乙腈及氣仿中。 於中性及弱鹼性介質中安定，但;^酸性及強鹼性溶液中則 不安定，並於光、熱及氧氣下曝光。 分子式：C57H85NO13 分子量：1072.3 iH-NMR :參見表1 UV最大值(logs): 233nm(4.39)，241 nm(4.39)，249nm (4.2S)，275 nm (4·41)，341 inn (4·54)，358 urn (4·82)， 378 nin (5·00)，390 nm (4·94)。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^ϋ- ·>··1··— —H·— I·—— eMMmmmmme mu «ϋϋ I ...I 11> In— m —11 ϋϋ '一CN (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 良好溶解度意指根據本發明之抗生素，係有利地不同於兩 性黴素Β，其於該溶劑及其它者中，僅具有非常低之溶解 度，因此，在使用上會產生很大的問題。 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 514664 A7 B7五、發明説明（12) 表1 : 3874H3以及3874H1於1H-NMR光譜中之化學位移，係於氘基甲醇中17 °C時記錄。 碳原子位置3S74H3 3874 H1 碳原子位置3874 H3 3874 H1

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 9 10 11 12 13 14 15 16 17 '- 18 18-CO 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 - - 29 6.61 6.61 2.49/2.14 2.45/2.15 30 6.51 6.51 4.28 4J28 31 6.06 6.06 1.66/1.41 1.66/1.41 32 6.82 6.82 3.36 3.37 33 6.22 6.20 1.30 1.30 34 6.19 6.20 1.84/1.12 1.85/1.11 35 5.38 5.38 1.31 1.30 36 2.48 2.48 3.69 3.70 36-Me 1.02 1.02 1.44 1.43 37 4.76 4.77 4.04 4.05 38 • 1.85 1.86 1.52/1.25 1.51/1.38 38-Me 0.98 0.98 4.43 4.42 39 1.36 1.40 1.72/1.56 1.72/1.55 40 1.58/1.46 1.62/1.51 - - 41 3.97 4.06 2.00/1.24 1.99/1.24 42 2.68 2.98/2.92 4.25 Λ25 43 - - 1.99 1.99 44 6.10 - - - 45 7.23 7.75 4.38 4.39 46 6.26 6.62 2.24/1.68 224/1.67 47 6.28 - 4.37 4.38 43 1.87 - 6.10 6.10 1， 4.53 4.54 6.17 6.17 2· 3.85 3.88 6.50 6.49 3， 2.71 2.80 6.35 6.35 4, 3.12 3.17 6.50 6.49 5， 3.21 3.23 6.79 6-79 5,物 1.24 1.25 6.28 6^8 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -來· 本紙張尺度:逢舟中冊國"家標準（。阳）八辦見格-{_210>^9?^麓} 514664 A7 B7 五、發明説明（13 ) 此外，經發現，根據本發明之化合物具有極強之殺真菌作 用，並且該活性涵蓋廣泛之真菌屬及酵母菌◊表2概述作 為實施例中3874 H1及3874 H)之最小抑制濃度。 表2 : 活體外針對皮膚病癣菌、酵母菌及黴菌之活性 (於RPMI1640培養基中之微量稀釋檢測） 最小抑制濃度，MIC (微克/毫升） 菌株 3874 H1 3874 H3 皮膚病癬菌 鬚髮癬菌(T. mentagrophytes) 100/25 4 8 紅色髮癬菌(T. rubrum) 101/58 16 16 絮狀表皮癬菌(Ε· floccosum) 19〇/143 16 16 酵母菌 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i.

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 白色假絲酵母(C. albicans) ATCC 90028 2 4 白色假絲酵母(C. albicans) ATCC 90029 2 4 球狀假絲酵母(C. glabrata) ATCC 90030 4 4 球狀假絲酵母(C. glabrata)柏^(Berlin) 12 2 4 克魯斯假絲酵母(C. krusei) 203/230 4 4 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇 X 29 7公釐） 514664 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 克魯斯假絲酵母(c. krusei)柏林(Berlin) 1 2 熱帶假絲酵母(C. Tropicalis) 2〇1/2〇1 2 熱帶假絲酵母(C. Tropicalis) 201/202 2 偽熱帶假絲、酵母(C. psevdotropicalis) 202/21S 2 近平滑假絲酵每(C. parappilosis) ATCC 90Q18 4 新型假絲酵母(C· iieoformans) ATCC 9Q112 2 2 4 4 4 4 4 黴菌 黑麴菌(A. niger) AT0C 16404 S^i(A. fumigatus) ATCC 9197 黃麴菌(A. flavus) ATCC 9643 2 4 8 8 4 16 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 培養··於35°C下48h (酵母菌）或於30°C下6日（皮庸 病廯菌及黴菌） 將根據本發明抗生素之優勢特別經顯示於所謂的擴散試 驗，其中，將化合物擴散於含測試檄生物之瓊脂層中。然 後以抑制帶之直徑作為抗生素活性之度量（表3)。 表3 : 由抗生素3874 H1及H3引起濃度依賴之抑制帶 (毫米）與兩性黴素B比較 濃度（毫克/毫升），3874H1 3874H3兩性黴素b - 16 514664 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（15 ) 0.2 ，26 22 14 0.1 ，25 20 12 0:05 ，24 18 10 0.025 ’ 21 14 8 0,0125 ，19 13 0 0.0063 ，17 12 0 在一些個例子中，根據本發明合物，其作用係超過該 等商業產品南性被素8相當多，因此代表著其係非常有價 值之試劑。而此作角係總定衍生自此新穎庚烯結合至麥角 固醇而成庚烯/麥角固醇複合物的能力。麥角国醇係真菌槳 膜中之基本組成物π而此複合物的形成，改變了膜中的麥 角固醇，以致於漿膜無構受損並使真菌細胞死亡。 相較於麥角固醇，於溫血種類夂細胞膜組焱物則是膽固 醇。揭示於參考文獻中之許多庚烯可結合膽固醉以及麥角 固醇，因此為毒性化合物。特別是抗生素3874 Η3及3874 Η6 ’其對麥角固醇較之膽固醇能吏有力地結合，所以此等 化合物係特別地適合於控制人類及動物中真菌之感染。 除抗真菌之作用外，根據本發明之抗生素對於原生動物， 例如’諸如毛滴蟲屬(Tricli0monas)具有優越的抑制作用。 然而’由於與膽固醇或固醇結备之能力，當不需要過多高 _— 17 ----------:樣------、玎------1 .V、 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用) A4規格（训父撕公董一) ________£7 514664 A7 五、發明説明（16 ) 濃度之膽固醇時’化合物3874 Hi至H6可經使用於醫率 中。而其一般或特定地減少膽固醇程度之實例係於治療良 性前列腺肥大。 μ 因此，本發明亦相關於根據本發明化合物其作為醫藥品之 用途，以及用於製造有關用於治療及/或預防真菌感染及類 囱醇濃度增加之相關疾病治療之化舍物其甩途& 本發明進一步相關於具有至少含有一種根據^^發明之化合 物之畲樂品。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 根據本發明之醫樂品’可經勝道（經口）、非經腸道（經 靜脈内）、經直腸或按部位（局部）而使用。其可以溶液 劑、散劑、錠劑、膠囊劑（包括微膠囊劑）、軟膏劑（軋 脂劑或膠漿劑）、脂質體產物、脂y複合物、膠體懸浮劑 或栓劑形式而投藥。適合用於此等形式配劑之辅助物質係 通常之液饈或固體醫藥膨脹劑及擴取劑、溶劑、乳化劑、 潤滑劑、掩蔽用調味劑、染劑及/或緩衝物質。得當之投藥 劑量係艟重之0.1-10，較佳為0.2-8亳克/公斤。該彼等係 按劑量單位，其包含最少根據本發明化合物之有效每曰含 量，例如30-3000，較佳為50-1000毫克，而合適地投藥。 本發明係藉由底下實施例，以及申請專利範圍之内容以作 詳細說明。 ____ 18 本紙張尺度（CNS ) A4^ ( 210X297公釐) B7 五、發明説明（17) 實施例1 · 製備生產菌株(producer strain)孢子之懸浮 液 將存於500毫升厄林梅雅(Erienmeyer)錐形瓶之營養溶液 1〇〇毫升（20克麥芽萃取物，2束酵母菌萃取物，1〇克 麴萄糖，存於1升♦來水之〇·5克(NH4)2HP〇4，滅菌前 ΡΗ6·0 )接種該菌株，並於25。(：及14〇φιη下之旋轉式搖 動器中培養72小時。隨後，將120毫升培養液體均勻地散 布在含有營養培養基燕麥浸出液2.0克/升之500毫升消毒 乓林梅雅錐形瓶中（已加入用於固化之15克瓊脂/升）輕 倒出。將此培養物於25 °C卞培養10至14日。待經該時段 後，以含有一滴商業用之非離子性界面活性劑（例如，色 瓦(Sefva)所提供之曲通(Triton®) X 100 )之500毫升未離 子水，清洗於形瓶中所形成之孢子，並立即作進一步使 用，或儲藏於_22。<： 50 %之丙三醇或-140 °C 10 %之二甲亞 颯中。 實施例2 : 厄林梅雅錐形瓶令生產菌株之培養物或前 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 培養物之製備 將含有實施例1中所述100毫升營養溶液之一只滅菌過之 500毫升厄林梅雅錐形瓶，以生長於斜面試管之培養物或 以0.2毫升之孢子懸浮液接種，並於140 rpm下之搖動器 及25 °C之黑暗中培養。待經大約72小時後，根據本發明 19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） 514664 A7 B7

之化舍物可達最大產量。來自於相同營養溶液而經浸沒U 小時之培養物，係足以接種於1〇及100升之發酵中拉 種物大約5%)。 接 實施例3 : 抗生素3874 H1-H6之生產 在底下條伴下操作10升發酵罐： 營養培養基： 葡萄糖 15克/升 大豆粉 15克/升 玉米漿 5烏/升 CaC03 2克/升 NaCl 5克/升 pH 7,0 (消毒前） 培養時間： 24或48小時 培養溫度： 25 °C 攪拌速率： 2Q0rpm，排除光綵 充氣= 5井空氣/分鐘 0 1 — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1T· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 藉由反覆地將少數滴之乙醇性多醇溶液加入，以抑制泡泳 的形成。待經48小時後，可到達最大生產量。 實施例4 : 抗生素3874 H1-H6之分離

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 3140()4

:^於施例3中所獲得之9升培養溶液進行離心，並藉 由母次以2·2升甲醇槐拌兩次而萃取出該生物量（〜u 升）二於真空下’將輕組合之萃取物濃縮並乾燥，且以二 乙晴化該錢㈣。絲祕絲過及細質之殘餘物 (41克），溶解於25〇/〇異丙醇/75%水之中，並載入具有 3升容積且鱗MCI Gd® CHmp吸附樹脂之管柱中管 柱尺寸：寬X高：旧公分x3G公會。使用以自存於水 ，25 %異轉至異丙醇之義梯度作為溶析，並將 音柱^出物收集在2 i個流份(丘acti〇n)中。 收集以HPLC分析檢驗所包含庚烯之流份，並於真空中濃 縮且凍乾（3.2克）。 ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-N1T 實施例5 ·庚烯对74 H1至H6之高壓液相色層分析術 (HPLC) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 管柱：Nuclebsil® 100-5 CigAB，250/4 流動相：存於l〇mM磷酸鉀緩衝液pH7.0乏37·56/。乙腈 流速：每分鐘1毫升 藉由於320 nm之UV吸收作摘測。 經發現，各個成分之滯留時間如下。並顯示藉由Hplc/質 譜測定法所決定之相對應分子量(M+H)+。於HPLC-MS 中，使用10 mM醋酸铵取代磷酸鹽緩衝液。 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 514664 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明说明（ 20 ) 滯留時間 化合物 (M+H)+ 7.05 分鐘 3874 H1 1099.6 8.64 分鐘 3874 H2 1097.7 13.93 分鐘 3874 H3 1113.7 17.90 分鐘 3874 H4 Π11.8 ) 19.23 分鐘 3874 H5 1074.5 24.28 分鐘 3874 H6 1072.5 實施例6 : 3874H成分之富集化 將如於實施例4中所得之2克產物，載入具有3升容積並 充填Fractogel®TSKMW-40s (寬 X 高=1〇 公分 χ5〇 公分）之管柱中。將甲醇流動相以每分鐘50亳升之流速泵 通於該管柱，並將營柱流出物收集在流份（65毫升）中。 流份28至35主要係包含抗生素站74 Η3 (待經乾燥後： 210毫克），流份3Μ3 : Η6 ( 9毫克），流份50-60 : 3874 Η1至Η2 ( 280毫克）以及，最後，流份71至78 ·· 化合物3874 Η4及Η5 ( 17考克）。 實施例7 ·· 3874 HI、Η2及Η3之最終純化 將如實施例6中所獲得經富集之抗生素3874 Η1友Η2 (280毫克）以及3874Η3 ( 210毫克），各個於Nucleosil® 22 尽氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I-------0^1,----r.——^訂----- C.''C (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 5.14664 Α7 Β7 五、發明說明（ 21

I 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製 12C18ABHPLC管柱（寬X高=10公分χ50公分）中， 藉由梯度方法，以存於水中之25 %至50 %乙腈進行流份 處理。將流份以HPLC (參見實施例5 )檢查，並經適當 地組合，於真空下濃縮且凍乾。產得 29毫克3874 H1 95 %純度， 11毫克3874 H2 94 %純度， 65毫克3874 H3 97 %純度。 實施例8: 以磷酸鹽/異丙醇為系統之製備級HPLC之 最終純化 如於實施例7中之程序，但使用10_磷酸鉀緩衝液， pH7，以及異丙醇作為流動相。將經如於實施例7中所分 離而得冬成分進行脫鹽。 38毫克3874 H1 97 %純度， 21毫克3874 H2 96 %純度， 83毫克3874 H3 98 %純度。 圖式簡單說明 一 圖1顯示於曱醇中記錄之3874 H1的紫外線吸收光譜。 圖2顯示於曱醇中記錄之3874H3的紫外線吸收光譜。 23 --------------------訂---------線 j (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4扨故，

Ttr \ ·· ί I

Claims (1)

1. 514664 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 vr:i， :铜大 專利申請案第86111982號 ROC Patent Appin. No. 86111982 修正之申請專利範圍中文本-附件一 Amended Claims in Chinese - Encl.I一 一 Γ民—國—军'9—月—> —日—送1) 一—— (Submitted on September > , 1999) 1, 一種具有下列分子式之化合物3874 1*11、犯、《：3、 Η4、Η5 或 Η6， 3874 HI，分子式：C58H86N2〇I8，分子量 1099.3

   3874 H2，分子式： C59H88N2〇18，分子量 1113.3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ------1--訂.---------線I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

   本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ：>丄4(>64

   3874Η3，分子式·· C57H87N〇18，分子量 1〇74 3 3874 H4 ’ 分子式·· C58H84N2〇18，分子量 1〇97 3 3874H5 ’ 分子式：C59ii86N2〇18，分子量 1113 3 3874 H6，分子式：C57H85N01S，分子量 1072.3 其生理上可耐受之鹽類，。， 2·根據申請專利範圍第1項之化合物，其可籍由將微生 物DSM Π007或其任一變異種或突變種，於適宜條 件下發酵，將一或多種化合物Η1至Η6分離出，益若 適當，將彼等化合物轉化成鹽類或化學相等物而製傷 得。 • 25.- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I I I I I -I I I I · I 1 I I I 4- 1 訂"--------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Jl 4004

   、根據申請專利範圍第以2項之化合物，其係用做為治 療真菌性疾病，由毛滴蟲弓|起之疾病或與類固醇濃度增 加相關之疾病的醫藥品。 八曰 種用於療真菌性疾病、由毛滴蟲引起之疾病或 與類固醇漢度增加相關之疾病的醫藥組合物，其包 含至少-種根據申請專利範圍第i或2項之化合 物。 口 5. -種製造根據申請專利範㈣4項㈣藥組合物之 方法，其包含將至少一種根據申請專利範圍第1或2 項之化口物以適且之補助物質及/或賦形劑轉化 成為適合之劑量形式。 -. ------W--------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）