BE886578A - Derives de noyaux peptidiques cycliques, leur preparation et leur utilisation comme agents antifongiques - Google Patents

Description

  Cette invention concerne de nouveaux composés antifongiques semi-synthétiques que l'on prépare par acylation

  
de noyaux peptidiques cycliques obtenus par désacylation

  
enzymatique de l'antibiotique peptidique cyclique

  
correspondant.

  
L'antibiotique peptidique cyclique est un composé

  
 <EMI ID=1.1> 

  

 <EMI ID=2.1> 


  
 <EMI ID=3.1> 

  
Dans toute cette demande, les formules des peptides cycliques,

  
comme la formule I, supposent que les amino-acides représentés

  
sont en configuration L.

  
Les facteurs A, B, D et Il de A-30912 sont des

  
 <EMI ID=4.1> 

  
 <EMI ID=5.1>  

  
L'antibiotique S 31794/F-1 est un peptide cyclique

  
 <EMI ID=6.1> 

  
 <EMI ID=7.1> 

  
Chaque facteur est isolé du complexe A30912 qui contient les autres facteurs arbitrairement appelés facteurs B, C, D, E, F et G. Le complexe A-30912 et les facteurs A à

  
 <EMI ID=8.1> 

  
l'antibiotique A-30912 est identique à l'antibiotique A-22802 qui est décrit dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 4.024.246. Il a. également été trouvé que le facteur A est identique à l'échinocandine B antibiotique [voir F. Benz et al., Helv.

  
 <EMI ID=9.1> 

  
à l'antibiotique SL 7810/F [voir C. Keller-Juslen et al. Tetrahedron Letters, 4147 (1976) et brevet belge N[deg.] 834.289].

  
Le facteur A de l'antibiotique A-30912 est préparé par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ; (b) Aspergillus nidulans NRRL 8112 ; <EMI ID=10.1> 
3860 ; (d) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 ; ou (e) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

  
On a également trouvé que le facteur B est identique à l'échinocandine C antibiotique [voir R. Traber et al., Helv. Chim. Acta, 62, 1252 (1979)] et à l'antibiotique SL 7810/F-II [voir le brevet belge N[deg.] 834.289].

  
On prépare le facteur B de l'antibiotique A-30912 par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus

  
 <EMI ID=11.1> 
(d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 1440.

  
On a également trouvé que le facteur D est identique à l'échinocandine D antibiotique [voir R. Traber et al.,

  
 <EMI ID=12.1> 

  
7810/F-III Ivoir le brevet belge N[deg.] 834.2891.

  
On prépare le facteur D de l'antibiotique A-30912 par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergilius

  
 <EMI ID=13.1> 

  
NRRL 8039 (voir le brevet belge N[deg.] 834.289) ; ou (d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

  
Le facteur H est un facteur de l'antibiotique A-30912 découvert plus tard, et il est décrit dans la demande de

  
 <EMI ID=14.1> 

  
ici par voie de référence.

  
 <EMI ID=15.1> 

  
fermentation en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ; ou (b) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

  
Une sous-culture de A. nidulans var. roseus a été déposée et fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Regional Research Laboratory,

  
U.S. Departmcnt of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, où elle est disponible au public

  
 <EMI ID=16.1> 

  
Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour produire l'un quelconque des facteurs A-30912, on obtient un ensemble complexe de facteurs qui

  
pour des raisons de commodité est appelé complexe antibiotique A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du complexe antibiotique A-42355, tandis que les facteurs B, D et H sont des facteurs mineurs. Les préparations 2 à 7 suivantes illustrent la préparation du complexe A-42355 et l'isolement et la purification des différents facteurs de A-30912.

  
 <EMI ID=17.1> 

  
chaîne latérale linoléoyle (R) est fixée au noyau peptidique cyclique sur le groupement a-amino du reste ornithine. On a trouvé de façon surprenante que la chaîne latérale linoléoyle peut être coupée du noyau par une enzyme sans modifier l'intégrité chimique du noyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction de désacylation est produite par un micro-organisme de la famille Actinoplanaceae, de préférence le micro-organisme

  
 <EMI ID=18.1>  

  
 <EMI ID=19.1> 

  
 <EMI ID=20.1> 

  
cyclique ainsi obtenu est séparé du bouillon de fermentation par des procédés connus dans le domaine. Au contraire des facteurs A, B, D et H de l'antibiotique A-30912, le noyau cyclique (ne possédant pas la chaîne latérale linoléoyle)

  
est essentiellement exempt d'activité antifongique.

  
L'antibiotique S31794/F-1, qui est décrit dans la demande de brevet allemand publiée après examen N[deg.] 2.628.965 et dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 4.173.629, est produit par

  
 <EMI ID=21.1> 

  
NRRL 8095. S31794/F-1 a les caractéristiques suivantes :
p.f. 178-180[deg.]C (avec décomposition) (amorphe) ou 181-183[deg.]C
(avec décomposition) (cristallisé) ; La]20 _ 24[deg.] (c 0,5,

  
 <EMI ID=22.1> 

  
étalon interne) ayant les caractéristiques suivantes (à l'état cristallisé) :

  

 <EMI ID=23.1> 
 

  
 <EMI ID=24.1> 

  
le diméthylsulfoxyde et faiblement soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthylique, le .benzène et l'hexane ; et a une activité antifongique, en particulier contre Candida albicans.

  
On prépare l'antibiotique S31794/F-1 par culture aérobie en immersion de Acrophialophora limonispora NRRL
8095 comme décrit dans les préparations 8 et 9. Ce microorganisme fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Culture Collection, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, où elle est disponible au public sous le numéro d'accès NRRL indiqué.

  
L'antibiotique S31794/F-1 a une activité antifongique, en particulier contre les souches Candida comme Candida albicans. Ainsi, la production et l'isolement de l'antibiotique peuvent être contrôlés par bioautographe en utilisant une espèce Candida comme Candida albicans.

  
Dans la molécule de l'antibiotique S31794/F-1

  
 <EMI ID=25.1> 

  
de façon surprenante que la chaîne latérale myristoyle peut être coupée du noyau par une enzyme sans nuire à l'intégrité chimique du noyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction de désacylation est produite par un micro-organisme de la famille Actinoplanaceae, de préférence le microorganisme Actinoplanes utahensis NRRL 12052 ou un de ses variants. Pour effectuer la désacylation, on ajoute l'antibiotique S31794/F-1 à une culture du micro-organisme ot on laisse la culture incuber avec le substrat jusqu'à ce

  
 <EMI ID=26.1>   <EMI ID=27.1> 

  
d'activité antifongique.

  
Les noyaux peptidiques cycliques fournis par les réactions de désacylations enzymatiques susmentionnées des antibiotiques de formule 1 sont représentés par la formule générale II.

  

 <EMI ID=28.1> 


  
 <EMI ID=29.1> 

  
des groupements hydroxy et R est H est le noyau du facteur A de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelé ici "noyau de A-30912A". Le noyau de A-30912A a une formule

  
 <EMI ID=30.1> 

  
 <EMI ID=31.1> 

  
H et R3 et R 4 sont tous deux OH est le noyau du facteur B de A-309L2 et, pour des raisons de commodité, sera appelé

  
 <EMI ID=32.1>  

  
] 

  
 <EMI ID=33.1> 

  
tous des atomes d'hydrogène est le noyau du facteur D de A-30912 et sera appelé ici pour des raisons de commodité "noyau de A -30912D". Le noyau de A-30912D a une formule

  
 <EMI ID=34.1> 

  
Le composé de formule II dans laquelle R , R et

  
 <EMI ID=35.1> 

  
 <EMI ID=36.1> 

  
un poids moléculaire de 840,87.

  
L'enlèvement de la chaine latérale fournit un groupement u-amino primaire libre dans le reste ornithine du peptide cyclique. Comme le verra l'homme de l'art, les noyaux peuvent être obtenus sous la forme de l'amine libre ou sous la forme d' un sel d'addition d'acide . Bien que l'on puisse utiliser un quelconque sel d'addition d'acide approprié, on préfère ceux qui sont non toxiques et acceptables sur le plan pharmaceutique.

  
Le procédé de préparation de chaque noyau à partir de l'antibiotique approprié à l'aide d'une fermentation utilisant Actinoplanes utahensis NRRL 12052 est décrit dans la demande de brevet déposée le môme jour que la présente demande de brevet sous le N[deg.]

  
Des cultures d'espèces représentatives d'Actinopnanaceae sont mises à la disposition du public au Northern Regional Research Laboratory sous les numéros d'accès suivants :

  

 <EMI ID=37.1> 
 

  
L'efficacité d'une quelconque souche donnée de micro-organismes appartenant à la famille des Actinoplanaceae pour la mise en oeuvre de la désacylation de cette invention est déterminée par le mode opératoire suivant. On inocule avec le micro-organisme un milieu de culture approprié. On

  
 <EMI ID=38.1> 

  
jours sur un agitateur rotatif. Puis on ajoute à la culture l'un des antibiotiques utilisés comme substrat. On maintient le pH du milieu de fermentation à environ 6,5. On contrôle

  
la culture pour son activité en utilisant une analyse par Candida albicans. La perte de l'activité antibiotique est une indication que le micro-organisme a produit l'enzyme nécessaire pour la désacylation. Ceci doit cependant être vérifié en utilisant l'un des procédés suivants : 1) analyse par chromatographie liquide sous pression élevée pour déterminer la présence du noyau intact ; ou 2) réacylation avec une chaîne latérale appropriée (par exemple linoléoyle, stéaroyle, palmitoyle ou myristoyle) pour rétablir l'activité.

  
On sait que d'autres substances antibiotiques possèdent le même noyau que celui de facteur A de l'antibiotique A-30912. Ces antibiotiques diffèrent du facteur A de l'antibiotique A-30912 en ce que des groupements acyle différents sont présents à la place du groupement linoléoyle
(R) de la formule I. De tels antibiotiques sont : (a) le

  
 <EMI ID=39.1> 

  
2459 (1974), composé qui est décrit par la formule 1 quand R est un groupement stéaroyle ; et (b) l'aculaécine A, qui est un composant du complexe d'aculaécine (préparée par fermentation en utilisant Aspergillus aculcatus NRRL 8075)

  
et est décrit dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 3.978.210. Comme décrit dans le brevet belge N[deg.] 859.067, dans l'aculaécine A, la chaîne latérale palmitoyle est présente à la place du groupement linoléoyle. Le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur A de A-30912 par

  
 <EMI ID=40.1> 

  
 <EMI ID=41.1>   <EMI ID=42.1> 

  
utilisés comme substrats pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.

  
 <EMI ID=43.1> 

  
antibiotique possède le même noyau que le facteur B de l'antibiotique A-30912. Cette substance, qui diffère du facteur B de l'antibiotique A-30912 en ce qu'un groupement aayle différent est présent à la place du groupement linoléoyle R de la formule I, est le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-II ; tétrahydro

  
 <EMI ID=44.1> 

  
groupement stéaroyle. Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné

  
 <EMI ID=45.1> 

  
hydrogénation catalytique en utilisant Pt02 dans l'éthanol sous pression positive. Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné peut être utilisé comme substrat à la place du facteur B de l'antibiotique A-30912 pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.

  
On sait en outre qu'une autre substance antibiotique

  
 <EMI ID=46.1> 

  
substance, qui diffère du facteur D de l'antibiotique A-30912 en ce qu'un groupement acyle différent est présent à la place du groupement linoléoyle (R) de la formule I, est

  
 <EMI ID=47.1> 

  
de A-30912 tétrahydrogéné est décrit par la formule I quand R est un groupement stéaroyle. Le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur D de l'antibiotique A-30912 par hydrogénation catalytique en

  
 <EMI ID=48.1> 

  
facteur D de A-30912 tétrahydrogéné peut être utilisé comme substrat à la place du facteur D de A-30912 antibiotique pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.

  
Dans le facteur Il de l'antibiotique A-30912, le groupement 5-hydroxy présent dans le reste dihydroxy-

  
 <EMI ID=49.1> 

  
le facteur A de l'antibiotique A-30912, le groupement 5hydroxy n'est pas substitué. On verra donc que l'on peut

  
 <EMI ID=50.1> 

  
facteur A selon des procédés classiques pour préparer un éther aliphatique à partir d'un alcool. On verra également que le facteur A peut être alkylé avec d'autres groupements alkyle inférieur pour former des homologues à groupements alkyloxy de la molécule du facteur H. Les homologues à groupements alkyloxy du facteur H que l'on peut préparer par synthèse à partir du facteur A, sont connus sous le nom d'homologues du type facteur H de A-30912. Les composés de

  
 <EMI ID=51.1> 

  
un groupement alkyloxy en C2-C6 sont ici appelés comme les

  
 <EMI ID=52.1> 

  
On verra également que la chaîne latérale linoléoyle du facteur Il de A-30912 ou des homologues de type facteur H de A-30912 peut être hydrogénée selon des techniques classiques pour former le facteur H de A-30912 tétrahydrogéné ou le dérivé tétrahydrogéné correspondant des homologues à

  
 <EMI ID=53.1> 

  
d'abord le facteur A de l'antibiotique A-30912 pour obtenir le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné puis en formant le dérivé alkyloxy désiré.

  
 <EMI ID=54.1> 

  
A-30912, le facteur H de A-30912 tétrahydrogéné, un

  
 <EMI ID=55.1> 

  
groupement alkyloxy en C2-C6 peuvent être utilisés comme substrat pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici. 

  
L'invention qui fait l'objet de la présente demande de brevet comprend de nouveaux composés obtenus par acylation d'un noyau de formule II. Les composés de la

  
 <EMI ID=56.1> 

  
la formule générale III

  

 <EMI ID=57.1> 


  
dans laquelle :

  
 <EMI ID=58.1> 

  
 <EMI ID=59.1> 

  
pas être un groupement n-tridécyle, n-tétradécyle, n-penta-

  
 <EMI ID=60.1> 

  
 <EMI ID=61.1> 

  
heptadécyle et, quand R est un groupement alcényle, R

  
 <EMI ID=62.1>  

  
 <EMI ID=63.1> 

  
pourvu que, quand R est un groupement alkyle, R ne puisse <EMI ID=64.1> 

  
quand R <1> et R sont tous deux OH, R <2> est H et R  est ur. groupement alkyloxy.en C -Cg (composé de type A-30912H), R est un groupement alkyle en C6 -C24 ou alcényle

  
 <EMI ID=65.1> 

  
que, quand R est un groupement alkyle et R un groupement méthoxy, R ne puisse pas être un groupement n-heptadécyle ;

  
 <EMI ID=66.1> 

  
(S31794/F-1), R 5 est un groupement alkyle en C6-C24 ou alcényle en C6-C24, pourvu que, quand R est un groupement

  
 <EMI ID=67.1> 

  
Par l'expression "alkyle", on désigne un radical hydrocarboné à chaîne droite ou ramifiée, saturé et monovalent. Par l'expression "alcényle", on désigne un radical hydrocarboné à chaîne droite ou ramifiée,insaturé et monovalent, ne contenant pas plus de trois doubles liaisons. Les doubles liaisons de la chaîne hydrocarbonée insaturée

  
 <EMI ID=68.1> 

  
on désigne un hydrocarbure (à chaîne droite ou ramifiée) contenant de 6 à 24 atomes de carbone.

  
Dans des aspects secondaires, en tenant compte des restrictions précédentes, l'invention envisage les composés préférés suivants de formule III :  <EMI ID=69.1>  <EMI ID=70.1> 

  
entier de 5 à 23.

  
 <EMI ID=71.1>  alkyle de formule CH3(CH2)n-' où n est un entier de 10 à 20.
(c) Les composés où R est un groupement alkyle  <EMI ID=72.1> 

  
chacun indépendamment un entier de 0 à 21 pourvu que la somme n + m ne soit pas

  
 <EMI ID=73.1>  <EMI ID=74.1>  alcényle contenant une double liaison cis ou trans.
(e) Les composés dans lesquels R est un groupement alcényle cis ou trans de formule

  
 <EMI ID=75.1> 

  
dans laquelle n et m sont indépendamment un entier de 0 à 21, pourvu que la somme n + m ne soit pas inférieure à 3 et pas supérieure à 21.

  
(f) Les composés dans lesquels R est un groupement alcényle contenant deux doubles liaisons cis ou trans.

  
(g) Les composés où R5 est un groupement alcényle

  
cis ou trans de formule

  
 <EMI ID=76.1> 

  
dans laquelle n et p sont indépendamment un entier de 0 à 18 et m est un entier de 1 à 19, pourvu que la somme m + n + p ne soit pas inférieure à 1 et pas supérieure à 19 et que RS ne puisse pas être un groupement linoléoyle.
(h) Les composés dans lesquels R est :

  
 <EMI ID=77.1>   <EMI ID=78.1> 

  
t-butoxy, n-pentyloxy, n-hexyloxy, etc.

  
En particulier, l'invention fournit un composé peptidique cyclique de formule :

  

 <EMI ID=79.1> 


  
dans laquelle R est H ou OH et

  
 <EMI ID=80.1> 

  
ou tous deux OH,

  
et

  
 <EMI ID=81.1> 

  
groupement alkyloxy en C -Cg et R 4 est OH, ou R <2>

  
 <EMI ID=82.1> 

  
et

  
 <EMI ID=83.1> 

  
ne puisse pas être un groupement n-tridécyle,,  <EMI ID=84.1> 

  
123 

  
deux OH, ou quand R , R , R et R sont tous H, ou

  
 <EMI ID=85.1> 

  
 <EMI ID=86.1> 

  
alkyle, R ne puisse pas être un groupement n-

  
 <EMI ID=87.1> 

  
 <EMI ID=88.1> 

  
 <EMI ID=89.1> 
-CO-NH2 et R un groupement alkyle, R ne puisse pas être un groupement n-tridécyle.

  
Les composés de formule III inhibent la croissance de champignons pathogènes comme le . mettent en évidence des modes opératoires d'essais biologiques classiques. Les composés sont donc utiles pour lutter contre la croissance des champignons sur des surfaces environnementales (en tant qu'antiseptique) ou dans le traitement d'infections causées par des champignons. L'activité antifongique des composés a été démontrée vis-à-vis de Candida albicans in vitro dans des essais de diffusion de disque sur plaque de gélose et des essais de dilution sur gélose, ou dans des essais in vivo sur des souris infectées par C. albicans. Les composés sont ainsi particulièrement utilisables pour le traitement d'infections provoquées par des souches de C. albicans
(candidose).

   Les composés de formule III présentent également une activité in vitro dans les essais de diffusion sur disque sur plaque de gélose vis-à-vis de Tricophyton mentagrophytes, un organisme dermatophyte. On a également trouvé une activité dans les essais de diffusion sur disque sur plaque de gélose in vitro vis-à-vis de Saccharomyces pastorianus et Neurospora crassa. Certains composés (comme indiqué dans l'Exemple 27, Tableau V) donnent des taux dans le sang significatifs après administration par voie orale chez les souris.

  
Quand on administre à un chien par voie intraveineuse 100 mg/kg par jour pendant cinq jours du composé de

  
 <EMI ID=90.1> 

  
H et R5 est un groupement n-dodécyle (c'est-à-dire le dérivé n-tridécanoyle du noyau de A-30912A) , le chien ne présente aucun signe extérieur de toxicité, bien que l'on observe des ni .aaux accrus de transaminase glutamo-pyruvique sérique et une certaine hémolyse.

  
On prépare les composés de formule III en acylant le noyau approprié sur le groupement a-amino de l'ornithine par la chaine latérale alcanoyle ou alcénoyle appropriée en utilisant des procédés connus dans le domaine pour former une liaison amide. L'acylation est effectuée en général en faisant réagir le noyau avec un dérivé activé de l'acide alcanoique

  
 <EMI ID=91.1> 

  
acyle désirée (R 5 CO-). Par l'expression "dérivé activé", on désigne un dérivé qui rend la fonction carboxy de l'agent d'acylation réactive à la copulation avec le groupement aminé

  
primaire pour former la liaison amide qui lie la chaîne latérale acyle au noyau. Les dérivés activés appropriés, leurs procédés de préparation et leurs procédés d'utilisation comme agents d'acylation d'une amine primaire sont connus de l'homme de l'art. Les dérivés activés préférés sont : (a) un halogénure d'acide (par exemple un chlorure d'acide) ; (b) un anhydride d'acide (par exemple un anhydride d'acide alcoxyformique ou un anhydride d'acide aryloxyformique) ou (c) un ester activé (un ester 2,4,5-trichlorophénylique). D'autres

  
 <EMI ID=92.1> 

  
réaction de l'acide carboxylique avec un carbonyl-diimide

  
(par exemple le N,N-dicyclohexylcarbodiimide ou le N,N'diisopropylcarbodiimide) pour former un intermédiaire réactif qui en raison de son instabilité n'est pas isolé, la réaction avec l'amine primaire étant effectuée in situ.

  
Un procédé préféré de préparation des composés de formule III est le procédé par l'ester actif. L'utilisation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide alcanoique ou alcénolque désiré, en tant qu'agent d'acylation, est nettement préférée. Dans ce procédé, on fait réagir un excès

  
 <EMI ID=93.1> 

  
dans un solvant organique non réactif comme le diméthylformamide (DMF). La durée de la réaction n'est pas déterminante, bien que l'on préfère un temps d'environ 6 à environ

  
20 heures. A la fin de la réaction, on chasse le solvant et

  
on purifie le résidu comme par chromatographie liquide sous pression élevée (CLPE) en phase inversée en utilisant LP-l/C.g comme phase fixe et un mélange d'eau, de méthanol et d'acétonitrile comme système solvant.

  
Un procédé d'acylation préféré est un mode opératoire Schotten-Baumann modifié dans lequel on traite le noyau par le chlorure d'acide de l'acide alcanolque ou alcénolque désiré

  
à un pH alcalin. Dans ce procédé, on ajoute lentement un

  
excès du chlorure d'acide dans un solvant organique non

  
réactif (comme l'acétone) à une solution du noyau dans un

  
 <EMI ID=94.1> 

  
produit de réaction brut du milieu réactionnel par extraction dans un solvant organique non miscible (chloroforme et

  
acétate d'éthyle). La purification finale se fait par CLPE

  
à phase inversée, comme décrit précédemment.

  
Un procédé de préparation des dérivés de type A-30912H de formule III est le suivant : (a) désacylation du facteur A de l'antibiotique A-30912 par voie enzymatique en utilisant Actinoplanes utahensis NRRL 12052 comme décrit dans la demande de brevet N[deg.] déposée le même jour que la présente demande de brevet dont la description est incorporée ici par voie de référence, (b) acylation du noyau de A-30912A ainsi produit avec le groupement acyle constituant la chaîne latérale appropriée en utilisant le procédé décrit ci-avant pour l'acylation du noyau de A-30912H, et (c) alkylation du dérivé acyle approprié du noyau de A-30912A pour former le dérivé alkyloxy désiré. L'alkylation (Etape C) peut être effectuée en utilisant des procédés qui sont classiques pour la préparation d'un éther aliphatique à partir d'un alcool.

   Par exemple, le dérivé acylé approprié du noyau de A-30912A peut être méthylé par traitement d'une solution du dérivé dans un solvant organique  <EMI ID=95.1> 

  
en présence d'un acide (par exemple 3 % de HC1 dans du méthanol). Le produit peut être isolé par des procédés classiques et purifié par CLPE à phase inversée.

  
 <EMI ID=96.1> 

  
comme substances de départ pour la réaction d'acylation ainsi que leurs dérivés activés (en particulier les chlorures d'acide et les esters 2,4,5-trichlorophényliques) sont des composés connus ou peuvent être préparés à partir de composés connus par des procédés connus. Les esters 2,4,5trichlorophényliques sont commodément préparés en traitant le

  
 <EMI ID=97.1> 

  
trichlorophénol en présence de pyridine ou en traitant l'acide alcanolque ou alcénolque libre par le 2,4,5-trichlorophénol

  
 <EMI ID=98.1> 

  
agent de copulation. Le dérivé ester 2,4,5-trichlorophénylique peut être purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice dans le toluène.

  
Quand on les utilise de façon systémique, la dose des composés de formule III variera selon le composé particulier que l'on utilise, la sévérité et la nature de l'infection et l'état physique du sujet que l'on traite. La thérapie doit être commencée à de faibles doses, la dose étant accrue jusqu'à ce que l'on obtienne l'effet antifongique désiré. Les composés peuvent être administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire par injection sous forme d'une solution ou suspension aqueuse stérile à laquelle on peut ajouter, si on le désire, divers agents classiques pharmaceutiquement acceptables comme des agents de conservation, des tampons, des agents de solubilisation ou de mise en suspension. D'autres additifs, comme une solution saline ou le glucose, peuvent être ajoutés pour rendre les solutions isotoniques.

   Les proportions et la nature de ces additifs seront évidentes pour l'homme de l'art.

  
Certains composés de formule III donnent des taux dans le sang significatifs après administration par voie orale (voir l'Exemple 27) et peuvent être administrés de façon systémique par voie orale. Pour l'utilisation par voie orale, de tels composés peuvent être administrés en combinaison avec des supports ou excipients pharmaceutiquement

  
 <EMI ID=99.1> 

  
La nature et la proportion de ces supports ou excipients seront connues de l'homme de l'art.

  
Quand on les utilise pour traiter des infections vaginales dues à Candida, les composés de formule III peuvent être administrés en combinaison avec des excipients classiques acceptables sur le plan pharmaceutique

  
convenant pour l'utilisation intravaginale. Des compositions conçues pour l'administration intravaginale sont connues de l'homme de l'art. 

  
 <EMI ID=100.1> 

  
présente in vent ion sont illustrées dans les exemples suivais :

  
Préparation 1

  
Fermentation d'Actinoplanes utahensis NRRL 12052

  
On prépare une culture mère d'Actinoplanes

  
utahensis NRRL 12052 et on l'entretient sur une culture inclinée de gélose. Le milieu utilisé pour préparer la culture inclinée est choisi parmi l'un des suivants :

  
Milieu A

  

 <EMI ID=101.1> 


  
le pH avant passage à l'autoclave est environ 5,9 ; on ajuste le pli à 7,2 par addition de NaOH ; après passage à l'autoclave, le pH est d'environ 6,7.

  
 <EMI ID=102.1> 

  

 <EMI ID=103.1> 


  
Milieu B
 <EMI ID=104.1> 
 
 <EMI ID=105.1> 
 <EMI ID=106.1> 

  
Jersey, U.S.A.

  
On inocule la culture inclinée avec Actinoplanes utahensis NRRL 12052, et on fait incuber la culture inoculée à.30[deg.]C pendant environ 8 à 10 jours. On utilise à peu près la moitié de la culture pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante :

  

 <EMI ID=107.1> 


  
ajuster à pH 7,4 avec NaOH ; après passage à l'autoclave. le pH est d'environ 6,8.

  
 <EMI ID=108.1> 

  
New York, U.S.A.

  
On fait incuber le milieu végétatif inoculé dans

  
 <EMI ID=109.1> 

  
pendant environ 72 heures sur un agitateur tournant sur un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.

  
On peut utiliser ce milieu végétatif incubé directement pour inoculer un milieu végétatif de second stade.

  
 <EMI ID=110.1> 

  
ultérieur en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour une telle conservation dans de ^ombreuses petites ampoules comme suit :
dans chaque ampoule, on place 2 ml de milieu végétatif incubé et 2 ml d'une solution de glycérol et de lactose [voir W.A.

  
 <EMI ID=111.1>  .organisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10,
364-367 (1973) pour les détails]. Les suspensions ainsi préparées sont conservées dans la phase vapeur de l'azote liquide.

  
On utilise une suspension conservée (1 ml) ainsi préparée: pour: inoculer 50 ml d'un milieu végétatif de premier

  
 <EMI ID=112.1> 

  
incuber comme décrit précédemment le milieu végétatif de premier stade inoculé.

  
Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on

  
 <EMI ID=113.1> 

  
pour inoculer 400 ml d'un milieu végétatif de second stade ayant la même composition que le milieu végétatif de premier stade. On fait incuber le milieu de second stade dans un

  
 <EMI ID=114.1> 

  
environ 48 heures sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.

  
On utilise le milieu végétatif de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, pour inoculer
100 1 d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un

  
des suivants :

  
Milieu 1

  

 <EMI ID=115.1> 


  
Le pH du milieu est environ 6,9 après stérilisation

  
 <EMI ID=116.1> 

  
pression d'environ 1,1 à 1,24 bar. 

  
Milieu II
 <EMI ID=117.1> 
 Eau désionisée q.s.p. 1 litre

  
 <EMI ID=118.1> 

  
 <EMI ID=119.1> 

  
Milieu III

  

 <EMI ID=120.1> 


  
 <EMI ID=121.1> 

  
Le pH final est d'environ 6,6.

  
On laisse le milieu de production inoculé fermenter <1> dans une cuve de fermentation de 165 1 à une température d'environ 30[deg.]C pendant environ 42 heures. On agite le milieu de fermentation avec des agitateurs classiques à environ 200 tours par minute et on l'aère avec de l'air stérile pour maintenir le taux d'oxygène dissous supérieur à 30 % à la saturation par l'air à la pression atmosphérique.

  
Préparation 2

  
Préparation du mélange antibiotique A-42355 

  
A. Fermentation en flacon agité

  
On prépare une culture d'Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 et on la maintient sur une gélose inclinée de 18 x 150 ml, préparée avec un milieu ayant la composition suivante :

  

 <EMI ID=122.1> 
 

  

 <EMI ID=123.1> 


  
(pH initial 6,1)

  
 <EMI ID=124.1> 

  
La culture inclinée est inoculée avec Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 puis on fait incuber la culture à 25[deg.]C pendant environ sept jours. On recouvre d'eau la culture inclinée mûre et on la gratte avec une anse

  
stérile pour libérer les spores. La suspension résultante est ensuite mise en suspension dans 10 ml d'eau désionisée stérile.

  
On utilise 1 ml de la culture inclinée en suspension pour inoculer 55 ml de milieu végétatif dans un flacon de

  
250 ml. Le milieu végétatif a la composition suivante :

  

 <EMI ID=125.1> 


  
 <EMI ID=126.1> 

  
On fait incuber le milieu végétatif inoculé à 25[deg.]C pendant 48 heures, à 250 tours par minute, sur un agitateur

  
de type rotatif. Après 24 heures, on homogénéise le milieu pendant une minute à faible vitesse dans un mélangeur

  
(de type Waring), puis on le fait incuber à nouveau pendant les 24 heures restantes. Ou bien, on peut faire incuber le milieu végétatif inoculé pendant 48 heures puis l'homogénéiser pendant 15 secondes à faible vitesse.

  
Ce milieu végétatif incubé peut être utilisé pour inoculer un milieu de culture de fermentation en flacon agité ou pour inoculer un milieu végétatif de second stade. On peut également le conserver pour une utilisation ultérieure, en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote

  
liquide. On prépare la culture pour cette conservation dans de nombreuses petites ampoules, comme suit :

  
On mélange les cultures végétatives volume/volume avec une solution de suspension ayant la composition suivante:

  

 <EMI ID=127.1> 


  
On répartit les suspensions préparées dans de petits tubes stériles à bouchon vissé (4 ml par tube). On conserve ces tubes dans la phase vapeur de l'azote liquide.

  
On peut utiliser une suspension conservée ainsi préparée pour inoculer des cultures inclinées ou des milieux d'ensemencement liquides. On fait incuber les cultures inclinées à 25[deg.]C à la lumière pendant 7 jours.

  
B. Fermentation en réservoir

  
Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml de la culture végétative de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végétatif de second stade ayant la même composition que celui du milieu végétatif. Le milieu de second stade est incubé dans un flacon Erlenmeyer à large ouverture de deux litres, à
25[deg.]C pendant 24 heures, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.

  
Le milieu de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, est utilisé pour inoculer 100 litres d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants :

  
Milieu IV
 <EMI ID=128.1> 
 
 <EMI ID=129.1> 
(pH initial 6,8-7,0)

  
 <EMI ID=130.1> 

  
 <EMI ID=131.1> 

  
Milieu V

  

 <EMI ID=132.1> 


  
On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 165 1 à une température de 25[deg.]C pendant 7 jours. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile, en maintenant le niveau d'oxygène dissous supérieur à environ 50 % de la saturation en air.

  
C. Milieu végétatif de troisième stade 

  
Si l'on effectue la fermentation dans des réservoirs plus grands que ceux utilisés pour la fermentation par

  
100 litres, il est recommandé d'utiliser une culture végétative de troisième stade pour ensemencer le réservoir plus grand. Un milieu végétatif de troisième stade préféré

  
a la composition suivante :

  

 <EMI ID=133.1> 
 

  

 <EMI ID=134.1> 


  
Préparation 3.

  
Séparation du mélange antibiotique A-42355

  
On agite soigneusement le bouillon de fermentation entier (4127 litres), obtenu par le procédé décrit dans l'Exemple 1 en utilisant le milieu de production II, avec
4280 litres de méthanol pendant une heure, puis on filtre, en utilisant un adjuvant de filtration (Hyflo Supercel, une terre de diatomées, Johns-Manville Products Corp.). On ajuste le pH du filtrat à 4,0 par addition d'HCl 5 N. On extrait le filtrat acidifié deux fois avec des volumes égaux de chloroforme. On réunit les extraits chloroformiques et on les concentre sous vide jusqu'à un volume de 20 litres. On ajoute ce concentre 3 200 litres d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355. On sépare le précipité par filtration et l'on obtient 2775 g du mélange A-42355 sous forme d'une poudre blanc gris.

  
Séparation et identification des facteurs de A-30912

  
Préparation 4

  
Séparation du facteur A de A-30912

  
On dissout 1 g du mélange antibiotique A-423S5, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 7 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit dans une colonne en verre de 3,7 cm de diamètre intérieur et de 35 cm de longueur [Colonne de Chromatographie CLFPCE :: (chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevées) MichelMiller, Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ 08360] garnie de

  
 <EMI ID=135.1> 

  
microns), qui a été préparée comme décrit dans la Préparation  <EMI ID=136.1> 

  
à vannes. La colonne est garnie dans le système 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, à l'aide du mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11.

  
Une pompe F.M.I. avec une conception de piston sans vannes
(débit maximal 19,5 ml/minute) est utilisée pour déplacer le solvant dans la colonne à un débit de 9 ml/minute à 7 bars, des fractions étant recueillies toutes les minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6).

  
Préparation 5

  
Séparation du facteur B de A-30912

  
On sépare le mélange A-42355 comme décrit dans la Préparation 3, mais on chromatographie les extraits chloroformiques concentrés (285 1) sur une colonne de gel de silice (150 1 de gel de silice Grace, qualité 62) à un débit de 2 1/minute. On lave la colonne avec 200 litres de chloroforme, on l'élue avec 500 litres d'acétonitrile, puis

  
on l'élue continuellement avec un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau à un débit de 1 1/minute. On recueille des fractions ayant un volume de 200 litres et on les analysa séparément pour déterminer leur activité biologique. L'analyse. biologique est effectuée par une analyse sur disque de papier sur plaque de gélose, ensemencée par Candida albicans. On réunit les fractions 77 à 103 (1365 litres) et on les concentre sous vide. La solution concentrée (4,5 litres) contient un précipité qu'on enlève par filtration et l'on obtient 119 g de mélange A-42355 enrichi en facteur B. On concentre le filtrat à siccité. On redissout le résidu obtenu dans un volume approprié de méthanol. On ajoute la solution méthanolique à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le complexe antibiotique contenant le facteur B.

   On sépare également ce précipité par filtration et on le  sèche, et l'on obtient 24 g supplémentaires de mélange

  
A-42355 enrichi de facteur B sous forme d'une poudre grise.

  
Le mélange A-42355 enrichi en facteur B ainsi obtenu  <EMI ID=137.1> 

  
méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (Colonne Michel-Miller de 3,7 cm de diamètre intérieur x 33 cm) par ; l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie d'une résine à phase inversée de gel de silice LP-1/C18 (10-20 microns) préparée comme décrit dans la Préparation 10, à l'aide du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, comme décrit dans la Préparation 11. ! Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 10 ml/ . minute à environ 7 bars, en utilisant une pompe FMI à piston sans vannes. On recueille une fraction toutes les minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme dans la Préparation 15. On réunit les fractions 102-110 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile.

   On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on la lyophilise, ce qui donne 22 mg du facteur B de A-30912.

  
Préparation 6

  
Isolement du facteur D de A-30912

  
On réunit et on chromatographie sur une colonne de gel de silice (Grace, qualité 62) les extraits chloroformiques concentrés de deux essais de fermentation (3800 1 et 4007 1) obtenus nar le procédé décrit dans la Préparation 3. On lave la colonne avec du chloroforme puis on élue avec de l'acéto-

  
 <EMI ID=138.1> 

  
recueille des fractions ayant un volume d'environ 200 1 et on les soumet à une analyse biologique sur disque de papier sur gélose ensemencée avec Candida albicans. On réunit les fractions

  
 <EMI ID=139.1> 

  
solution concentrée (0,7 1) à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355 enrichi en facteur D. On enlève ce précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 32 g de mélange A-42355 enrichi en facteur D sous forme d'une poudre grise.

  
On dissout le mélange A-42355 enrichi en facteur D ainsi obtenu (1,0 g) dans 5 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (colonne Michel- <EMI ID=140.1> 

  
 <EMI ID=141.1> 

  
La colonne a été garnie de résine à phase inversée de gel de

  
 <EMI ID=142.1> 

  
Préparation 10. Le garnissage a été effectué dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, selon le mode opératoire de garnissage de la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 3,1 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston

  
 <EMI ID=143.1> 

  
L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm comme décrit dans la Préparation 4. On réunit les fractions 96-108 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout cette huile dans un petit volume de t-butanol et on

  
 <EMI ID=144.1> 

  
Préparation 7

  
Séparation du facteur H de A-30912

  
On dissout 5,0 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 35 ml du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, on filtre la solution résultante et on l'introduit sur une colonne de verre de 3,7 cm de diamètre intérieur x 42 cm
(colonne Michel-Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système de vannes. La colonne est garnie de

  
 <EMI ID=145.1> 

  
microns) (Préparation 10) dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme décrit dans la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 13 ml/ minute à environ 8.3 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes, et l'on recueille une fraction toutes les deux minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans la Préparation 19, paragraphe C. On réunit les fractions 112-132 avec les fractions 106-117 d'une seconde purification similaire. Les fractions réunies sont concentrées sous vide jusqu'à une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol

  
 <EMI ID=146.1> 

  
A-30912. 

  
 <EMI ID=147.1> 

  
dans 8 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et

  
 <EMI ID=148.1> 

  
réintroduit sur une colonne de verre de 2,0 cm de diamètre intérieur x 32 cm, comme décrit ci-dessus. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 5,5 bars, et on recueille une fraction toutes les 3 minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm. On réunit les fractions 17 et 18 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 29 mg du facteur 11 de A-30912. Identification des facteurs de A-30912

  
Les différents facteurs de A-30912 peuvent être identifié? par chromatographie sur couche mince (CCM) . Les Rf

  
 <EMI ID=149.1> 

  
silice (Merck, Darmstadt),un système solvant 7:3 3 de benzène et de méthanol et un bioautographe par Candida albicans sont indiqués dans le Tableau VII.

TABLEAU VII

  

 <EMI ID=150.1> 


  
 <EMI ID=151.1> 

  
A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant une CCM sur gel de silice (plaques de gel de silice n[deg.] 60 de Merck Darmstadt, 20 x 20 cm) et un bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau VIII. 

  
 <EMI ID=152.1> 

  

 <EMI ID=153.1> 


  
Systèmes solvants

  
a acétate d'éthyle:méthanol (3:2)

  
b : acétate d'éthyle:méthanol (7:3)

  
c acétonitrile:eau (95:5)

  
 <EMI ID=154.1> 

  
 <EMI ID=155.1> 

  
conditions suivantes :

  

 <EMI ID=156.1> 
 

  
Injection injection sur boucle

  
Les durées de rétention approximatives pour les facteurs A,

  
 <EMI ID=157.1> 

  
le Tableau IX.

TABLEAU IX

  

 <EMI ID=158.1> 

Préparation 8

  
Préparation de l'antibiotique S31794/F-1

  
 <EMI ID=159.1> 

  
en immersion d'Acrophialophora limonispora NRRL 8095, en agitant, remuant et/ou aérant à pH 3-8, de préférence 5-7,

  
 <EMI ID=160.1> 

  
heures, de préférence pendant 120 à 288 heures.

  
On isole l'antibiotique S31794/F-1 par traitement du bouillon de culture (90 L) avec un mélange 4:1 (90 L) d'acétate d'éthyle et d'isopropanol et en homogénéisant

  
 <EMI ID=161.1> 

  
phase organique et on l'évapore sous vide à environ 40[deg.]C. On chromatographie le résidu ainsi obtenu sur environ dix fois sa quantité de gel de silice, en utilisant des mélanges de chloroforme et de méthanol (95:5 à 60:40). On réunit les fractions qui ont une activité antifongique et on les chromatographie sur 100 fois leur quantité de "Sephadex LH-20" avec du méthanol. Les fractions provenant de la colonne de Sephadex et qui ont une activité antifongique sont réunies et rechromatographiées sur 100 fois leur quantité de gel de silice (0,05-0,2 mm) avec un système solvant
71:25:4 de chloroforme, de méthanol et d'eau. Les fractions éluées qui ont une activité antifongique sont réunies et évaporées sous vide pour obtenir l'antibiotique brut

  
 <EMI ID=162.1> 

  
de méthanol et on le précipite avec de l'éther diéthylique pour obtenir S3J794/F-1 sous forme d'une poudre amorphe

  
 <EMI ID=163.1>  vide pousse 3 25-30[deg.]C. La cristallisation dans dix fois son volume de mélange 80:12:8 d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'eau donne S31794/F-1 cristallisé, p.f. 181-183[deg.]C avec décomposition après séchage sous vide poussé à 20[deg.]C.

  
Préparation 9

  
Séparation de l'antibiotique S31794/F-1

  
 <EMI ID=164.1> 

  
comme décrit dans la Préparation 8 après chromatographie sur Sephadex, sur une colonne de gel de silice (colonne Michel-

  
 <EMI ID=165.1> 

  
à vannes. On utilise le mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11. On déplace le solvant dans la colonne en utilisant une pompe FMI avec une conception de piston sans vannes. On contrôle l'élution de l'antibiotique en utilisant un appareil de contrôle UV à

  
280 nm comme dans la Préparation 22. On réunit les fractions ayant une activité antifongique et on les concentre sous vide pour obtenir l'antibiotique S31794/F-1.

  
S31794/F-1 a les Rf suivants par chrornatographie sur couche mince de gel de silice (Merck, 0,25 mm) :

  

 <EMI ID=166.1> 


  
S31794/F-1 peut également être détecté par de la vapeur d'iode.

  
Préparation 10

  
Préparation de la résine à hase inversée de gel de silice/

  
C18

  
Etape 1 : Hydrolyse

  
'On ajoute 1000 g de gel de silice LP-1 (Quantum Corp., maintenant Whatman) à un mélange de 1650 ml d'acide sulfurique concentré et de 1650 ml d'acide nitrique concentré dans un ballon à fond rond de 5 1 et on agite pour obtenir une suspension appropriée. On chauffe le mélange sur un bain de vapeur pendant une nuit (16 heures) avec un réfrigérant à refroidissement d'eau fixé sur le ballon.

  
On refroidit le mélange dans un bain de glace et on le filtre soigneusement en utilisant un entonnoir en verre fritte. On lave le gel de silice avec de l'eau désionisée

  
 <EMI ID=167.1> 

  
d'acétone et on le sèche sous vide à 100[deg.]C pendant deux jours.

  
Etape 2 : Première silylation

  
Le gel de silice sec de l'Etape 1 est transféré dans un ballon à fond rond et mis en suspension dans 3,5 1 de toluène. On chauffe le ballon au bain de vapeur pendant deux heures pour chasser toute l'eau résiduelle par distillation azéotrope. On ajoute 321 ml d'octadécyltrichlorosilane (Aldrich Chemical Company), et on chauffe le mélange réactionnel à reflux pendant une nuit (16 heures)

  
 <EMI ID=168.1> 

  
d'éviter que l'agitateur ne soit trop près de la partie inférieure du ballon, pour éviter un broyage des particules de gel de silice.

  
On laisse le mélange refroidir. On'recueille le gel de silice silanisé, on le lave avec 3 1 de toluène et 3 1 d'acétone, puis on le sèche à l'air pendant une nuit (16-20 heures). On met le gel de silice séché en suspension dans 3,5 1 d'un mélange 1:1 d'acétonitrile et d'eau dans un ballon de 5 1, on agite soigneusement à la température ambiante pendant deux heures, on filtre, on lave avec 3 1 d'acétone et on sèche à l'air pendant une nuit.

  
Etape 3 : Deuxième silylation

  
On répète le mode opératoire de la première silylation en utilisant 200 ml d'octadécyltrichlorosilane. On

  
 <EMI ID=169.1> 

  
tout en agitant soigneusement. On recueille le produit final par filtration, on lave avec 3 1 de toluène et 6 1 de

  
 <EMI ID=170.1> 

  
(16-20 heures).

  
Préparation 11

  
Mode opératoire de garnissage en suspension pour les colonnes Michel-Miller Renseignements généraux

  
On utilise ce mode opératoire pour garnir une

  
 <EMI ID=171.1> 

  
celle préparée par le procédé de la Préparation 10.

  
En général, une pression inférieure à 14 bars et des débits compris entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette technique de garnissage en suspension ; ceci dépend du volume et des dimensions de la colonne. La pression de garnissage doit être supérieure à la pression utilisée pendant la séparation réelle de 2 à 3,5 bars ; ceci assure qu'il ne se produit pas de tassement ultérieur de l'adsorbant pendant les séparations.

  
Une diminution soudaine de la pression peut provoquer des craquelures ou des canaux dans le matériau de garnissage, ce qui réduirait de façon importante l'efficacité de la colonne. Il est donc important de laisser la pression descendre lentement jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe.

  
Volume approximatif des colonnes (Colonnes en verre de Ace, Catégorie No., non garnies) : 5795-04, 12 ml ;
5795-10, 110 ml ; 5795-16, 300 ml ; 5795-24, 635 ml ; et 5796-
34, 34 ml.

  
Le temps nécessaire pour garnir une colonne en verre peut varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimension de la colonne et l'expérience de l'opérateur. Etapes : 

  
1. Relier la colonne de verre à une colonne réservoir par un accouplement (le volume de la colonne réservoir doit être

  
 <EMI ID=172.1> 

  
verticalement avec la colonne réservoir au-dessus.

  
2. Peser le matériau de garnissage (100 g pour 200 ml de colonne).

  
3. Ajouter environ 5 volumes de solvant au matériau de garnissage ; utiliser un mélange de 70-80 % de méthanol et de 20-
30 % d'eau.

  
4.. Bien agiter jusqu'à ce que toutes les particules soient mouillées, laisser reposer pendant une nuit ou plus longtemps pour assurer une imprégnation complète des particules par le solvant. Décanter la liqueur surnageante.

  
5. Délayer la résine avec suffisamment de solvant pour remplir la colonne réservoir. Verser rapidement dans le réservoir. La colonne doit être préremplie avec le même solvant et la colonne réservoir doit être partiellement remplie du solvant avant de verser la suspension.

  
L'utilisation de volumes de suspension plus grands peut également donner de bons résultats ; cependant, ceci nécessite
(a) un réservoir plus grand ou (b) plusieurs remplissages du réservoir pendant l'opération de garnissage.

  
6. Fermer le réservoir avec le bouchon de Teflon en-dessous de la colonne (voir la Figure 1 du brevet des E.U.A.

  
N[deg.] 4.131.547, bouchon N[deg.] 3) ; relier à la pompe ; et commencer immédiatement le pompage du solvant dans les dispositifs au débit maximum si l'on utilise une pompe Ace Cat. No. 13625-25, ou un système de distribution de solvant similaire (20.ml/minute).

  
7. Continuer jusqu'à ce que la colonne soit complètement remplie de l'adsorbant. La pression ne doit pas dépasser la tolérance maximale de la colonne pendant cette opération

  
(14 bars pour les colonnes importantes et 21 bars pour les colonnes analytiques). Dans la plupart des cas, des pressions inférieures à 14 bars seront suffisantes.

  
8. Si la pression dépassait les valeurs maximales, réduire le débit et la pression diminuera.

  
9. Après remplissage de la colonne par l'adsorbant, arrêter la pompe ; laisser la pression tomber à zéro ; débrancher le réservoir ; remplacer le réservoir par une pré-colonne ; <EMI ID=173.1>  d'adsorbant, et pomper à la pression maximale jusqu'à ce que la colonne soit complètement garnie. Pour une information supplémentaire, voir le mode opératoire général. Toujours laisser la pression descendre lentement après arrêt de la pompe ; ceci empêchera la formation de toutes craquelures ou canaux préférentiels dans le matériau de garnissage.

  
10. Supprimer la pression et débrancher soigneusement la pré-colonne. Avec une petite spatule, enlever quelques millimètres (2-4) de garnissage au sommet de la colonne ; placer 1 ou 2 filtres au sommet de la colonne ; appuyer doucement jusqu'au sommet du matériau de qarnissage, et placer un bouchon de Teflon au sommet de la colonne jusqu'à .confirmation de l'étanchéité. Relier la colonne à la pompe, introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par la paroi de verre au sommet de la colonne si la résine se tasse davantage. Si le matériau de garnissage doit continuer à se déposer (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions importantes), un certain espace mort apparaîtra ou bien, il se formera des canaux préférentiels et l'étape 9 doit être répétée.

  
Préparation 12

  
Préparation du noyau de A-30912A

  
A. Désacylation du facteur A de l'antibiotique A-30912

  
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de

  
 <EMI ID=174.1> 

  
incuber le milieu de production pendant environ 42 heures. On ajoute au milieu de fermentation une quantité de facteur A de A-30912 (340 g de substrat brut qui contient environ
19,7 g de facteur A de A-30912, dissous dans 1,5 1 d'éthanol) . On contrôle la désacylation du facteur A de A-
30912 par titrage vis-à-vis de Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à désacylation complète comme le montre la disparition de l'activité vis-à-vis de C.

  
albicans .

  
B. Séparation du noyau de A-30912A

  
On filtre le bouillon de fermentation entier (100 litres), obtenu comme décrit dans le paragraphe A et contenant

  
 <EMI ID=175.1> 

  
limpide ainsi obtenu (environ 93 1) sur une colonne contenant 4,5 1 de résine HP (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon) à un débit de 200 ml/minute. On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes (volume de

  
 <EMI ID=176.1> 

  
bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol (85 1) à un débit de 200-300 ml/minute.

  
On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant : or. prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une de ces parties jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. Ce produit et l'autre partie non traitée sont testés pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote

  
 <EMI ID=177.1> 

  
acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912A. On concentre l'éluat contenant le noyau de

  
 <EMI ID=178.1> 

  
pour obtenir environ 97 g du noyau brut.

  
C. Purification du noyau de A-30912A par chromatographie

  
liquide sur phase inversée

  
On dissout 25 g du noyau de A-30912A brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe C, dans 300 ml d'un mélange
96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne d'acier inoxydable de 4 1 (8 cm x 80 cm) remplie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing

  
 <EMI ID=179.1> 

  
d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal,91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumention Specialties Co., 4700 Superior Ave. Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6). On recueille par minute des fractions ayant un volume d'environ 500 ml.

  
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912A, on les évapore sous vide et on les lyophilise, ce qui donne 2,6 g du noyau. La quantité de solvant nécessaire pour achever ce mode opératoire de séparation chromatographique varie de 7 à 8 1.

  
 <EMI ID=180.1>   <EMI ID=181.1> 
(c) solide amorphe blanc, soluble dans l'eau, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le méthanol ; insoluble dans le chloroforme, le toluène et l'éther diëthylique.
(d) Spectre d'absorption infrarouge (pastille de

  
KBr)

  
présente des maximas d'absorption à :

  
3340 large (OU, liaison hydrogène) ; 2970, 2930 et 2890

  
 <EMI ID=182.1> 

  
(c) le titrage électrométrique dans le dimêthylformamide aqueux à 66 % indique la présence d'un groupement titrable avec un pK d'environ 7,35 (pH initial 7,32).
(f) durée de rétention en chromatographie liquide sous pression élevée (K') : 11,52 minutes dans les conditions suivantes :

  
Colonne : 4 x 300 mm

  
 <EMI ID=183.1> 

  
Solvant : mélange 1:2:97 d'acétate d'ammonium, d'acétonitrile et d'eau

  
Débit : 3 ml/minute

  
Pression : 172,5 bars 

  
Détecteur : UV à longueur d'onde variable,

  
à 230 nm

  
Sensibilité : 0-0,4 A.U.F.S.

  
Préparation 13 

  
On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de la Préparation 12, mais on utilise comme substrat A-30912A tétrahydrogéné.

  
Préparation 14

  
On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie

  
par le procédé de la Préparation 12 mais en utilisant comme substrat l'aculéacine A. 

  
Préparation 15

  
Préparation du noyau de A-30912B

  
A. Désacylation du facteur B de l'antibiotique A-30912

  
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après incubation de la culture pendant environ
48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur B de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.

  
On contrôle la désacylation du facteur B de A-
30912 par essai sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou de Neurospora crassa. On laisse la fermentatior. se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.

  
B. Séparation du noyau de A-30912B

  
On filtre le bouillon de fermentation ainsi obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution selon le mode opératoire suivant : on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite avec un chlorure d'acide comme le chlorure

  
de myristoyle. Ce produit et l'autre partie non traitée sont titrés pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912B. On concentre l'éluat contenant le

  
noyau de A-30912B sous.vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

  
C. Purification du noyau de A-30912B par chromatographie

  
liquide phase inversée

  
Un dissout le noyau de A-30912B brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe C, dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On

  
 <EMI ID=184.1> 

  
Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-
18 rue du Canal, Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ GO ml par minute, en utilisant le môme solvant.

  
On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil

  
 <EMI ID=185.1> 

  
Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6).

  
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912B, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912B purifié.

  
Préparation 16

  
On prépare le noyau de A-30912B et on le purifie par le procédé de la Préparation 15, mais on utilise comme

  
 <EMI ID=186.1> 

  
Préparation 17

  
Préparation du noyau de A-30912D

  
A. Désacylation du facteur D de A-30912

  
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur D de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.

  
On contrôle la désacylation du facteur D de A-30912 par essai sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou de Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.

  
 <EMI ID=187.1> 

  
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau  <EMI ID=188.1> 

  
sur une colonne contenant de la résine IIP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu.

  
Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau

  
 <EMI ID=189.1> 

  
résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant :
on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie non traitée pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912D. L'éluat contenant le noyau

  
de A-30912D est concentré sous vide jusqu'à un petit volume et

  
 <EMI ID=190.1> 

  
C. Purification du noyau de A-30912D par chromatographie

  
liquide en phase inversée

  
On dissout dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine le noyau de A-30912D brut obtenu comme décrit dans le paragraphe C. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B

  
 <EMI ID=191.1> 

  
fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon,
16-18 rue du Canal, 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars., ce qui donne un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6).

  
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on combine les fractions contenant le noyau de A-30912D, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912D purifie.

Préparation 18

  
On prépare le noyau de A-30912D et on le purifia par le procédé de la Préparation 17, Mais on utilise comme substrat A-30912D tétrahydrogéné.

Préparation 19

  
Préparation du noyau de A-30912H

  
A: Désacylation du facteur H de l'antibiotique A-30912

  
On effectue une fermentation de A. utahensis comme ) décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur Il de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.

  
On contrôle la dësaçylation du facteur H de A-30912 par une analyse sur disque de papier vis-à-vis de

  
 <EMI ID=192.1> 

  
B. Séparation du noyau de A-30912H

  
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau

  
 <EMI ID=193.1> 

  
résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant :
on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite avec un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On détermine l'activité de ce produit et de l'autre partie aliquote non traitée vis-à-vis de  Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité,  <EMI ID=194.1>  l'éluat contenant le noyau de A-30912H sous vide jusqu'à

  
 <EMI ID=195.1> 

  
brut.

  
C. Purification du noyau de A-30912H par chromatographie

  
liquide en phase inversée

  
On dissout le noyau de A-30912H brut, obtenu

  
comme décrit dans le paragraphe C, dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon,

  
16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner

  
la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant.

  
On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil

  
de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6).

  
Préparation 20

  
On prépare le noyau de A-30912H et on le purifie

  
par le procédé de la Préparation 19 mais on utilise comme substrat A-30912H tétrahydrogéné.

  
Préparation 21

  
Préparation du noyau S31794/F-1

  
A. Désacylation de l'antibiotique S31794/F-1

  
On effectue une fermentation de A. utahensis comme

  
 <EMI ID=196.1> 

  
production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation l'antibiotique S31794/F-1 dissous dans une petite quantité de méthanol.

  
On contrôle la désacylation de S31794/F-1 par analyse avec disque de papier vis-à-vis de Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complote comme le montre la disparition  <EMI ID=197.1> 

  
Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO

  
 <EMI ID=198.1> 

  
 <EMI ID=199.1> 

  
les fractions contenant le noyau de S31794/F-1, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de S31794/F-1 purifié.

  
Préparation 22

  
Préparation de A-30912A tétrahydrogéné

  
On dissout le facteur A de A-30912 dans l'éthanol.

  
 <EMI ID=200.1> 

  
utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur A de A-30912, par hydrogénation sous pression  positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le, concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912A tétrahydrogéné.

  
Préparation 23

  
 <EMI ID=201.1> 

  
On dissout dans l'éthanol le facteur B de A-30912.

  
 <EMI ID=202.1> 

  
platine que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur B de A-30912 par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée
(environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir

  
 <EMI ID=203.1> 

Préparation 24 

  
Préparation de A-30912D tétrahydrogéné

  
On dissout dans de l'éthanol le facteur D de

  
 <EMI ID=204.1> 

  
Pt que l'on utilise à son.tour pour réduire par voie catalytique le facteur D de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée

  
 <EMI ID=205.1>  de l'activité.

  
 <EMI ID=206.1> 

  
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien, on fait passer le filtrat limpide ainsi obcenu dans une colonne contenant de la résine HP-20 (polymère

  
très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. On lave ensuite la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau

  
 <EMI ID=207.1> 

  
colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol . On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant :
on prélève deux parties aliquotes à partir de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie aliquote non traitée pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de S31794/F-1. On

  
 <EMI ID=208.1> 

  
jusqu'à un petit volume, et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

  
C. Purification du noyau de S31794/F-1 par chromatographie

  
liquide en phase inversée

  
On dissout dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine le noyau de S31794/F-1 brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B.

  
On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B

  
 <EMI ID=209.1> 

  
fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon,
16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil

  
 <EMI ID=210.1>  

  
on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912D tétrahydrogéné.

Préparation 25

  
 <EMI ID=211.1> 

  
On dissout le facteur il de A-30912 dans de

  
 <EMI ID=212.1> 

  
Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur H de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée

  
 <EMI ID=213.1> 

  
et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912H tétrahydrogéné. 

EXEMPLES

  
On effectue la préparation de divers dérivés à groupements alcanoyle et alcénoyle par acylation du noyau approprié, soit par la réaction modifiée de Schotten-Bauman en utilisant un chlorure d'acide comme agent d'acylation
(Procédé A) soit par le procédé aax esters actifs utilisant l'ester 2,4,5-trichlorophénylique comme agent d'acylation
(Procédé B). Les modes opératoires généraux de mise en oeuvre des réactions d'acylation par le Procédé A ou le Procédé B sont indiqués ci-dessous :

  
Procédé A (Réaction modifiée de Schotten-Bauman).

  
Ce procédé comprend la réaction du noyau approprié avec le chlorure d'acide alcanolque ou alcénolque qui correspond à la chaîne latérale acyle désirée.

  
On dissout le noyau danr un mélange de tampon KHP04 0,1 M, pH 7,5 (5 à 10 ml) et d'acétone ou de méthanol
(5 à 10 ml). A la solution du noyau, refroidie par un bain de glace ou à la température ambiante, on ajoute lentement

  
 <EMI ID=214.1> 

  
 <EMI ID=215.1> 

  
Si on .le désire, on peut ajuster le pH du mélange réactionnel à 7,5-8,0 après chaque addition du chlorure d'acide ; cependant, cette étape n'est pas essentielle. On agite le mélange réactionnel à la température du bain de glace ou à la température ambiante pendant 1,5 à 3,0 heures. Pendant que la réaction se fait, il se forme un précipité qui est composé

  
 <EMI ID=216.1> 

  
la fin de la période de réaction, on centrifuge le mélange réactionnel pour enlever le précipité. Le précipité recueilli et la liqueur surnageante sont ensuite traités selon*l'un des modes opératoires de purification suivants.

  
. Mode opératoire (a) On lave le précipité une, deux ou trois fois avec 2 à 3 volumes de méthanol ou d'un mélange 1:1 de méthanol et d'eau. On centrifuge les produits de lavage au méthanol ou au méthanol-eau et on réunit les liqueurs surnageantes méthanoliques avec la liqueur surnageante obtenue après la centrifugation initiale du mélange réactionnel. Puis on concentre sous vide les liqueurs surnageantes réunies pour chasser le solvant organique. On combine ensuite le concentré aqueux avec un volume égal de méthanol et on extrait la solution résultante successivement avec du chloroforme et de l'acétate d'éthyle comme décrit ci-dessus dans le Procédé (a).

  
Mode opératoire (b) On rejette immédiatement le précipité et on extrait la liqueur surnageante

  
à pH 5,0-7,0 une ou deux fois avec de l'éther diéthylique (à volume égal) pour enlever l'acide alcanolque eu alcénolque n'ayant pas réagi. On rejette l'extrait d'éther diéthylique. On concentre la liqueur surnageante extraite sous vide pour chasser le solvant organique. Puis on combine le concentré aqueux avec un volume égal de méthanol et on extrait la solution résultante successivement avec du chloroforme et de l'acétate d'éthyle comme décrit précédemment dans le Procédé ta).

  
Après l'étape d'extraction par du chloroforme suivie par de l'acétate d'éthyle dans le mode opératoire (a) ou (b) précédent, toutes les phases d'extrait de solvant sont réunies et concentrées à siccité pour obtenir le dérivé à groupement alcanoyle ou alcénoyle brut du noyau de A-30912A.

  
On purifie le dérivé brut par CLPE à phase inversée comme suit : l'échantillon, dissous dans 5 à 6 ml de méthanol, est injecté dans une colonne en acier inoxydable

  
 <EMI ID=217.1> 

  
10) et on élue la colonne avec un système solvant comprenant de l'eau, du méthanol et de l'acétonitrile. On effectue

  
 <EMI ID=218.1> 

  
10 à 12 ml par heure en utilisant une pompe duplex LD-C
(Milton-Roy). On contrôle l'effluent avec un détecteur ISCOUA-5 à 280 nm. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les concentre à siccité sous vide pour obtenir le dérivé alcanoylé ou alcérioylé purifié du noyau correspondant. 

  
Le produit purifié est analyse par chromatographie sur couche mince (CCM) en utilisant des plaques C18 à phase inversée

  
 <EMI ID=219.1> 

  
développement, on observe les plaques sous lumière UV pour détecter le produit. Les produits sont également analysés par spectrométrie de masse à désorption de champ.

  
Procédé B (Procédé par l'ester actif)

  
 <EMI ID=220.1> 

  
heures une solution du noyau approprié et de l'alcanoate ou alcénoate de 2,4,5-trichlorophényle approprié dans le diméthylformamide (DMF) (10-20 ml). On concentre le mélange réactionnel sous vide à siccité pour obtenir le dérivé alcanoylé ou alcénoylé brut du noyau correspondant. On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme décrit ci-dessus dans le procédé A. Le produit purifié est également analysé par les procédés utilisés dans le Procédé A.

  
 <EMI ID=221.1> 

  
La préparation de divers dérivés alcanoylés et alcénoylés, obtenue par acylation du noyau de A-30912A, représentatif des composés de formule III, est donnée dans le Tableau 1 ci-dessous. Les dérivés du Tableau 1 sont préparés soit par la réaction modifiée de Schotten-Bauman utilisant un chlorure d'acide comme agent d'acylation
(Procédé A) soit par le procédé aux esters actifs utilisant l'ester 2,4,5-trichlorophénylique comme agent d'acylation
(Procédé B) décrits ci-dessus. 

  

 <EMI ID=222.1> 


  

 <EMI ID=223.1> 
 

  

 <EMI ID=224.1> 


  

 <EMI ID=225.1> 
 

  

 <EMI ID=226.1> 


  

 <EMI ID=227.1> 
 

  

 <EMI ID=228.1> 


  

 <EMI ID=229.1> 
 

EXEMPLE 17 

  
Dérivé n-tridécanoylé du noyau de A-30912A

  
Le mode opératoire suivant illustre la préparation à plus grande échelle des composés de formule III par le procédé aux esters actifs. Le composé particulier préparé par le mode opératoire donné ci-dessous est le composé de

  
 <EMI ID=230.1> 

  
A. Préparation du n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle.

  
On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 12,5 g d'acide n-tridécanoique
(Sigma Chemical Co.), de 11,5 g de 2,4,5-trichlorophénol et de 12,0 g de N,N-dicyclohexylcarbodiimide dans 650 ml de chlorure de méthylène. Puis on filtre le mélange réactionnel et on le sèche sous vide pour obtenir le n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle (22 g). On purifie le matériau par chromatographie sur colonne de gel de silice (Woelm) en utilisant du toluène comme éluant. On contrôle les fractions par CCM en utilisant une lumière UV à courte longueur d'onde pour la détection. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les concentre sous vide à siccité.

  
B. Acylation du noyau de A-30912A par le n-tridécanoate de

  
2,4,5-trichlorophényle

  
On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 6,0 g de n-tridécanoate de 2,4,5trichlorophényle et de 4,5 g du noyau de A-30912A dans 600 ml de diméthylformamide (DMF). L'élimination du solvant sous vide fournit un résidu (12 g). On délaie le résidu avec

  
500 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes puis on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec 500 ml de méthanol et on filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut (5,0 g).

  
On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme suit :

  
On injecte un échantillon du produit brut (1 g) dissous dans 5 ml de méthanol, dans une colonne en acier

  
 <EMI ID=231.1> 

  
La Préparation 10). On élue la colonne avec un système solvant comprenant un mélange 3:3:4 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une.pression de
69-103,5 bars avec un débit de 11-12 ml par minute en utilisant une pompe duplex LDC (Milton-Roy). On contrôle l'effluent avec un détecteur ultra-violet (ISCO-UA-5) à
280.nm. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les sèche sous vide. On obtient 550 mg de produit. On répète la chromatographie décrite précédemment quatre fois avec des échantillons de 1 g de produit brut pour obtenir d'autres échantillons purifiés comme suit :
620 mg, 520 mg, 670 mg et 490 mg. Poids total de produit du titre purifié : 2,8 g.

   Selon les modes opératoires précédents, on fait réagir 4,0 g du noyau de A-30912A avec le n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle pour obtenir 2,6 g du produit cité en titre purifié. On réunit les matériaux des deux préparations (5,4 g). Ion masse par spectrométrie de masse à désorption de champ : (M + Na+) :

  
 <EMI ID=232.1> 

  
(Ce Micro Bondapak, Waters Co.) avec comme système éluant un mélange 2:1:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile, ne présente qu'un pic.

  
EXEMPLE 18

  
Dérivé n-tridécanoylé du noyau de A-30912B

  
On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution du n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle (préparé comme dans l'Exemple 17, Etape A) (3,3 mmoles) et d'une mole du noyau de A-30912B (voir les Préparations 15 et 16) dans 200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide fournit un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat, on extrait les solides résultants avec 300 ml de méthanol et on filtre l'extrait méthanolique qu'on concentre sous vide pour obtenir un produit brut.

  
On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme suit.

  
On injecte un échantillon du produit brut (1 g), dissous dans 5 ml de méthanol, dans une colonne en acier inoxydable de 2,5 x 81 cm garnie de résine LP-l/C (voir la Préparation 11). On élue la colonne avec un système solvant comprenant un mélange 3:3:4 d'eau, de méthanol et

  
 <EMI ID=233.1> 

  
103,5 bars avec un débit de 11-12 ml/minute en utilisant une pompe duplex LDC (Milton-Roy). On contrôle l'effilent par un détecteur ultra-violet (ISCO-UA 5) à 280 nm. On

  
 <EMI ID=234.1> 

  
On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les sèche sous vide pour obtenir le produit cité en titre. On analyse le produit purifié par chromatographie sur couche mince en utilisant des plaques C18 à phase inversée

  
 <EMI ID=235.1> 

  
1:2:2 volume/volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Après développement, on observe les plaques sous la lumière UV pour détecter le produit,

  
EXEMPLE 19

  
En utilisant le procédé de l'Exemple 18 mais en

  
 <EMI ID=236.1> 

  
l'Etape A et l'ester 2,4,5-trichlorophénylique d'acide alcanolque ou alcénoique approprié dans l'Etape B, on obtient les dérivés du noyau de A-30912B indiqué ci-dessous :
Dérivés alcanoylés et alcénoylés du noyau de A-30912B 

  

 <EMI ID=237.1> 
 

  

 <EMI ID=238.1> 
 

  
 <EMI ID=239.1> 

  
 <EMI ID=240.1> 

  
On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de

  
 <EMI ID=241.1> 

  
Etape A) et de Immole .du noyau de A-30912D (voir Préparations 17 et 18) dans 200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec

  
 <EMI ID=242.1> 

  
filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides résultants avec 300 ml de méthanol et on filtre l'extrait méthanolique qu'on concentre sous vide pour obtenir un produit brut.

  
On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme décrit dans l'Exemple 18.

  
EXEMPLE 21

  
En utilisant le procédé de l'Exemple 20 mais en utilisant l'acide alcanoique ou l'acide alcénolque approprié

  
 <EMI ID=243.1> 

  
obtient les dérivés du noyau de A-30912D indiqué ci-dessous :
Dérivés alcanoylés et alcénoylés du noyau de A-30912D

  

 <EMI ID=244.1> 
 

  

 <EMI ID=245.1> 

EXEMPT 22

  
Dérivé n-tridécanoylé du noyau de A-30912H

  
On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle (préparé comme dans l'Exemple 17, Etape A) et de Immole du noyau de A-30912H (voir les

  
 <EMI ID=246.1> 

  
L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes puis on filtre le mélange. On rejette le filtrat.

  
On extrait les solides résultants avec 300 ml de méthanol et on filtre l'extrait méthanolique qu'on concentre sous vide pour obtenir un produit brut.

  
Le produit brut est purifié par CLPE en phase inversée comme décrit dans l'Exemple 18.

  
EXEMPLE 23

  
En utilisant le procédé de l'Exemple 22 mais en utilisant l'acide alcanolque ou alcénoique approprié dans l'Etape A et l'ester 2,4,5-trichlorophénylique d'acide alcanoique ou alcénolque approprié dans l'Etape B, on obtient les dérivés du noyau de A-30912H indiqué ci-dessous:
Dérivés alcanoylés et alcénoylés du noyau de A-30912H
 <EMI ID=247.1> 
 
 <EMI ID=248.1> 
 EXEMPLE 2 4

  
Le mode opératoire suivant illustre la préparation du dérivé N-n-tridécanoylé du noyau de A-30912H à partir du noyau de A-30912A.

  
On traite le noyau de A-30912A par le n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle selon le mode opératoire de l'Exemple 17. On méthyle le dérivé ainsi obtenu en traitant un échantillon (20 mg) par 0,06 ml de 3 % d'HCl dans du méthanol dans le diméthvlformamide. On laisse la solution reposer sous agitation pendant 16 heures, après quoi on chasse le solvant sous pression réduite et on obtient un résidu. On purifie le résidu par CLPE à phase inversée en

  
 <EMI ID=249.1> 

  
EXEMPLE 25

  
Dérivé n-tridécanoylé du noyau de S31794/F-1

  
On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5trichlorophényle (préparé comme dans l'Exemple 17, Etape A) et de 1 mmole de noyau de S31794/F-1 (voir la Préparation 21) dans 200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide laisse un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec

  
300 ml de méthanol et on filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut. Le

  
 <EMI ID=250.1> 

  
décrit dans l'Exemple 18.

  
EXEMPLE 26

  
En utilisant le procédé de l'Exemple 25 mais en substituant l'acide alcanoique ou alcénolque approprié dans l'Etape A et l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide

  
 <EMI ID=251.1> 

  
les dérivés du noyau de S31794/F-1 indiqué ci-dessous : 

  
 <EMI ID=252.1> 
 <EMI ID=253.1> 
 
 <EMI ID=254.1> 
 EXEMPLE 27

  
L'activité antifongique des composés de formule III peut être démontrée et étudiée in vitro dans des essais de diffusion sur disque et de dilution sur gélose classiques ou dans des essais classiques in vivo chez des souris qui. montrent l'efficacité vis-à-vis d'une infection fongique systémique. Les résultats des essais antifongiques pour des composés représentatifs de formule IV (Exemples 1 à 16) sont donnés dans les Tableaux II, III, IV et V. 

  
 <EMI ID=255.1> 

  
l'essai in vitro des composés des Exemples 1 à 16 par des méthodes de diffusion sur disque sur plaque de gélose. Dans le Tableau II, l'activité est mesurée par la dimension
(diamètre en mm) de la zone d'inhibition du micro-organisme observée produite par le composé d'essai. Dans le Tableau III, l'activité est mesurée par la concentration inhibitrice

  
 <EMI ID=256.1> 

  
inhiber la croissance de l'organisme d'essai. Le Tableau IV donne les résultats de l'essai in vitro du dérivé ntridécanoylé du noyau de A-3Q912A (formule III, R5 est

  
 <EMI ID=257.1> 

  
la méthode de dilution sur gélose. Dans le Tableau III, l'activité est mesurée par la concentration inhibitrice minimale (CIM) de la substance (pg/ml) nécessaire pour inhiber l'organisme d'essai. 

  
Les résultats d'essais in vivo destinés à évaluer l'efficacité du composé des Exemples 1 à 16 vis-à-vis

  
 <EMI ID=258.1> 

  
souris sont donnés dans le Tableau V, où l'activité est

  
 <EMI ID=259.1> 

  
pour guérir 50 % des animaux d'essai). Quand on n'obtient pas de DE 5,' l'activité est indiquée par la plus faible

  
dose à laquelle on observe un effet antifongique significatif. Dans cet essai, on infecte par voie intraveineuse par Candida albicans A-26 des groupes de souris albinos mâles (exemptes de pathogènes spécifiques) pesant de 18 à 20 g. On traite les animaux aux rayons X 24 heures avant l'infection à environ
50 roentgens par minute pendant 4 minutes (dose totale de
400) pour réduire les réactions immunologiques à l'organisme d'infection. A 0, 4 et 24 heures après l'infection, on

  
donne à chaque groupe de souris des doses progressives par voie sous-cutanée du composé d'essai sous forme d'une

  
 <EMI ID=260.1> 

  
l'eau. On note le jour de la mort pour chaque animal. Une comparaison statistique par l'essai "t" de Student du jour moyen de la mort est effectuée entre chaque groupe d'animaux infectés-traités à une dose particulière et un groupe de 10 animaux infectés non traités, pour déterminer si le traitement prolonge de façon significative la durée de.survie.

  
Le Tableau VI donne les résultats de l'essai des composés des Exemples 1 à 16 pour déterminer leur absorption après administration par voie orale. Dans cet essai, on

  
gave les souris avec une dose de 416 mg/kg du composé d'essai en suspension dans un mélange à 33 % de PEG 400 dans l'eau.

  
A des intervalles de temps, on prélève des échantillons de sang du sinus orbital et on détermine l'activité antibiotique comme suit : on place un disque de 7 mm contenant 20 ul de sang entier sur de la gélose ensemencée par Aspergillus

  
 <EMI ID=261.1> 

  
compare les zones d'inhibition provenant des échantillons de sang à une référence obtenue à partir du composé d'essai, et on calcule la quantité de composé dans l'échantillon de sang. 

  

 <EMI ID=262.1> 


  

 <EMI ID=263.1> 
 

  

 <EMI ID=264.1> 


  

 <EMI ID=265.1> 
 

  

 <EMI ID=266.1> 


  

 <EMI ID=267.1> 


  

 <EMI ID=268.1> 
 

TABLEAU IV

  
Activité in vitro du dérivé n-tridécanoylé du noyau de A-30912A vis-à-vis de cinq souches de Candida albicans.

  

 <EMI ID=269.1> 
 

  

 <EMI ID=270.1> 


  

 <EMI ID=271.1> 
 

  

 <EMI ID=272.1> 
 

  

 <EMI ID=273.1> 


  

 <EMI ID=274.1> 


  

 <EMI ID=275.1> 

Claims (25)

REVENDICATIONS

1. Composé de formule : <EMI ID=276.1>

dans laquelle R est H ou OH et <EMI ID=277.1>

H ou tous deux OH,

et

<EMI ID=278.1>

et

R5 est un groupement alkyle en C6-C24 ou alcényle

<EMI ID=279.1>

<EMI ID=280.1>

puisse pas être un groupement n-tridécyle, n-tétradécyle, n-pentadécyle ou n-heptadécyle ; et, quand R est un groupement alcényle, R ne puisse pas

<EMI ID=281.1>

et

quand R et R sont tous deux H, R et R sont tous

<EMI ID=282.1> <EMI ID=283.1>

<EMI ID=284.1>

<EMI ID=285.1>

<EMI ID=286.1>

et

quand R<1>, R<3> et R4 sont tous OH, R<2> est -CO-NH, et R 5 est un groupement alkyle, R 5 ne puisse pas être un groupement n-tridécyle.

2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupement alkyle en C6-C24'

3. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est un groupement alkyle de formule CH3(CH2)n où n est un entier de 5 à 23, pourvu que n ne puisse pas être

<EMI ID=287.1>

puisse pas être 12, 13 ou 14.

4. Composé selon la revendication 3, caractérisé .

<EMI ID=288.1>

5. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est un groupement alkyle de formule

<EMI ID=289.1>

dans laquelle n et m sont indépendamment un entier de 0 à 21,

<EMI ID=290.1>

<EMI ID=291.1>

6. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupement alcényle en C6-C24 contenant une double liaison cis ou trans .

7. Composé selon la revendication 6, caractérisé en ce que R est un groupement cis- ou trans- alcényle de formule <EMI ID=292.1> <EMI ID=293.1>

pourvu que la somme n + m ne soit pas inférieure à 3 et ne soit pas supérieure &#65533; 21.

8. Composé selon la revendication 7, caractérisé

<EMI ID=294.1>

9. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupement alcényle en C6-C24 contenant deux doubles liaisons cis ou trans .

10. Composé selon la revendication 9, caractérisé

<EMI ID=295.1>

CH(CH2)7-

11. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupement alcényle en C6-C24 contenant trois doubles liaisons cis ou trans .

12. Composé selon la revendication 11, caractérisé en ce que R5 est cis,cis,cis-CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2-

<EMI ID=296.1>

13. Procédé de préparation d'un composé de formule III, caractérisé en ce qu'il consiste à acyler avec un

<EMI ID=297.1>

de formule <EMI ID=298.1> dans laquelle R est H ou OH et

<EMI ID=299.1>

H ou tous deux OH,

et

<EMI ID=300.1>

alkyloxy en C -Cg et R 4 est OH, ou bien R <2> est 0 <EMI ID=301.1>

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé

<EMI ID=302.1>

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé

<EMI ID=303.1>

où n est un entier de 5 à 23, pourvu que n ne soit pas

<EMI ID=304.1>

puisse pas être 12, 13 ou 14.

16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé

<EMI ID=305.1>

17. Procédé selon la revendication 14, caractérisé

<EMI ID=306.1> <EMI ID=307.1> <EMI ID=308.1>

pourvu que la somme n + m ne soit pas inférieure à 3 et ne soit pas supérieure à 21.

18. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que R est un groupement alcényle en C6-C24 contenant une double liaison cis ou trans .

19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que R est un groupement cis- ou trans- alcényle de formule

<EMI ID=309.1>

dans laquelle n et m sont indépendamment un entier de 0 à 21, pourvu que la somme n + m ne soit pas inférieure à 3 et ne soit pas supérieure à 21.

20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé

<EMI ID=310.1>

21. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que R est un groupement alcényle en C6-C24 contenant deux doubles liaisons cis ou trans..

22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé

<EMI ID=311.1>

23. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que R est un groupement alcényle en C6-C24 contenant trois doubles liaisons cis ou trans .

24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé

<EMI ID=312.1>

25. Composition antifongique contenant comme ingrédient actif un composé selon l'un quelconque des revendications 1 à 12.