Cette invention concerne de nouveaux composés antifongiques semi-synthétiques que l'on prépare par acylation
de noyaux peptidiques cycliques obtenus par désacylation enzymatique de l'antibiotique peptidique cyclique
correspondant.
L'antibiotique peptidique cyclique est un composé antifongique ayant la formule générale :
<EMI ID=1.1>
<EMI ID=2.1>
Dans toute cette demande, les formules des peptides cycliques,
comme la formule I, supposent que les amino-acides représentes
sont en configuration L.
Les facteurs A, B, D et H de A-30912 sont des
<EMI ID=3.1>
<EMI ID=4.1>
<EMI ID=5.1>
R et R sont tous deux H et R et R sont tous deux OH.
<EMI ID=6.1>
<EMI ID=7.1>
L'antibiotique S 31794/F-l est un peptide cyclique antifongique de formule 1 dans laquelle R est un groupement
<EMI ID=8.1>
Chaque facteur est isolé du complexe A30912 qui contient les autres facteurs arbitrairement appelés facteurs
<EMI ID=9.1>
G individuels sont décrits par M. Hoehn et K. Michel dans
le brevet des E.U.A. N[deg.] 4.024.245. Le facteur A de l'antibiotique A-30912 est identique à l'antibiotique A-22802
<EMI ID=10.1>
Chim. Acta, 57, 2459 (1974) et brevet suisse N[deg.] 568.386] et
à l'antibiotique SL 7810/F [voir C. Keller-Juslen et al.
<EMI ID=11.1>
Le facteur A de l'antibiotique A-30912 est préparé par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ; (b) Aspergillus nidulans NRRL 8112 ;
(c) Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL
3860 ; (d) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 ; ou (e) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.
On a également trouvé que le facteur B est identique
à l'échinocandine C antibiotique [voir R. Traber et al., Helv.
<EMI ID=12.1>
[voir le brevet belge N[deg.] 834.289].
On prépare le facteur B de l'antibiotique A-30912 par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ; (b) Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860 ; (c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 ; ou
(d) Aspergillus niduians var. roseus NRRL 1440.
On a également trouvé que le facteur D est identique
<EMI ID=13.1>
Helv. Chim. Acta, 62, 1252 (1979)] et à l'antibiotique SL
7810/F-III [voir le brevet belge N[deg.] 834.289].
On prépare le facteur D de l'antibiotique A-30912
<EMI ID=14.1> plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus
<EMI ID=15.1>
echinulatus A-32204, NRRL 3860 ; (c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 (voir le brevet belge N[deg.] 834.289) ; ou (d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.
Le facteur H est un facteur de l'antibiotique A-30912
découvert plus tard, et il est décrit dans la demande de
<EMI ID=16.1>
ici par voie de référence.
Le facteur H de A-30912 es préparé par fermentation en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ; ou (b) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.
Une sous-culture de A. nidulans var. roseus a été déposée et fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Regional Research Labotatorv,
U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service,
<EMI ID=17.1>
sous le numéro NRRL 11440.
Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour produire l'un quelconque des facteurs A-30912, on obtient un ensemble complexe de facteurs qui
pour des raisons de commodité est appelé complexe antibiotique A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du complexe antibiotique A-42355, tandis que les facteurs B, D et H sont des facteurs mineurs. Les préparations 2 à 7 suivantes illustrent la préparation du complexe A-42355
<EMI ID=18.1>
A-30912.
<EMI ID=19.1>
<EMI ID=20.1>
cyclique sur le groupement a-amino du reste ornithine. On a trouvé de façon surprenante que la chaîne latérale linoléoyle peut être coupée du noyau par une enzyme sans modifier l'intégrité chimique du noyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction de désacylation est produite par un micro-organisme
<EMI ID=21.1>
Pour effectuer la désacylation, on ajoute le facteur approprié de l'antibiotique A-30912 à une culture du micro-organisme
et on laisse la culture incuber avec le substrat jusqu'à ce
<EMI ID=22.1>
cyclique ainsi obtenu est séparé du bouillon de fermentation par des procédés connus dans le domaine. Au contraire des facteurs A, B, D et H de l'antibiotique A-30912, le noyau cyclique (ne possédant pas la chaîne latérale linoléoyle) est essentiellement exempt d'activité antifongique.
L'antibiotique S31794/F-1, qui est décrit dans la demande de brevet allemand publiée après examen N[deg.] 2.628.965
et dans le brevet des E.U.A. N" 4.173.629, est produit par Acrophialophora limonispora nov. spec. Dreyfuss et Muller
<EMI ID=23.1>
<EMI ID=24.1>
CH3OH) ou + 37[deg.] (c 0,5, pvridine) (cristallisé) ; maxima
<EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
carbone C dans le deuterom�thanol (190 mg dans 1,5 ml de
<EMI ID=27.1>
étalon interne) ayant les caractéristiques suivantes (à l'état cristallisé) :
<EMI ID=28.1>
une analyse élémentaire approximative (après séchage du matériau cristallisé pendant deux heures sous vide poussé à
100[deg.]C) comme suit : 55,5-56,5 % de carbone, 7,5-7,7 %
<EMI ID=29.1>
est facilement soluble dans le méthanol, l'éthanol, la pyridine, le diméthylsulfoxyde et faiblement soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthylique, le benzène et l'hexane ; et a une activité antifongique, en particulier contre Candida albicans.
On prépare l'antibiotique S31794/F-1 par culture aérobie en immersion de Acrophialophora limonispora NRRL
8095 comme décrit dans les préparations 8 et 9. Ce microorganisme fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Régional Research Center, U.S.
Department of Agriculture, Agricultural Research Culture Collection, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, où elle est disponible au public sous le numéro d'accès NRRL indiqué.
L'antibiotique S31794/F-1 a une activité antifongique, en particulier contre les souches Candida comme Candida albicans. Ainsi, la production et l'isolement de l'antibiotique peuvent être contrôlés par bioautographe en utilisant une espèce Candida comme Candida albicans .
Dans la molécule de l'antibiotique S31794/F-1
<EMI ID=30.1>
hydroxy et R est un groupement -CO-NH-f la chaîne latérale myristoyle (R) est fixée au noyau peptidique cyclique sur le groupement a-amino du reste dihydroxyornithine. On a trouvé
<EMI ID=31.1>
être coupée du noyau par une enzyme sans nuire à l'intégrité chimique du noyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction de désacylation est produite par un micro-organisme de la famille Actinoplanaceae, de préférence le microorganisme Actinoplanes utahensis NRRL 12052 ou un de ses variants. Pour effectuer la désacylation, on ajoute l'antibiotique S31794/F-1 à une culture du micro-organisme et on laisse la culture incuber avec le substrat jusqu'à ce
<EMI ID=32.1> cyclique ainsi obtenu est séparé du bouillon de fermentation par des procédés connus dans le domaine. Au contraire de l'antibiotique S31794/F-1, le noyau cyclique (ne présentant pas la chaîne latérale myristoyle) est essentiellement exempt d'activité antifongique.
Les noyaux peptidiques cycliques fournis par les réactions de désacylations enzymatiques susmentionnées des antibiotiques de formule I sont représentés par la formule générale II.
<EMI ID=33.1>
J
Le composé de formule II où R , R et R sont tous des groupements hydroxy et R <2> est H est le noyau du facteur A de A-3C912 et, pour des raisonc de commodité, sera appelé ici "noyau de A-30912A". Le noyau de A-30912A a une formule
<EMI ID=34.1>
Le composé de formule II où R et R sont tous deux
<EMI ID=35.1>
de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appela ici "noyau de A-30912B". Le noyau de A-30912B a une formule
<EMI ID=36.1>
<EMI ID=37.1>
Le composé de formule II où R , R , R et R sont tous des atomes d'hydrogène est le noyau du facteur D de A-30912 et sera appelé ici pour des raisons de commodité "noyau de A-30912D". Le noyau de A-30912D a une formule
<EMI ID=38.1>
Le composé de formule II où R et R' sont tous deux OH, R2 est H et R <3> est CH30- est le noyau du facteur H de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelé ici "noyau de A-30912H".
Le composé de formule II dans laquelle R , R et
<EMI ID=39.1>
un poids moléculaire de 840,87.
L'enlèvement de la chaîne latérale fournit un
<EMI ID=40.1>
peptide cyclique. Comme le verra l'homme de l'art, les noyaux peuvent être obtenus sous la forme de l'amine libre ou sous la forme d'un sel d'addition d'acide . Bien que l'on puisse utiliser un quelconque sel d'addition d'acide approprié, on préfère ceux qui sont non toxiques et acceptables sur le plan pharmaceutique.
Le procédé de préparation de chaque noyau à partir de l'antibiotique approprié à l'aide d'une fermentation utilisant Actinoplanes utahensis NRRL 12052 est décrit dans la demande de brevet déposée le même jour que la présente
<EMI ID=41.1>
Des cultures d'espèces représentatives d'Actinopnanaceae sont mises à la disposition du public au Northern Regional Research Laboratory sous les numéros d'accès suivants :
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
pour la mise en oeuvre de la désacylation de cette invention est déterminée par le mode opératoire suivant. On inocule avec le micro-organisme un milieu de culture approprié. On
<EMI ID=44.1>
jours sur un agitateur rotatif. Puis on ajoute à la culture l'un des antibiotiques utilisés comme substrat. On maintient
le pH du milieu de fermentation à environ 6,5. On contrôle ) la culture pour son activité en utilisant une analyse par Candida albicans. La perte de l'activité antibiotique est une indication que le micro-organisme a produit l'enzyme nécessaire pour la désacylation. Ceci doit cependant être vérifié en utilisant l'un des procédés suivants : 1) analyse par chromatographie liquide sous pression élevée pour déterminer la présence du noyau intact ; ou 2) réacylation avec une chaîne latérale appropriée (par exemple linoléoyle, stéaroyle, palmitoyle ou myristoyle) pour rétablir l'activité.
On sait que d'autres substances antibiotiques possèdent le même noyau que celui de facteur A de l'antibiotique A-30912. Ces antibiotiques diffèrent du facteur A de l'antibiotique A-30912 en ce que des groupements acyle différents sont présents à la place du groupement linoléoyle
(R) de la formule I. De tels antibiotiques sont : (a) le
<EMI ID=45.1>
tétrahydro êchinocandine B) décrit dans le brevet belge
<EMI ID=46.1>
<EMI ID=47.1>
est un groupement stéaroyle ; et (b) l'aculaécine A, qui est un composant du complexe d'aculaëcine (préparée par
fermentation en utilisant Aspergillus aculeatus NRRL 8075) et sst décrit dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 3.978.210. Comme décrit dans le brevet belge N[deg.] 859.067, dans l'aculaécine A, la chaîne latérale palmitoyle est présente à la place du groupement linoléoyle. Le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur A de A-30912 par
<EMI ID=48.1>
sous une pression positive. Le facteur A de A-30912 7
<EMI ID=49.1>
utilisés comme substrats pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.
On sait également qu'une autre substance antibiotique possède le même noyau que le facteur B de l'antibiotique A-30912. Cette substance, qui diffère du facteur B de l'antibiotique A-30912 en ce qu'un groupement acyle différent est présent à la place du groupement
<EMI ID=50.1>
tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-II ; tétrahydro ëchinocandine C) décrit par R. Traber et al., Helv.
<EMI ID=51.1>
peut être préparé à partir du facteur B de A-30912 par
<EMI ID=52.1>
sous pression positive. Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné
<EMI ID=53.1>
l'antibiotique A-30912 pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.
On sait en outre qu'une autre substance antibiotique possède le même noyau que le facteur D de A-30912. Cette substance, qui diffère du facteur D de l'antibiotique
A-30912 en ce qu'un groupement acyle différent est présent à la place du groupement linoléoyle (R) de la formule I, est le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL
7810/F-III ; tétrahydro-ëchinocandine D) décrit par R.
<EMI ID=54.1>
de A-30912 tétrahydrogéné est décrit par la formule I quand R est un groupement stéaroyle. Le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur D de l'antibiotique A-30912 par hydrogénation catalytique en
<EMI ID=55.1>
facteur D de A-30912 tétrahydrogéné peut être utilisé comme substrat à la place du facteur D de A-30912 antibiotique pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.
<EMI ID=56.1> groupement 5-hydroxy présent dans le reste dihydroxyornithine du r.oyau peptidique est méthylé, tandis que dans le facteur A de L'antibiotique A-30912, le groupement 5hydroxy n'est pas substitué. On verra donc que l'on peut préparer le facteur H de façon synthétique en mëthylant le facteur A selon des procédés classiques pour préparer un éther aliphatique � partir d'un alcool. On verra également que le facteur A peut être alkylé avec d'autres groupements alkyle inférieur pour former des homologues à groupements alkyloxy de la molécule du facteur H. Les homologues à groupements alkyloxy du facteur H que l'on peut préparer par
<EMI ID=57.1>
d'homologues du type facteur H de A-30912. Les composés de
<EMI ID=58.1>
formule II où R et R sont tous deux OH, R est H et R est un groupement alkyloxy en C2-C6 sont ici appelés comme les "noyaux du type A-30912H".
On verra également que la chaîne latérale linoléoyle
<EMI ID=59.1>
groupements alkyloxy (R est un groupement stéaroyle). On peut également préparer les dérivés tétrahydrogénés en hydrogénant d'abord le facteur A de l'antibiotique A-30912 pour obtenir le facteur A de A-30912 tétrahydrogêné puis en formant le dérivé alkyloxy désiré.
Il est entendu que le facteur H de l'antibiotique A-30912, le facteur H de A-30912 tétrahydrogéné, un homologue à groupements alkyloxy en C2-C6 du facteur H ou un dérivé tétrahydrogéné d'un homologue du factaur H � groupement alkyloxy en C2-C6 peuvent être utilisés comme substrat pour la désacylation enzymatique en utilisant
les modes opératoires décrits ici.
L'invention qui fait l'objet de la présente demande de brevet décrit de nouveaux composés obtenus par acylation de noyaux peptidiques cycliques de formule II. Les composés de la présente invention ont la formule chimique décrite par la formule III :
<EMI ID=60.1>
dans laquelle R est H ou OH et :
<EMI ID=61.1>
H ou tous deux OH,
et
<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
<EMI ID=64.1>
0
<EMI ID=65.1>
W est un radical aminoacyle divalent de formule :
0
(a) -C-A-NH- <EMI ID=66.1> <EMI ID=67.1>
0 R7
(b) -C-CH-NH- <EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
mercaptoéthyle, méthylthioéthyle, 2-thiényle, 3-indole-méthyle, phényle, benzyle ou phényle substitué ou benzyle substitué dont le noyau benzène est substitué par un radical chloro,
<EMI ID=70.1>
alkylthio en C1-C3, carbamyle ou alkyl-
<EMI ID=71.1>
<EMI ID=72.1>
dans laquelle X est un atome d'hydrogène, de chlore, de brome ou d'iode ou un groupement
<EMI ID=73.1>
<EMI ID=74.1>
<EMI ID=75.1>
<EMI ID=76.1>
<EMI ID=77.1>
brome ou d'iode ;
<EMI ID=78.1>
<EMI ID=79.1>
où B est un radical divalent de formule <EMI ID=80.1>
-CH=CH-CH2- ; ou 0
-CNHCH -
<EMI ID=81.1>
CI?
Tels qu'utilisés ici,les termes alkylène, alkyle, alcoxy, alkylthio et alcényle désignent les chaînes hydrocarbonées ramifiées et droites. Le terme alkyle désigne un radical hydrocarboné saturé monovalent. Le terme alcényle désigne un radical hydrocarboné insaturé monovalent contenant une, deux ou trois doubles liaisons, qui peuvent être en
<EMI ID=82.1>
hydrocarboné saturé divalent. Cycloalkylène désigne un radical hydrocarboné saturé cyclique divalent.
<EMI ID=83.1>
l'on préfère pour les besoins de cette invention sont :
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
C4 (c'est-à-dire méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-
<EMI ID=86.1>
p est un entier de 1 à 8 et q est un er.tier de 0 à 7, pourvu que p + q ne soit pas supérieur à 8.
<EMI ID=87.1>
l'on préfère pour les besoins de la présente invention sont :
(a) CH3-
(b) -(CH2)nCH3 où n est un entier de 1 à 16 ; et
CH3 <EMI ID=88.1> un entier de 0 à 14 pourvu que r + s ne soit pas supérieur à 14. <EMI ID=89.1> indépendamment un entier de 0 à 14 pourvu que t + u ne soit pas supérieur à 14. <EMI ID=90.1> où v et z sont indépendamment un entier de 0 à 11 et y est un entier de 1 à 12 pourvu que v + y + z ne soit pas supérieur à 11.
On préfère en particulier les exemples suivants de groupements alkyle en CI-CI? :
<EMI ID=91.1>
On préfère en particulier les exemples suivants de
<EMI ID=92.1>
<EMI ID=93.1>
<EMI ID=94.1>
0
Il
l'homme de l'art verra que la fonction -C- et la fonction
<EMI ID=95.1>
ortho, mëta ou para l'une par rapport à l'autre. Le substituant représenté par X peut se trouver en une quelconque position disponible sur le noyau benzénique. Les composés préférés sont ceux dans lesquels X est un atome d'hydrogène
0
ri
et les fonctions -C- et -NH- sont placées en configuration para.
Les expressions "phényle substitué" et "benzylc
'7
substitué" telles qu'utilisées pour R' dans la formule III, désignent la substitution d'un groupement sur l'une quelconque des positions disponibles du noyau benzène, c'està-dire que le substituant peut se trouver en position ortho,
<EMI ID=96.1>
définie par R' ou X dans la formule III comprend les groupements méthyle, éthyle, n-propyle et iso-propyle.
L'invention fournit en particulier un composé de formule :
<EMI ID=97.1>
dans laquelle R est H ou OH et 16
<EMI ID=98.1>
<EMI ID=99.1>
et
<EMI ID=100.1>
groupement alkyloxy en C -C,- et R est OH, ou bien R est un groupement -CO-NH2 et R et R sont tous deux OH ;
<EMI ID=101.1>
0
formule -W-C-R où :
W est un radical aminoacyle divalent de formule :
0
<EMI ID=102.1>
cycloalkylène en CS-C6 ;
<EMI ID=103.1>
(b) -C-CH-NH- <EMI ID=104.1>
hydroxyéthyle, mercaptomëthyle, mercaptoéthyle, méthylthioéthyle, 2-thicnyle, 3-indole-méthyle, phényle, benzyle ou phényle substitué ou
<EMI ID=105.1>
substitué par un radical chloro, bromo, iodo,
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
où X est un radical hydrogène, chloro, bromo,
<EMI ID=108.1>
<EMI ID=109.1>
où X est un atome de chlore, de brome ou d'iode ;
<EMI ID=110.1>
où B est un radical divalent de formule .
<EMI ID=111.1>
-CH=CH-CH2 ; ou <EMI ID=112.1>
CI?
Les composés de formule III inhibent la croissance
des champignons pathogènes comme le montrent des modes opératoires d'essais biologiques classique. Les composés sont donc utilisables pour lutter contre la croissance de champignons sur des surfaces d'environnement (en tant qu'antiseptiques) ou pour le traitement d'infections provoquées par des champignons. L'activité antifongique des composés a été démontrée vis-à-vis de Candida albicans in vitro dans des essais de diffusion sur disques et plaques de gélose et dans
<EMI ID=113.1>
sur des souris infectées par C. albicans. Les composés sont ainsi particulièrement utilisables pour traiter les infections provoquées par des souches de C. albicans (candidose). Les composés de formule III présentent également une activité
in vitro dans les essais de diffusion sur disques et plaques de gélose vis-à-vis de Trichophyton mentagrophytes, un organisme dermatophyte. On a également trouvé une activée dans les essais de diffusion sur disques et plaques de gélose in vitro vis-â-vis'de Saccharomyces pastorianus et Neurospora <EMI ID=114.1>
Tableau 8), donnent des niveaux sanguins significatifs après administration orale chez les souris.
Quand on l'administre à un chien par voie intraveineuse à raison de 100 mg/kg par jour pendant cinq
13 jours, le composé de formule III dans laquelle R , R et R sont tous OH, R2 est H et R 5 est un groupement n-dodécanoylep-aminobenzoyle, ne présente pas de signes extérieurs de toxicité bien que l'on observe des niveaux accrus de transaminase glutamo-pyruvique sérique.
On prépare les composés de formule III en acylant le noyau approprié sur le groupement a-amino d: l'ornithine avec la chaine latérale N-alcanoyl-aminoacyl� ou N-alcénoylamine-acyle appropriée en utilisant les procédés classiques dans le domaine pour former une liaison amide. L'acylation est généralement effectuée en faisant réagir le noyau avec un dérivé activé de l'acide (formule IV) correspondant à la chaîne latérale acyle désirée.
<EMI ID=115.1>
<EMI ID=116.1>
Par l'expression "dérivé activé", on désigne un dérivé qui
<EMI ID=117.1>
copulation avec le groupement amino primaire pour former la liaison amide qui lie la chaîne latérale acyle au noyau. Les dérivés activés appropriés, leurs procédés de préparation et leurs procédés d'utilisation comme agents d'acylation d'une amine primaire sont connus de l'homme de l'art. Les dérivés activés préférés sont (a) un halogénure d'acide (par exemple le chlorure d'acide), (b) un anhydride d'acide (par exemple un anhydride d'acide alcoxyformique ou un anhydride d'acide aryloxyformique) ou (c) un ester activé (par exemple un
<EMI ID=118.1>
benzotri.azole ou un ester de �-hydroxysuccinimide). D'autres procédés d'activation de la fonction carboxy comprennent la 19
<EMI ID=119.1>
<EMI ID=120.1>
diisopropylcarbodiimide) pour obtenir un intermédiaire réactif qui, en raison de son instabilité, n'est pas isolé, la réaction avec l'amine primaire étant effectuée in situ.
Un procédé préféré de préparation des composés de formule III est le procédé utilisant l'ester actif.
L'utilisation de l'ester 2,4,5-trichlorophényLique du N-
<EMI ID=121.1>
formule IV comme agent d'acylation est nettement préférée.
Dans ce procédé, on fait réagir un excès de l'ester actif avec le noyau, à la température ambiante dans un ' solvant
<EMI ID=122.1>
durée de la réaction n'est pas déterminante bien que l'on préfère une durée d'environ 15 à environ 18 heures. A la fin de la réaction, on chasse le solvant et on purifie le résidu, comme par chromatographie sur colonne en utilisant du gel de
<EMI ID=123.1>
d'éthyle et de méthanol comme système solvant-
On peut préparer commodément les esters 2,4,5-
<EMI ID=124.1>
alcénoylamino-acides, en traitant l'amino-acide désiré
(formule IV) par le 2,4,5-trichlorophénol en présence d'un agent de copulation, comme le N,N'-dicyclohexylcarbodiimide. D'autres procédés appropriés de préparation des esters d'amino-acides seront évidents pour l'homme de l'art.
<EMI ID=125.1>
acides sont des composes connus ou bien ils peuvent être préparés par acylation de l'amino-acide approprié avec le groupement alcanoyle ou alcénoyle approprié en utilisant des procédés classiques, comme ceux décrits ci-dessus. Une façon préférée de préparation des N-alcanoylamino-acides consiste
<EMI ID=126.1>
utilisés dans la préparation des produits de l'invention
sont des composés connus ou bien ils peuvent être préparés
par des procédés connus ou par modification de procédés connus, qui seront évidents pour l'homme de l'art.
Si un amino-acide particulier contient un groupement fonctionnel acylable autre que le groupement
<EMI ID=127.1>
protégé avant la réaction de l'amino-acide avec le réactif utilisé pour fixer le groupement alcanoyle ou alcénoyle. Des groupements protecteurs appropriés peuvent être un quelconque groupement connu dans le domaine comme utilisable pour la protection d'un groupement fonctionnel d'une chaîne latérale dans la synthèse des peptides. De tels groupements sont bien connus, et le choix d'un groupement protecteur particulier et son procédé d'utilisation seront facilement connus de l'homme de l'art [voir par exemple "Protective Groups In Organic
Chemistry", M. McOmie, Editer, Plenum Press, N.Y., 1973].
On verra que certains amino-acides utilisés dans la synthèse des produits de cette invention peuvent exister sous formes optiquement actives, et l'on peut utiliser tant la configuration naturelle (configuration L) que l'autre
<EMI ID=128.1>
et l'on obtiendra des produits qui font partie de la présente invention.
Quand on les utilise de façon générale, la dose des composés de formule III variera selon le composé particulier que l'on utilise, la sévérité et la nature de l'infection, et l'état physique du sujet que l'on traite. La thérapie sera amorcée à de faibles doses, la dose étant augmentée jusqu'à ce que l'on obtienne l'effet antifongique désiré. Les composés peuvent être administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire sous la forme d'une solution ou suspension aqueuse stérile à laquelle on peut ajouter, si on le désire,, divers agents de conservation, tampons, de solubilisation ou de mise en suspension classiques acceptables sur le plan pharmaceutique. D'autres additifs, comme du sel ou du glucose, peuvent être ajoutés pour rendre les solutions isotoniques. Les proportions et la nature de ces additifs seront évidentes pour l'homme de l'art.
Certains composés de formule III donnent des taux dans le sang significatifs après administration craie (voir la
l'Exemple 40, Tableau 8) et peuvent être administrés de façon systémique par voie orale. Pour l'utilisation orale,
<EMI ID=129.1>
des supports ou excipients acceptables sur le plan pharmaceutique sous forme de capsules, comprimés ou poudres. La nature et la proportion de ces supports ou excipients sont bien connues de l'homme de l'art.
Quand on les utilise pour traiter les infections vaginales dues à Candida, les composés de formule III peuvent être administrés en combinaison avec des excipients classiques pharmaceutiquement acceptables convenant pour l'utilisation intravaginale. Les compositions conçues pour l'administration intravaginale sont bien connues de l'homme de l'art.
La préparation et l'utilisation des composés de la présente invention sont illustrées dans les exemples suivants :
Préparation 1
Fermentation d'Actinoplanes utahensis NRRL 12052
<EMI ID=130.1>
inclinée de gélose. Le milieu utilisé pour préparer la culture inclinée est choisi parmi l'un des suivants :
Milieu A
<EMI ID=131.1>
<EMI ID=132.1>
le pH avant passage à l'autoclave est environ 5,9 ; on ajuste le pH â 7,2 par addition de NaOH ; après passage à l'autoclave, le pH est d'environ 6,7.
<EMI ID=133.1>
Ingrédient Quantité
<EMI ID=134.1>
<EMI ID=135.1>
Milieu B
<EMI ID=136.1>
<EMI ID=137.1>
Solution minérale de Czapek 2,0 ml Gélose 20,0 g
Eau désionisée q.s.p. 1 litre N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, New
Jersey, U.S.A.
On inocule la culture inclinée avec Actinoplanes
utahensis NRRL 12052, et on fait incuber la culture inoculée à 30[deg.]C pendant environ 8 à 10 jours. On utilise à peu près la moitié de la culture pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante :
<EMI ID=138.1>
<EMI ID=139.1>
ajuster à pH 7,4 avec NctOII ; après passage à l'autoclave, le
<EMI ID=140.1>
New York, U.S.A.
On fait incuber le milieu végétatif inoculé dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml à large encolure à 30[deg.]C
pendant environ 72 heures sur un agitateur tournant sur un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.
On peut utiliser ce milieu végétatif incubé directement pour inoculer un milieu végétatif de second stade. Ou bien et de préférence, on peut le conserver pour un usage ultérieur en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour une telle conservation dans de nombreuses petites ampoules comme suit :
dans chaque ampoule, on place 2 ml de milieu végétatif incubé et 2 ml d'une solution de glycérol et de lactose [voir W.A. Dailey et C.E. Higgens, "Preservation and Storage of Microorganisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10,
364-367 (1973) pour les détails]. Les suspensions ainsi préparées sont conservées dans la phase vapeur de l'azote liquide.
On utilise une suspension conservée (1 ml) ainsi préparée pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif de premier stade (ayant la composition décrite ci-avant). On fait incuber comme décrit précédemment le milieu végétatif de premier stade inoculé.
Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml du milieu végétatif de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu végétatif de second stade ayant la même composition que le milieu végétatif de premier stade. On fait incuber le milieu de second stade dans un
<EMI ID=141.1>
environ 48 heures sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.
On utilise le milieu végétatif de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, pour inoculer
100 1 d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un
des suivants :
Milieu 1
<EMI ID=142.1>
<EMI ID=143.1>
Eau du robinet q.s.p. 1 litre
Le pH du milieu est environ 6,9 après stérilisation par passage à l'autoclave à 121[deg.]C pendant 45 minutes sous une pression d'environ 1,1 à 1,24 bar.
Milieu II
<EMI ID=144.1>
<EMI ID=145.1>
<EMI ID=146.1>
le pH est d'environ 7,0.
<EMI ID=147.1>
<EMI ID=148.1>
Le pH final est d'environ 6,6.
On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans une cuve de fermentation de 165 1 à une température d'environ 30[deg.]C pendant environ 42 heures. On agite le milieu de fermentation avec des agitateurs classiques à environ 200 tours par minute et on l'aère avec de l'air stérile pour
<EMI ID=149.1>
saturation par l'air à la pression atmosphérique.
Préparation 2
Préparation du mélange antibiotique A-42355
A. Fermentation en flacon agité
On prépare une culture d'Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 et on la maintient sur une gélose inclinée de 18 x 150 ml, préparée avec un milieu ayant la composition suivante :
<EMI ID=150.1>
Eau désionisée q.s.p. 1 litre
(pH initial 6,1)
<EMI ID=151.1>
<EMI ID=152.1>
La culture inclinée est inoculée avec Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 puis on fait incuber la culture à 25[deg.]C pendant environ sept jours. On recouvre d'eau la culture inclinée mûre et on la gratte avec une anse
stérile pour libérer les spores. La suspension résultante est ensuite mise en suspension dans 10 ml d'eau désionisée stérile.
On utilise 1 ml de la culture inclinée en suspension
<EMI ID=153.1>
250 ml. Le milieu végétatif a la composition suivante :
Ingrédient Quantité
<EMI ID=154.1>
(pH initial 6,5-6,7)
<EMI ID=155.1>
On fait incuber le milieu végétatif inoculé à 25 [deg.]C pendant 48 heures, à 250 tours par minute, sur un agitateur
de type rotatif. Après 24 heures, on homogénéise le milieu pendant une minute faible vitesse dans un mélangeur
(de type Waring), puis on le fait incuber à nouveau pendant les 24 heures restantes. Ou bien, on peut faire incuber le milieu végétatif inoculé pendant 48 heures puis l'homogénéiser
<EMI ID=156.1>
Ce milieu végétatif incubé peut être utilisé pour inoculer un milieu de culture de fermentation en flacon agité; ou pour inoculer un milieu végétatif de second stade. On peut également le conserver pour une utilisation ultérieure, en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour cette conservation dans de nombreuses petites ampoules, comme suit .
On mélange les cultures végétatives volume/volume avec une solution de suspension ayant la composition suivante:
<EMI ID=157.1>
On répartit les suspensions préparées dans de petits tubes stériles à bouchon vissé (4 ml par tube). On conserve ces tubes dans la phase vapeur de l'azote liquide.
On peut utiliser une suspension conservée ainsi préparée pour inoculer des cultures inclinées ou des milieux d'ensemencement liquides. On fait incuber les cultures inclinées à 25[deg.]C à la lumière pendant 7 jours.
B. Fermentation en réservoir
Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml de la culture végétative de premier stade
<EMI ID=158.1>
végétatif de second stade ayant la même composition que celui du milieu végétatif. Le milieu de second stade est incubé
<EMI ID=159.1>
25[deg.]C pendant 24 heures, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.
Le milieu de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, est utilisé pour inoculer 100 litres d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants :
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
<EMI ID=162.1>
(pH initial 6,8-7,0)
<EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
:::::; N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.
U.S.A.
:::::::: P2000, Dow Corning, Midland, Michigan, U.S.A.
Milieu V
<EMI ID=165.1>
On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un
<EMI ID=166.1>
pendant 7 jours. On aère le milieu de fermentation avec de
<EMI ID=167.1> supérieur à environ 50 % de la saturation en air.
C. Milieu végétatif de troisième stade
Si l'on effectue la fermentation dans des réservoirs plus grands que ceux utilisés pour la fermentation par
100 litres, il est recommandé d'utiliser une culture végétative de troisième stade pour ensemencer Je réservoir plus grand. Un milieu végétatif de troisième stade préféré a la composition suivante :
<EMI ID=168.1>
<EMI ID=169.1>
Préparation 3
Séparation du mélange antibiotique A-42355
On agite soigneusement le bouillon de fermentation entier (4127 litres), obtenu par le procédé décrit dans l'Exemple 1 en utilisant le milieu de production II, avec
4280 litres de méthanol pendant une heure, puis on filtre, en utilisant un adjuvant de filtration (Hyflo Supercel, une terre de diatomées, Johns-Manville Products Corp.). On ajuste le pH du filtrat à 4,0 par addition d'HCl 5 N. On extrait le
<EMI ID=170.1>
concentre sous vide jusqu'à un volume de 20 litres. On ajoute ce concentré à 200 litres d'éther diéthylique peur faire précipiter le mélange A-42355. On sépare le précipité par filtration et l'on obtient 2775 g du mélange A-42355 sous forme d'une poudre blanc gris.
Séparation et identification des facteurs de A-30912
Préparation 4
Séparation du facteur A de A-30912
<EMI ID=171.1>
préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 7 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit dans une colonne en verre de 3,7 cm de diamètre intérieur et de 35 cm de longueur
<EMI ID=172.1>
microns), qui a été préparée comme décrit dans la Préparation 10, par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système
à vannes. La colonne est garnie dans le système 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, à l'aide du mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11.
Une pompe F.M.I. avec une conception de piston sans vannes
(débit maximal 19,5 ml/minute) est utilisée pour déplacer le solvant dans la colonne à un débit de 9 ml/minute à 7 bars, des fractions étant recueillies toutes les minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist
Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6).
Préparation 5
<EMI ID=173.1>
On sépare le mélange A-42355 comme décrit dans la Préparation 3, mais on chromatographie les extraits chloroformiques concentrés (285 1) sur une colonne de gel de silice (150 1 de gel de silice Grace, qualité 62) � un débit de 2 1/minute. On lave la colonne avec 200 litres de
<EMI ID=174.1>
on l'élue continuellement avec un mélange 98:2 d'acëtonitrile et d'eau à un débit de 1 1/minute. On recueille des fractions
<EMI ID=175.1>
pour déterminer leur activité biologique. L'analyse biologique est effectuée par une analyse sur disque de papier sur plaque de gélose, ensemencée par Candida albicans. On réunit les fractions 77 � 103 (1365 litres) et on les
concentre sous vide. La solution concentrée (4,5 litres) contient un précipité qu'on enlève par filtration et l'on obtient 119 g de mélange A-42355 enrichi en facteur B. On concentre le filtrat à siccité. On redissout le résidu obtenu dans un volume approprié de méthanol. On ajoute la solution méthanolique à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le complexe antibiotique contenant le facteur B. On sépare également ce précipité par filtration et on le sèche, et l'on obtient 24 g supplémentaires de mélange A-42355 enrichi de facteur B sous forme d'une poudre grise.
Le mélange A-42355 enrichi en facteur B ainsi obtenu <EMI ID=176.1>
et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (Colonne Michel-Miller de 3,7 cm de diamètre intérieur x 33 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes.
<EMI ID=177.1>
la Préparation 10, à l'aide du mélange 7:2:1 de méthanol, d'ea�, et d'acétonitrile, comme décrit dans la Préparation 11.
Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 10 ml/ minute à environ 7 bars, en utilisant une pompe FMI à piston sans vannes On recueille une fraction toutes les minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme dans la Préparation 15. On réunit les fractions 102-110 et on les
concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on la lyophilise, ce qui donne 22 mg du facteur B de A-30912.
Préparation 6
Isolement du facteur D de A-30912
On réunit et on chromatographie sur une colonne de gel de silice (Grace, qualité 62) les extraits chloroformiques concentrés de deux essais de fermentation (3800 1 et 4007 1) obtenus par le procédé décrit dans la Préparation 3. On lave la colonne avec du chloroforme puis on élue avec de l'acétonitrile et un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau. On recueille des fractions ayant un volume d'environ 200 1 et on les soumet à une analyse biologique sur disque de papier sur gélose
<EMI ID=178.1>
actives (850 1) et on les concentre sous vide. On ajoute la solution concentrée (0,7 1) à 10 volumes d'éther diéthyligue pour faire précipiter le mélange A-42355 enrichi en facteur
D. On enlève ce précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 32 g de mélange A-42355 enrichi en facteur D sous forme d'une poudre grise.
On dissout le mélange A-42355 enrichi en facteur D ainsi obtenu (1,0 g) dans 5 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. Or filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (colonne Michel-Miller, 3,7 cm de diamètre intérieur x 30 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes.
La colonne a été garnie de résine phase inversée de gel de silice LP-l/C (10-20 microns) préparée comme décrit dans la Préparation 10. Le garnissage a été effectué dans un mélange
<EMI ID=179.1>
opératoire de garnissage de la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 3,1 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes. On recueille une fraction toutes les 2 minutes.
<EMI ID=180.1>
décrit dans la Préparation 4. On réunit les fractions 96-108 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout cette huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 89 mg du facteur D de �-30912.
Préparation 7
Séparation du facteur H de A-30912
On dissout 5,0 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 35 ml
<EMI ID=181.1>
filtre la solution résultante et on l'introduit sur une colonne de verre de 3,7 cm de diamètre intérieur x 42 cm
(colonne Michel-Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système de vannes. La colonne est garnie de
<EMI ID=182.1>
<EMI ID=183.1>
d'eau et d'acétonitrile comme décrit dans la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un délit Cite 13 ml/ minute à environ 8,3 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes, et l'on recueille une fraction toutes les deux minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans la Préparation 19, paragraphe C. On réunit les fractions 112-132 avec les fractions 106-117 d'une seconde purification similaire. Les fractions réunies sont concentrées sous vide jusqu'à une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol
<EMI ID=184.1>
A-30912.
<EMI ID=185.1>
dans 8 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile ; on filtre la solution résultante et on la réintroduit sur une colonne de verre de 2,0 cm de diamètre intérieur x 32 cm, comme décrit ci-dessus. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 5,5 bars, et on recueille une fraction toutes les 3 minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm. On réunit les fractions 17 et 18 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile- On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 29 mg du facteur E de A-30912.
<EMI ID=186.1>
Les différents facteurs de A-30912 peuvent être identifia par chromatographie sur couche mince (CCM). Les Rf des facteurs A â G de A-3C912, en utilisant la CCM sur gel de silice (Merck, Darmstadt),un système solvant 7:3 de benzène et de méthanol et un bioautographe par Candida albicans sont indiqués dans le Tableau VII.
TABLEAU VII
<EMI ID=187.1>
<EMI ID=188.1>
<EMI ID=189.1>
CCM sur gel de silice (plaques de gel de silice n[deg.] 60 de Merck Darmstadt, 20 x 20 cm) et un bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau VIII.
<EMI ID=190.1>
<EMI ID=191.1>
Systèmes solvants
a : acétate d'éthyle:méthanol (3:2)
<EMI ID=192.1>
On peut également identifier les facteurs A, B, D et
<EMI ID=193.1>
de caractéristiques élevées (CLPFCE) analytique, dans les conditions suivantes :
<EMI ID=194.1>
Injection injection sur boucle
Les durées de rétention approximatives pour les facteurs A, B, D et H de A-30912 dans ces conditions sont résumées dans le Tableau IX.
TABLEAU IX
Facteur de A-30912 Temps de rétention (s)
<EMI ID=195.1>
Préparation 8
Préparation de l'antibiotique S31794/F-1
On produit l'antibiotique S31794/F-1 par culture en immersion d'Acrophialophora limonispora NRRL 8095, en agitant, remuant et/ou aérant à pH 3-8, de préférence 5-7, et à 15-30[deg.]C, de préférence à 18-27[deg.]C, pendant 48 à 360 heures, de préférence pendant 120 à 288 heures.
<EMI ID=196.1>
<EMI ID=197.1>
d'acétate d'éthyle et d'isopropanol et en homogénéisant pendant 30 minutes à la température ambiante. On sépare la phase organique et on l'évaporé sous vide à environ 40[deg.]C. On chromatographie le résidu ainsi obtenu sur environ dix fois sa quantité de gel de silice, en utilisant des mélanges de chloroforme et de méthanol (95:5 à 60:40). On réunit les fractions qui ont une activité antifongique et on les chromatographie sur 100 fois leur quantité de "Sephadex
<EMI ID=198.1>
<EMI ID=199.1>
réunies et rechromatographiées sur 100 fois leur quantité de gel de silice (0,05-0,2 mm) avec un système solvant
71:25:4 de chloroforme, de méthanol et d'eau. Les fractions éluées qui ont une activité antifongique sont réunies et évaporées sous vide pour obtenir l'antibiotique brut S31794/F-1. On dissout ce produit dans de petites quantités
<EMI ID=200.1>
pour obtenir S31794/F-1 sous forme d'une poudre amorphe
<EMI ID=201.1> vide poussé à 25-30[deg.]C. La cristallisation dans dix fois son volume de mélange 30:12:8 d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'eau donne S31794/F-1 cristallisé, p.f. 181-183[deg.]C avec
<EMI ID=202.1>
Préparation 9
Séparation de l'antibiotique S31794/F-1
On introduit l'antibiotique S31794/F-1 brut, obtenu comme décrit dans la Préparation 8 après chromatographie sur Sephadex, sur une colonne de gel de silice (colonne MichelMiller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. On utilise le mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11. On déplace le solvant dans la colonne en utilisant une pompe FMI avec une conception de piston sans vannes. On contrôle l'élutior. de l'antibiotique en utilisant un appareil de contrôle UV à
280 nm comme dans la Préparation 22. On réunit les fractions ayant une activité antifongique et or: les concentre sous
vide pour obtenir l'antibiotique S31794/F-1.
<EMI ID=203.1>
sur couche mince de gel de silice (Merck, 0,25 mm) :
Système solvant Rf
<EMI ID=204.1>
S31794/F-1 peut également être détecté par de la vapeur d'iode.
Préparation 10
Préparation de la résine à phase inversée de gel de silice/
C18
Etape 1 : Hydrolyse
On ajoute 1000 g de gel de silice LP-1 (Quantum
<EMI ID=205.1>
sulfurique concentré et de 1650 ml d'�cide nitrique concentré dans un ballon à fond rond de 5 1 et on agite pour obtenlr une suspension appropriée. On chauffe le mélange sur un bain de vapeur pendant une nuit (16 heures) avec un réfrigérant à refroidissement d'eau fixé sur le ballon.
On refroidit le mélange dans un bain de glace et on
<EMI ID=206.1>
fritté. On lave le gel de silice avec de l'eau désionisée jusqu'à pH neutre. Puis, on lave le gel de silice avec 4 1 d'acétone et on le sèche sous vide à 100[deg.]C pendant deux jours.
Etape 2 : Première silylation
Le gel de silice sec de l'Etape 1 est transféré dans un ballon à fond rond et mis en suspension dans 3,5 1 de toluène. On chauffe le ballon au bain de vapeur pendant deux heures pour chasser toute l'eau résiduelle par distillation azéotrope. On ajoute 321 ml d'octadécyltrichlorosilane (Aldrich Chemical Company), et on chauffe le mélange réactionnel à reflux pendant une nuit (16 heures) avec une lente agitation mécanique à 60[deg.]C. On prend soin d'éviter que l'agitateur ne soit trop près de la partie inférieure du ballon, pour éviter un broyage des particules
<EMI ID=207.1>
On laisse le mélange refroidir. On recueille le gel de silice silanisé, on le lave avec 3 1 de toluène et 3 1
d'acétone, puis on le sèche à l'air pendant une nuit (16-20 heures). On met le gel de silice séché en suspension dans 3,5 1 d'un mélange 1:1 d'acétonitrile et d'eau dans un ballon de 5 1, on agite soigneusement à la température ambiante pendant deux heures, on filtre, on lave avec 3 1 d'acétone et on sèche à l'air pendant une nuit.
Etape 3 : Deuxième silylation
On répète le mode opératoire de la première
<EMI ID=208.1>
chauffe la suspension à reflux à 60[deg.]C pendant deux heures, tout en agitant soigneusement. On recueille le produit final
<EMI ID=209.1>
mëthanol, puis on le sèche sous vide à 50[deg.]C pendant une nuit
(16-20 heures).
Préparation 11
Mode opératoire de garnissage en suspension pour les colonnes Michel-Miller Renseignements généraux
On utilise ce mode opératoire pour garnir une
<EMI ID=210.1>
celle préparée par le procédé de la Préparation 10.
En général, une pression inférieure à 14 bars et des débits compris entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette technique de garnissage en suspension ; ceci dépend du volume et des dimensions de la colonne. La pression de garnissage doit être supérieure à la pression utilisée pendant la séparation réelle de 2 à 3,5 bars ; ceci assure qu'il ne se produit pas de tassement ultérieur de l'adsorbant pendant les séparations.
Une diminution soudaine de la pression peut provoquer des craquelures ou des canaux dans le matériau de garnissage, ce qui réduirait de façon importante l'efficacité de la colonne. Il est donc important de laisser la pression descendre lentement jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe.
Volume approximatif des colonnes (Colonnes en verre de Ace, Catégorie No., non garnies) : 5795-04, 12 ml ;
5795-10, 110 ml ; 5795-16, 300 ml ; 5795-24, 635 ml ; et 5796-
34, 34 ml.
Le temps nécessaire pour garnir une colonne en verre
peut varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimension de la colonne et l'expérience de l'opérateur. Etapes :
1. Relier la colonne de verre à une colonne réservoir par un accouplement (le volume de la colonne réservoir doit être
<EMI ID=211.1>
verticalement avec la colonne réservoir au-dessus.
2. Peser le matériau de garnissage (100 g pour 200 ml de colonne) .
3. Ajouter environ 5 volumes de solvant au matériau de garnissage ; utiliser un mélange de 70-80 % de méthanol et de 20-
<EMI ID=212.1>
4. Bien agiter jusqu'à ce que toutes les particules soient mouillées, laisser reposer pendant une nuit ou plus longtemps pour assurer une imprégnation complète des particules par le solvant. Décanter la liqueur surnageante.
Délayer la résine avec suffisamment de solvant pour remplir la colonne réservoir. Verser rapidement dans le réservoir. La colonne: doit être préremplie avec le même solvant et la colonne réservoir doit être partiellement remplie du solvant avant de verser la suspension.
L'utilisation de volumes de suspension plus grands peut également donner de bons résultats ; cependant, ceci nécessite
(a) un réservoir plus grand ou (b) plusieurs remplissages <EMI ID=213.1>
6. Fermer le réservoir avec le bouchon de Teflon en-dessous de la colonne (voir la Figure 1 du brevet des E.U.A.
N[deg.] 4.131.547, bouchon N[deg.] 3) ; relier à la pompe ; et commencer immédiatement le pompage du solvant dans les dispositifs au débit maximum si l'on utilise une pompe Ace Cat. No. 13625-25, ou un système de distribution de solvant similaire (20 ml/minute).
7. Continuer jusqu'à ce que la colonne soit complètement remplie de l'adsorbant. La pression ne doit pas dépasser la tolérance maximale de la colonne pendant cette opération
(14 bars pour les colonnes importantes et 21 bars pour les colonnes analytiques). Dans la plupart des cas, des pressions
inférieures à 14 bars seront suffisantes.
<EMI ID=214.1>
le débit et la pression diminuera.
9. Après remplissage de la colonne par l'adsorbant, arrêter la pompe ; laisser la pression tomber à zéro ; débrancher le réservoir ; remplacer le réservoir par une pré-colonne ; remplir la pré-colonne de solvant et d'une petite quantité d'adsorbant, et pomper à la pression maximale jusqu'à ce que la colonne soit complètement garnie. Pour une information supplémentaire, voir le mode opératoire général. Toujours laisser la pression descendre lentement après arrêt de la pompe ; ceci empêchera la formation de toutes craquelures ou canaux préférentiels dans le matériau de garnissage.
<EMI ID=215.1>
pré-colonne. Avec une petite spatule, enlever quelques millimètres (2-4) de garnissage au sommet de la colonne ;
<EMI ID=216.1> doucement jusqu'au sommet du matériau de garnissage, et placer un bouchon de Teflon au sommet de la colonne jusqu'à
<EMI ID=217.1>
introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par la paroi de verre au sommet de la colonne si la résine se tasse davantage. Si le matériau de garnissage doit continuer � ce déposer (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions importantes), un certain espace mort apparaîtra ou bien, il se formera des canaux préférentiels et l'étape 9 doit être répétée.
Préparation 12
Préparation du noyau de A-30912A
<EMI ID=218.1>
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation J, en utilisant le milieu de
<EMI ID=219.1>
incuber le milieu de production pendant environ 42 heures.
<EMI ID=220.1>
A de A-30912 (340 g de substrat brut qui contient environ
19,7 g de facteur A de A-30912, dissous dans 1,5 1 d'éthanol) . On contrôle la désacylation du facteur A de A-
<EMI ID=221.1>
la fermentation se poursuivre jusqu'à désacylation complète comme le montre la disparition de l'activité vis-à-vis de C. albicans.
B. Séparation du noyau de A-30912A
On filtre le bouillon de fermentation entier (100 litres), obtenu comme décrit dans le paragraphe A et contenant le noyau provenant d'environ 20 g de facteur A de A-30912.
On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu (environ 93 1) sur une colonne contenant 4,5 1 de résine HP (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon) à un débit de 200 ml/minute. On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes (volume de colonne) d'eau désionisée à pli 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol (85 1) à un débit de 200-300 ml/minute.
<EMI ID=222.1>
opératoire suivant : on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une de ces parties jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. Ce produit et l'autre partie non traitée sont testés pour déterminer leur activité vis-â-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912A. On concentre l'éluat contenant le noyau de
<EMI ID=223.1>
liquide sur hase inversée
On dissout 25 g du noyau de A-30912A brut, obtenu
<EMI ID=224.1>
96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne d'acier inoxydable de 4 1 (8 cm x 80 cm) remplie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal,91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumention Specialties Co., 4700 Superior Ave. Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6). On recueille par minute
<EMI ID=225.1>
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912A, on les évapore sous vide et on les lyophilise, ce qui donne 2,6 g du noyau. La quantité de solvant nécessaire pour achever ce mode opératoire de séparation chromatographique varie de 7 à � 1. D. Caractéristiques du noyau de A-30912A <EMI ID=226.1> (b) poids moléculaire : 797,33.
(c) solide amorphe blanc, soluble dans l'eau, le dim�thylformamide, le diméthylsulfoxyde et le méthanol ; insoluble dans le chloroforme, le
<EMI ID=227.1>
(d) Spectre d'absorption infrarouge (pastille de
KBr)
présente des iraximas d'absorption à :
3340 large (OH, liaison hydrogène) ; 2970, 2930 et 289C
<EMI ID=228.1>
1660 et 1625 (plusieurs groupements carbonyle C=O) ; 1510-
1550 ; 1430-1450 (déformation de CH "wag"), 1310-1340 ; 1230-
<EMI ID=229.1>
(e) le titrage électrométrique dans le diméthylformamide aqueux à 66 % indique la présence <EMI ID=230.1>
7,35 (pH initial 7,32) .
(f) durée de rétention en chromatographie liquide <EMI ID=231.1>
les conditions suivantes :
Colonne : 4 x 300 mm
Garniture : gel de silice/C18
Solvant : mélange 1:2:97 d'acétate d'ammonium,
<EMI ID=232.1>
Débit : 3 ml/minute
Pression : 172,5 bars
Détecteur : UV à longueur d'onde variable, à 230 nm
Sensibilité : 0-0,4 A.U.F.S.
Préparation 13
On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de la Préparation 12, mais en utilise comme substrat
<EMI ID=233.1>
Préparation 14
On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie
<EMI ID=234.1>
substrat l'aculéacine A.
Préparation 15
Préparation du noyau de A-30912B
A. Désacylation du facteur B de l'antibiotique A-30912
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans La Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après incubation de la culture pendant environ
48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur B de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.
On contrôle la désacylation du facteur B de A -
30912 par essai sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou de Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'� ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.
<EMI ID=235.1>
On filtre le bouillon de fermentation ainsi obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu
<EMI ID=236.1>
poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu.
Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution selon le mode opératoire suivant : on prélève deux par Lies aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquote? jusqu'à un petit volume et on la traite avec un chlorure décide comme le chlorure
de myristoyle. Ce produit et l'autre partie non traitée sont titrés pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient
<EMI ID=237.1>
noyau de A-30912B sous .vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.
<EMI ID=238.1>
liquide à phase inversée
On dissout le noyau de A-30912B brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe C, dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-
18 rue du Canal, Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-5,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml par minute, en utilisant le même solvant.
On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Mode! UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6).
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912B, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912B purifié.
Préparation 16
On prépare le novau de A-30912B et on le purifie par le procédé de la Préparation 15, mais on utilise comme substrat A-30912B tétrahydrogéné.
Préparation 17
Préparation du noyau de A-30912D
A. Désacylation du facteur D de A-30912
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur D de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.
On contrôle la désacylaticn du facteur D de A-30912 par essai sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou de Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.
B. Séparation du noyau de A-30912D 1
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu
<EMI ID=239.1> mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu sur une colonne contenant de la résine HP-20 (polymère très
<EMI ID=240.1>
Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré
<EMI ID=241.1>
colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant :
<EMI ID=242.1>
On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie non traitée pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912D. L'éluat contenant le noyau
de A-30912D est concentré sous vide jusqu'à un petit volume et lyophilisé pour obtenir le noyau brut.
<EMI ID=243.1>
liquide en phase inversée
On dissout dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine le noyau de A-30912D brut obtenu comme décrit dans le paragraphe C. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon,
16-18 rue du Canal, 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, ce qui donne un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le
<EMI ID=244.1>
un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Spécialités Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6).
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on combine les fractions contenant le noyau de A-30912D, on les évapore
<EMI ID=245.1> A-30912D purifié.
Préparation 18
On prépare le noyau de A-30912D et on le purifie par le procédé de la Préparation 17, mais on utilise comme substrat A-30912D tétrahydrogéné.
Préparation 19
Préparation du noyau de A-30912H
A. Désacylation du facteur H de l'antibiotique A-30912
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur H de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.
On contrôle la décacylation du facteur H de A-30912 par une analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation
<EMI ID=246.1>
<EMI ID=247.1>
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisëe à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. un rejette cette eau de lavage. Fuis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On
<EMI ID=248.1>
on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite avec un chlorure d'acide comme le
<EMI ID=249.1>
Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas
<EMI ID=250.1> la fraction contient le noyau de A-30912H. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-30912H sous vide jusqu'à
un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.
C. Purification du noyau de A-30912H par chromatographie
liquide en phase inversée
On dissout le noyau de A-30912H brut, obtenu
comme décrit dans le paragraphe C, dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne
<EMI ID=251.1>
16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionr
la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant.
<EMI ID=252.1>
<EMI ID=253.1>
Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6).
Préparation 20
On prépare le noyau de A-30912H et on le purifie par le procédé de la Préparation 19 mais on utilise comme substrat A-30912H tétrahydrogéné.
Préparation 21
Préparation du noyau S31794/F-l
A. Désacylation de l'antibiotique S31794/F-1
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de
<EMI ID=254.1>
environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation l'antibiotique S31794/F-1 dissous dans une petite quantité de méthanol.
<EMI ID=255.1>
analyse avec disque de papier vis-à-vis de Candida albicans.
<EMI ID=256.1>
dësacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.
B. Séparation du noyau de S31794/F-1
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien, 01. fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP-2G (polymère
très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu.
On lave ensuite la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour chasser le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la
colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élut ion en utilisant le mode opératoire suivant :
on prélève deux parties aliquotes à partir de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie aliquote non traitée pour déterminer leur activité vis-a-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de S31794/F-1. On concentre l'éluat contenant le noyau de S31794/F-1, sous vide jusqu'à un petit volume, et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.
C. Purification du noyau de S31794/F-1 par chromatographie
liquide en phase inversée
On dissout dans un mélange 96:2:1:1 d'eau,
d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine le noyau de S31794/F-1 brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de
<EMI ID=257.1>
Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon,
16-18 iue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil
de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln. Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6).
<EMI ID=258.1>
les fractions contenant le noyau de S31794/F-1, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de S31794/F-1 purifié.
Préparation 22
Préparation de A-30912A tétrahydrogéné
On dissout le facteur A de A-30912 dans l'éthanol.
On réduit Pt02 dans l'éthanol absolu pour former Pt que l'on
<EMI ID=259.1>
facteur A de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912A tétrahydrogéné.
Préparation 23
<EMI ID=260.1>
On dissout dans l'éthanol le facteur B de A-30912.
<EMI ID=261.1>
platine que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur B de A-30912 par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée
(environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912B tétrahydrogéné.
Préparation 24
<EMI ID=262.1>
On dissout dans de l'éthanol le facteur D de A-30912. On réduit Pt02 dans l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur D de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée
(environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petit" nuantité de t-butanol et on le lyophilise pour
<EMI ID=263.1>
Procuration 25
Préparation de A-30912H tétrahydrogéné
On dissout le facteur H de A-30912 dans de l'éthanol. On réduit Pt02 dans l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur H de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée
(environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel
et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on.le lyophilise pour obtenir A-30912H tétrahydrogéné.
Préparations 26-55
Le Tableau 1 ci-dessous donne la préparation de divers N-alcanoyl-amino-acides. Les composés décrits dans le Tableau 1 sont préparés selon le mode opératoire général suivant :
On ajoute le chlorure d'acide alcanoique approprié goutte à goutte à l'amino-acide approprié (rapport molaire 1:1) dissous dans de la pyridine. La quantité de pyridine utilisée doit être telle que l'on obtienne une concentration des réactifs entre 0,1 et 0,2 M. On agite la solution à la température ambiante pendant environ 3 à 6 heures, après quoi on la verse dans un grand volume d'eau. Le produit précipite de la solution et on le recueille par filtration et on le cristallise dans le méthanol.
<EMI ID=264.1>
<EMI ID=265.1>
<EMI ID=266.1>
<EMI ID=267.1>
<EMI ID=268.1>
<EMI ID=269.1>
<EMI ID=270.1>
<EMI ID=271.1>
<EMI ID=272.1>
<EMI ID=273.1>
Exemples 56-85
Le Tableau 2 ci-dessous donne la préparation des
<EMI ID=274.1>
acides décrits dans le Tableau 1 , Les composés décrits dans le Tableau 2 sont préparés selon le mode opératoire général suivant :
On dissout une mole de N-alcanoylamino-acide,
<EMI ID=275.1>
carbodiimide dans du chlorure de méthylène, de l'éther ou du tétrahydrofuranne. On agite la solution à la température ambiante pendant environ 16 à environ 20 heures, après quoi on la filtre. On amène le filtrat à siccité et on cristallise le produit dans un mélange d'acétonitrile et d'eau ou dans un mélange d'éther diêthyligue et J'éther de pétrole.
<EMI ID=276.1>
<EMI ID=277.1>
<EMI ID=278.1>
<EMI ID=279.1>
<EMI ID=280.1>
<EMI ID=281.1>
<EMI ID=282.1>
<EMI ID=283.1>
<EMI ID=284.1>
<EMI ID=285.1>
EXEMPLES 1 à 30
Le Tableau 3 ci-dessous donne la préparation des dérivés du noyau A-30912A préparée à partir des esters de
<EMI ID=286.1>
indiqués dans le Tableau 2. Les composés décrite dans le Tableau 3 sont préparés en général selon le mode opératoire suivant :
Au noyau 30912A, dissous dans du diméthylformamide
(DMF) on ajoute l'ester 2,4,5-trichlorophénylique du Nalcanoyl-amino-acide. On agite le mélange réactionnel
<EMI ID=287.1>
obtenir un résidu. On lave le résidu (deux fois chaque) avec de l'éther éthylique et du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu restant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et
on le chromatographie sur une colonne de gel de silice
(�'�elm 99-210 microns) en utilisant le système solvant susmentionné comme éluant. On contrôle les fractions provenant du chromatographe, par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 volume/ volume d'acétate d'éthyle et de mêthanol. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on chasse le solvant
<EMI ID=288.1>
analyser le produit par chromatographie liquide sous pression élevée à phase inversée comme suit : on injecte l'échantillon dissous dans un mélange 1:2:2 volume/volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile (1 mg/ml) dans une colonne en acier
<EMI ID=289.1>
Bondapak (Waters Associates, Inc., Milford, Massachussets, U.S.A.) et on élue la colonne avec un système solvant comprenant un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol
et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de
103,5 bars avec: un débit de 3 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600A (Waters Associates, Inc.) et une vitesse: du papier de 0,5 cm/minute. On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV Varian Vari-Chrom à 230 nm.
On peut également analyser les produits par spectrométrie de masse à désorption de champ (FDMS).
<EMI ID=290.1>
<EMI ID=291.1>
<EMI ID=292.1>
<EMI ID=293.1>
<EMI ID=294.1>
<EMI ID=295.1>
<EMI ID=296.1>
<EMI ID=297.1>
<EMI ID=298.1>
<EMI ID=299.1>
<EMI ID=300.1>
<EMI ID=301.1>
EXEMPLES 31-40
Les Exemples 31-40 illustrent la préparation à plus grande échelle des composés de formule III. Les composés particuliers préparés par les modes opératoires indiqués ci-
<EMI ID=302.1>
<EMI ID=303.1>
On ajoute goutte à goutte 8,74 g (40 mmoles) de
<EMI ID=304.1>
benzoïque (5,5 g, 40 mmoles) dissous dans 100 ml de pyridine.
On agite le mélange pendant trois heures et on le verse dans 3 1 d'eau. On filtre le précipité qui se forme et on le sèche
<EMI ID=305.1>
benzoïque (11,01 g).
<EMI ID=306.1>
mmoles) de tricyclohexylcarbodiimide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 3 heures et demie puis on le filtre. On évapore le filtrat sous vide pour obtenir un résida qu'on cristallise dans un mélange d'acétonitrile et d'eau
<EMI ID=307.1>
p-aminobenzoïque. On agite la solution 3 la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide
<EMI ID=308.1>
<EMI ID=309.1>
résidu lave dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE à phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500"
(Waters Associates, Inc., Milford, Mass.) en utilisant une
<EMI ID=310.1> <EMI ID=311.1>
un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acêtonitrile à 34,5 bars. Les fractions sont analysées par CCM
en utilisant des plaques de silice et le même système solvant.
Les fractions contenant le produit désiré sont réunies et lyophilisées pour obtenir le dérivé à groupement N-(n-
<EMI ID=312.1>
EXEMPLE 32
Acylatic-: du noyau de A-30912B
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide 10,2 rnmoles du noyau de A-30912B et 10,2 mmoles de l'ester de
<EMI ID=313.1>
aminobenzoïque (préparé dans les Etapes A et B de l'Exemple
31). On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu
qu'on lave deux fois avec de l'éther ùiéthylique. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE à phase inversée en utilisant une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associates, Inc., Milford, Massachussets) en utilisant une colonne Prep
<EMI ID=314.1>
On analyse les fractions par CCM en utilisant des plaques de gel de silice et le même système solvant. On réunit et on lyophilise les fractions contenant le produit désiré pour obtenir le dérivé à groupement N-(n-dodécanoyl)p-aminobenzoyle du noyau de A-30912B.
EXEMPLE 33
On peut utiliser le procédé décrit dans l'Exemple
32, avec des modifications mineures, pour synthétiser d'autres dérivés du noyau de A-30912B. La substitution du chlorure d'acyle approprié et de l'acide ar'no approprié dans l'Etape A, la substitution du N-alcanoyl-amino-acide approprié (plus
<EMI ID=315.1>
et la substitution de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique approprié dans l'Exemple 33 peut donner les dérivés du noyau de A-30912B indiqué ci-dessous :
<EMI ID=316.1>
<EMI ID=317.1>
<EMI ID=318.1>
<EMI ID=319.1>
<EMI ID=320.1>
EXEMPLE 34
Acylation du noyau de A-30912D
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide, 10,2
<EMI ID=321.1>
benzoïque (préparé dans les Etapes A et B de l'Exemple 31).
On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'ôther diéthylique. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE à phase inversée en utilisant une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associates, Inc., Milford, Massachussets) en utilisant une colonne Prep
<EMI ID=322.1>
la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en
volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM en utilisant des plaques de gel de silice et le même système solvant. On combine et on lyophilise les fractions contenant le produit désiré pour obtenir le dérivé à groupement N-(n-dodécanoyl)-p-amino-
<EMI ID=323.1>
EXEMPLE 35
On peut utiliser le procédé décrit dans l'Exemple
34, avec de faibles modifications, pour synthétiser d'autres dérivés du noyau de A-30912D. L'utilisation du chlorure d'acyle et de l'amino-acide appropriés dans l'Etape A, l'utilisation du N-alcanoyl-amino-acide approprié (plus
<EMI ID=324.1>
<EMI ID=325.1>
l'utilisation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique approprié
<EMI ID=326.1>
<EMI ID=327.1>
l'Exemple 33.
Dérivés de N-alcanoylamino-acide du noyau de A-30912D
<EMI ID=328.1>
<EMI ID=329.1>
Acylation du noyau de A-30912H
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide
<EMI ID=330.1>
<EMI ID=331.1>
aminobenzoïque (préparé dans les Etapes A et B de l'Exemple
31). On agite la solution à la température ambiante pendant
15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On
<EMI ID=332.1>
Associates, Inc.) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM en utilisant des plaques de gel de silice et le même système solvant. On réunit les fractions contenant le produit désire et on les lyophilise pour obtenir le dérivé <EMI ID=333.1>
A-30912H.
EXEMPLE 37
<EMI ID=334.1>
<EMI ID=335.1>
d'autres dérivés du noyau de A-30912H. L'utilisation du chlorure d'acyle et de l'amino-acide appropriés dans l'Etape
<EMI ID=336.1>
acides N-alcanoyl monochloro-aminobenzoïques) dans l'Etape B, et l'utilisation de l'ester 2,4,5-trichlorophënylique approprié dans l'Exemple 36 permettent d'obtenir les dérivés du noyau de A-30912H indiqués ci-dessous où R est tel que défini dans l'Exemple 33.
Dérivés de N-alcanoylamino-acide du noyau de A-30912H
<EMI ID=337.1>
EXEMPLE 38
Le mode opératoire suivant illustre la préparation
<EMI ID=338.1>
A-30912H à partir du noyau de A-3C912A.
<EMI ID=339.1>
<EMI ID=340.1> le mode opératoire de l'Exemple 36. On méthyle le dérivé
<EMI ID=341.1>
<EMI ID=342.1>
laisse la solution reposer sous agitation pendant 16 heures, après quoi on chasse le solvant sous pression réduite et
on obtient un résidu. On purifie le résidu par CLPE à phase
<EMI ID=343.1>
EXEMPLE 39
Acylation du noyau de S31794/F-1
On dissout dans 100 ml de diméthylformamide 10,2
<EMI ID=344.1>
aminobenzoïque (préparé dans les Etapes A et B de l'Exemple
31). On agite la solution à la température ambiante pendant
15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un
résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique.
On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE à phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associâtes, Inc.), en utilisant une colonne Prep Pak-500/
<EMI ID=345.1>
colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en
<EMI ID=346.1>
les fractions par CCM en utilisant des plaques de gel de silice et le même système solvant. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir
<EMI ID=347.1>
noyau de S31794/F-1.
EXEMPLE 40
On peut utiliser le procédé décrit dans l'Exemple
39 avec de petites modifications pour synthétiser d'autres dérivés du noyau de S31794/F-1. L'utilisation du chlorure d'acyle et de l'amino-acide approprié dans l'Etape A, l'utilisation du N-alcanoylamino-acide approprié (plus l'utilisation du tétrahydrofuranne comme solvant pour les acides N-alcanoyl-monochloro-aminobenzoïques) dans l'Etape
<EMI ID=348.1>
dans l'exemple 39 permettent d'obtenir les dérivés du noyau <EMI ID=349.1>
dans l'Exemple 33.
<EMI ID=350.1>
<EMI ID=351.1>
EXEMPLE 41
On peut démontrer in vitro l'activité antifongique des composés de formule III dans des essais de diffusion sur disque et de dilution sur gélose classiques et dans des essais in vivo classiques sur des souris qui démontrent l'efficacité vis-à-vis d'une infection fongique systémique. Les résultats des essais antifongiques de composés représentatifs de formule V (Exemples 1 à 30) sont indiqués dans les Tableaux 4, 5, 6 et 7.
Les Tableaux 4 et 5 donnent les résultats des essais in vitro des composés des Exemples 1 à 21 parles méthodes de diffusion sur disque sur plaque de gélose. Dans le Tableau 4, l'activité est mesurée par la taille
(diamètre en mm) de la zone d'inhibition du micro-organisme observée produite par le composé d'essai- Dans le Tableau 5, l'activité est mesurée par la concentration inhibitrice
<EMI ID=352.1>
inhiber la croissance de l'organisme d'essai. Le Tableau 6 ts
donne les résultats de l'essai in vitro du dérivé à
<EMI ID=353.1>
albicans, par la méthode de dilution sur gélose. Dans le
<EMI ID=354.1>
substance (pg/ml) nécessaire pour inh.iber l'organisme d'essai.
Les résultats des essais in vivo pour déterminer
l'efficacité des composés des Exemples 1 à 21,, 26 et 28 contre une infection provoquée par Candida albicans A-26
chez les souris sont donnés dans le Tableau 7, où l'activité est mesurée par la DE 50 (dose en mg/kg nécessaire pour guérir
50 % des animaux d'essai). Quand on n'observe pas de DE,-0/ l'activité est indiquée par la plus faible dose à laquelle
on observe un effet antifongique significatif. Dans cet essai, on infecte par voie intraveineuse par Candida albicans A-26 des groupes de souris albinos mâles (exemptes d'agents pathogènes particuliers) pesant de 18 à 20 g. On traite les animaux par rayons X 24 heures avanL l'infection à environ 50 roentgens par minute pendant huit minutes (dose totale
de 400) pour réduire les réponses immunologiques vis-à-vis
de l'organisme infectieux. A 0, 4 et 24 heures après l'infection, on donne à chaque groupe de souris des doses progressives sous-cutanées du composé d'essai sous forme d'une
<EMI ID=355.1>
d'eau. On note le jour de la mort pour chaque animal. Une comparaison statistique de l'essai "t" de Student du jour moyen de la mort est faite entre chaque groupe des animaux traités et infectés particuliers et d'un groupe de dix animaux infectés et non traités pour déterminer si le traitement prolonge de façon significative le temps de survie.
Le Tableau 8 donne les résultats de l'essai des composés pour l'absorption après administration par voie orale. Dans cet essai, des souris sont gavées à une dose de
416 mg/kg du composé d'essai en suspension dans un mélange à
<EMI ID=356.1>
prélève des échantillons de sang du sinus orbital et on détermine leur activité antibiotique comme suit : on place un <EMI ID=357.1>
ensemencée avec Aspergillus montevidensis A35137. Après 40 heures d'incubation à 30[deg.]C, on compare les zones d'inhibition provenant des échantillons sanguins à un étalon obtenu à partir du composé d'essai, et on calcule la quantité de composé dans l'échantillon de sang.
<EMI ID=358.1>
<EMI ID=359.1>
<EMI ID=360.1>
<EMI ID=361.1>
<EMI ID=362.1>
<EMI ID=363.1>
<EMI ID=364.1>
<EMI ID=365.1>
<EMI ID=366.1>
<EMI ID=367.1>
<EMI ID=368.1>
<EMI ID=369.1>
<EMI ID=370.1>
<EMI ID=371.1>
<EMI ID=372.1>
<EMI ID=373.1>
TABLEAU 6
Activité in vitro des dérivés à groupement N-(n-
<EMI ID=374.1>
N-(n-dodécanoyl)-5-amino-n-pentanoyle (Exemple 2) du noyau de A-30912A vis-à-vis de cinq souches de Candida albicans par l'essai de dilution sur gélose.
CIM (�q/ml)
<EMI ID=375.1>
<EMI ID=376.1>
<EMI ID=377.1>
<EMI ID=378.1>
<EMI ID=379.1>
<EMI ID=380.1>
<EMI ID=381.1>
<EMI ID=382.1>
<EMI ID=383.1>
<EMI ID=384.1>
<EMI ID=385.1>
<EMI ID=386.1>
<EMI ID=387.1>
<EMI ID=388.1>
<EMI ID=389.1>
<EMI ID=390.1>
<EMI ID=391.1>
<EMI ID=392.1>
<EMI ID=393.1>