JPH06157594A - ある種のシクロヘキサペプチドのリン酸エステル化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 シクロヘキサペプチドのリン酸エステル化合
物の簡易な製造方法を提供する。 【構成】 式 （式中、ＲはＣ_１３−Ｃ_１７アルキル、Ｃ_１３−Ｃ_１７
アルケニル、Ｃ_１３−Ｃ_１７アルキニル、フェニル、及
びＣ_１−Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ
_１−Ｃ_１０アルキルチオ又はＣ_１−Ｃ_１０アルキルアミ
ノで置換したフェニル；Ｒ_１，Ｒ_２，Ｒ_３及びＲ_４はそ
れぞれＨ又はＯＨ；ＸはＨ，ＯＨ又はＣＨ_３；Ｘ^１はＨ
又はＯＨ；ＹはＨ又はＣＨ_３；ＺはＨ又は−ＣＯＮ
Ｈ_２；ただしＸとＸ^１の少なくとも一方はＯＨであ
る。）の化合物を、水酸化リチウムの存在下に、対応す
るフェノール化合物を約−１３〜−１７℃、ＬｉＯＨ存
在下にテトラベンジルピロホスフェートと混合して得ら
れたジベンジルホスフェートをＰｄ／Ｃ上で水素化分解
して製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ある種のシクロヘキサペプチド
のリン酸エステル化合物を直接リン酸化して製造する簡
易な方法を目的とする。

【０００２】化合物ＩＡは、同時係属出願第０７／４９
５，１９９号に記述され請求されているものであり、構
造式（ＩＡ）

【化９】 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有しており、後述するよ
うに、ある種の真菌の抑制、また同様に寄生性ニューモ
シスチス・カリニ（Pneumocystis carinii) の抑制に有
用な、天然物のリン酸化誘導体である。

【０００３】化合物Ｉを誘導するこの天然物は、一定条
件下にザレリオン アルボリコラ（Zalerion arboricol
a ）ＡＴＣＣ２０９５７を培養することによって生産さ
れ、構造式（Ａ）

【化１０】 （以後化合物Ａとよぶ。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で表
わすことができる。化合物Ａは、シクロペプチドのオル
ニチン部分の５位に塩基反応性の水酸基を持っているた
めに、通常の好ましいエステル形成方法の際には、前も
って５位の水酸基をベンジルエステルを形成して保護し
た後に他の部分の反応を行なう。したがって構造式（Ｉ
Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の化合物は、ベンジル
エステル（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を製造した後、リ
ン酸化を行なってジベンジルホスフェート（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１）を形成し、その後、そのホスフェートか
らベンジル基を除去するために水素化分解して製造して
いた。これは以下のような反応手順に従がっていた。

【化１１】

【０００４】本発明によれば、後述するような置換基を
有し、化合物Ａもその一種であるところの、構造式

【化１２】 を有する化合物Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１−１７）
を、オルニチンの５位を保護する必要なしに直接にリン
酸化してジベンジルホスフェートを得、さらにこれを水
素化分解して構造式

【化１３】 を有するリン酸エステル（Ｉ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
Ｓ：１−１７）を得、および出発物質が化合物Ａの場合
には、化合物ＩＡを得ることができるということがわか
った。構造式ＩとＸにおいて、置換基は以下のように定
義される。ＲはＣ₁₃−Ｃ₁₇アルキル、Ｃ₁₃−Ｃ₁₇アルケ
ニル、Ｃ₁₃−Ｃ₁₇アルキニル、フェニル、及びＣ₁ −Ｃ
₁₀アルキル、Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルコキシ、Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキ
ルチオ又はＣ₁ −Ｃ₁₀アルキルアミノで置換したフェニ
ルであり、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 及びＲ₄ はそれぞれＨ又は
ＯＨであり、ＸはＨ、ＯＨ又はＣＨ₃ であり、Ｘ¹ はＨ
又はＯＨであり、ＹはＨ又はＣＨ₃ であり、ＺはＨ又は
−CONH₂ であり、ただしＸとＸ¹ の少なくとも一方はＯ
Ｈである。

【０００５】また、結晶性カリウム塩として化合物Ｉを
単離して、これを他の塩に変換できる方法が説明され
る。塩の形態の化合物ＩＡは構造式（ＩＢ）

【化１４】 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で表わすことができるが、
式中Ｍはカチオンを形成する塩の基である。

【０００６】「カチオンを形成する塩の基」とは、カリ
ウム、ナトリウム、ルビジウム、セシウム、リチウム、
マグネシウム、カルシウム、アンモニウム及び第４アン
モニウムの基を意味する。

【０００７】簡易に化合物Ｉ又はＩＡを製造する本発明
の方法は、（１）化合物Ｘ又はＡを、水酸化リチウムの
存在下にテトラベンジルピロホスフェートと十分に混合
して、ジベンジルホスフェートエステルを得ること、及
び（２）炭素上のパラジウムを用いた水素化分解によっ
て脱ベンジル化することから成る。

【０００８】本発明の方法の第１の工程は、水酸化リチ
ウムの存在下に化合物Ａをテトラベンジルピロホスフェ
ートと十分に混合して、化合物Ａのジベンジルホスフェ
ートを得ることである。反応は固体の水酸化リチウムを
用いて行なってもよいが、本発明の最も簡易な方法で
は、反応時にすべての反応物が溶液として存在するよう
にして反応を行なう。

【０００９】他の反応物を加える前にリン酸化剤を含み
かつ溶解している溶媒系に、化合物Ａを固体のまま加え
てもよい。

【００１０】テトラベンジルピロホスフェートは、リン
酸化剤である。他の活性化されたリン酸化剤を用いても
よいが、これが好ましいリン酸化剤である。テトラベン
ジルピロホスフェートは、既知の方法で前もって製造し
てもよいが、しかし、後述する方法全体のうちのある工
程で用いる直前に製造するのが好ましい。

【００１１】水酸化リチウムは、好ましくは２Ｍの水性
溶液として用いるが、１．０ないし２．５Ｍで用いても
よい。加える水酸化リチウムの量は、慎重に調整しなけ
ればならない。量がほぼ当量、最適には１．０５当量で
あることが重要である。水酸化リチウムが過剰である
と、塩基が触媒する分解のためにかなり生成物が減る結
果となる。少なすぎると反応が完全に行なわれなくなっ
てしまうが、細かくＨＰＬＣでモニターしながらごく慎
重に塩基を加えることでこれを解決することができる。

【００１２】リン酸化に用いる反応媒質は、好ましく
は、反応物の溶媒であり水性塩基と混和できるジメチル
ホルムアミドである。ジメチルホルムアミドの純度は、
アッセイにおいて水＜５０μｇ／ml及びジメチルアミン
＜１００μｇ／mlでなければならない。

【００１３】反応を行なう温度は重要である。これは−
１５℃付近、すなわち−１３°ないし−１７℃の範囲外
であってはならない。温度が−１０℃まで上昇すると、
収率は２．５％減少し、０℃まで上昇すると収率は５％
減少する。

【００１４】以後、リン酸化反応については、簡単のた
めに、出発物質を化合物Ａとして説明するが、この方法
はＺを出発物質として用いても適用できると考えるべき
である。

【００１５】リン酸化反応は、化合物Ａ（１当量）を、
１．１５当量のテトラベンジルピロホスフェート及び化
合物Ａの１グラム当り６ミリリットルとなるように加え
た十分な余分のジメチルホルムアミドを含んだよく攪拌
したジメチルホルムアミド溶液に加えて行なう。化合物
Ａが完全に溶解した後、溶液を−１５℃まで冷却する。
水酸化リチウムの（直前に滴定した）水溶液を、内部温
度を−１５℃に保つような速度で加える。加え終わった
ら、反応が完了して（ＨＰＬＣで決定する）化合物Ａの
ジベンジルホスフェートが形成するまで、混合物を１〜
３時間−１５℃に置く。

【００１６】好ましい方法では、テトラベンジルピロホ
スフェートを最初の工程で調製して、単離せずに溶液中
に保つようにする。この物質は、ジクロロヘキシルカル
ボジイミドでジベンジルリン酸を脱水した後、ジシクロ
ヘキシル尿素の副生物から分離して製造する。

【００１７】ジベンジルリン酸が高純度であることは重
要である。この純度は、テトラベンジルピロホスフェー
トの収率、純度及び安定性に大きく影響する。ジベンジ
ルリン酸の純度は、滴定、ＨＰＬＣ及びＮＭＲでの決定
によって約９８〜９９パーセントでなければならない。

【００１８】テトラベンジルピロホスフェートをただち
に用いない場合には、水分をふせいで保存する必要があ
る。テトラベンジルピロホスフェートの溶液の安定性
は、溶媒と溶媒の含水量に左右される。酢酸エチル、ジ
メチルホルムアミド及びｔ−ブチルメチルエーテル等の
溶媒中では、テトラベンジルピロホスフェートは、どん
なに含水量が少なくとも１日あたり約１パーセントの割
合で分解し、含水量が＞１００μｇ／mlではより速く分
解する。しかし含水量＜１００μｇ／mlの０℃のテトラ
ヒドロフラン中では、損失は１週間あたり＜０．５パー
セントである。したがって、テトラベンジルピロホスフ
ェートの調製は、テトラヒドロフラン中で行なう。ただ
し、テトラヒドロフランの含水量は５０μｇ／ml以下で
なければならない。

【００１９】テトラベンジルピロホスフェートの製造に
は、２モルのジベンジルリン酸に対して約１．０５モル
のジシクロヘキシルカルボジイミドを用いる。

【００２０】テトラベンジルピロホスフェートの製造を
行なう際には、ジシクロヘキシルカルボジイミドのテト
ラヒドロフラン溶液を、２０〜２５℃のジベンジルリン
酸のテトラヒドロフラン溶液に加えて、混合物をこの温
度のまま、テトラベンジルピロホスフェートとそのジシ
クロヘキシル尿素副生物が形成されて反応が完了するま
で、１〜３時間攪拌する。副生物を濾過して取り除い
て、得られたテトラベンジルピロホスフェート溶液を水
分をさけて０℃に保存する。

【００２１】テトラベンジルピロホスフェートの製造に
用いる溶媒はテトラヒドロフランであるが、リン酸化反
応に好ましい溶媒はジメチルホルムアミドである。した
がって、リン酸化の工程を行なう準備ができたならば、
まず溶媒の交換を行なう。この交換のために、テトラベ
ンジルピロホスフェート溶液を、ジメチルホルムアミド
（含水量＜５０mg／ml、ジメチルアミン＜１００mg／m
l）で希釈して、テトラベンジルピロホスフェートの不
均化を最小限にするために温度を３０℃以下に保ったま
ま、テトラヒドロフランを減圧下（１００mb) に除去す
る。加えるジメチルホルムアミドの量は、リン酸化反応
に用いる理論値の５０パーセント未満でなければならな
い。この工程に用いる前に、ジメチルホルムアミド溶媒
を１３Ｘモレキュラシーブで乾燥させて水とジメチルア
ミンを除去する。

【００２２】次に、リン酸化反応で得られる化合物Ａの
ジベンジルホスフェートを水素化して、ベンジル基を取
り除く。リン酸化において反応混合物はジメチルホルム
アミド中にある。水素化するための望ましい溶媒はエタ
ノール／水である。ジベンジルホスフェートを、溶媒を
除去して回収した後、このホスフェートをエタノール／
水に溶解してもよいが、本発明の方法では、ジベンジル
ホスフェートを単離せずに水素化のために調製できる。
これは、まず溶媒を転換して行なうことができる。

【００２３】溶媒転換は以下のように行なう。まずリン
酸化反応混合物を酸性にして水酸化リチウムを中和させ
た後、反応混合物を５０：５０（ｖ／ｖ）エタノール／
水で希釈して、希釈溶液を官能基化していない樹脂カラ
ムに通すが、このとき、ジベンジルホスフェートエステ
ルは樹脂に強力に吸着する。次に、カラムを５０：５０
エタノール／水で洗浄してジメチルホルムアミドと副生
物のリチウムジベンジルホスフェートを除去し、最後に
ジベンジルホスフェートエステルを９０：１０エタノー
ル／水で希釈する。その後、この溶液をそのまま水素化
分解（脱ベンゼン化）工程に用いる。ジメチルホルムア
ミドは大量の過剰な５０：５０エタノール／水に入れて
希釈する。約１０倍量が適当である。ジメチルホルムア
ミド溶液をエタノール／水に希釈することが非常に重要
である。これを逆にすると、ゴム状の物質が生ずる。ま
た、いったん溶液を希釈したならば、カラムに保持した
いエステルが加水分解しないようにできる限りすばやく
カラムにかけるのが大切である。

【００２４】溶媒の転換に用いる適当な樹脂には、AMBE
RCHROM CG −１６１md（５０〜１００μｍ）とAMBERCHR
OM CG −１６１cd（８０〜１６０μｍ）が含まれる。
（AMBERCHROMは Rohm & Haasの登録商標であり、Toso H
aas より入手できるジビニルベンゼンポリスチレン樹脂
である）。他の官能基化していない樹脂を用いてもよ
い。「官能基化していない樹脂」とは、官能基を持たな
い吸着樹脂を意味する。したがって、他のジビニルベン
ゼン−スチレンコポリマー型のカラム樹脂も適当であ
る。使用前に、樹脂を調製する必要がある。樹脂の調製
と再生は後述する。

【００２５】ジベンジルホスフェートエステルを含む溶
出した画分を触媒で還元する。炭素上のパラジウムが好
ましい還元用触媒である。水素雰囲気下に約２．５〜
３．５気圧、好ましくは３気圧の圧力が適当であり、酸
の形態の所望の化合物Ｉを得るためのPd／Ｃのローディ
ングによって時間を変えて行なう。還元が完了した後、
濾過して触媒を除去し、ただちに単離しない場合は、酸
生成物の溶液を−１０℃に保つ。

【００２６】遊離酸を従来の方法で単離できるが、好ま
しくは、水素化分解後の濾過溶液から一塩に直接変換す
る。いろいろなアルカリ金属、又はカルシウム、マグネ
シウム、アンモニウムあるいは第４アンモニウムの塩を
このようにして作ることができるが、直接の変換によっ
て結晶の形態で最も確実に得ることができるのは一カリ
ウム塩であることがわかっており、したがってこれが単
離のために酸を変換する好ましい塩である。

【００２７】一カリウム塩への直接の変換方法は、濾液
に水を加えて、２０〜２５℃で正確に１当量の１．０Ｍ
水性水酸化カリウムを慎重に加えて行なう。加える水の
量は、中和完了時の全含水量が２０パーセントとなるよ
うにする。次に混合物を５０〜６０℃に加熱して、結晶
種を入れて、水分が１３〜１５パーセントになるまでゆ
っくりとエタノールを加えて、得られた混合物を約５０
〜６０℃に約１時間置いた後、１２〜１８時間にわたっ
てゆっくりと２０〜２５℃まで冷却して結晶を形成す
る。この粗精製結晶性物質を濾過して回収する。

【００２８】次に粗精製固体を「ホットスウィッシュ
（hot-swish)」（温洗浄）又は再結晶の方法で精製す
る。「ホットスウィッシュ」方法は、粗精製固体を、固
体１グラムあたり約１０mlの８０：２０（ｖ／ｖ）エタ
ノール／水に溶解し、混合物を５０〜６０℃に加熱し
て、この温度で１〜３時間攪拌した後、１２ないし１８
時間にわたってゆっくりと２０〜２５℃に冷却して精製
結晶を得る。

【００２９】別の方法としては、粗精製固体を、固体１
グラムあたり約１２mlの約７５〜７８℃の５０：５０
（ｖ／ｖ）エタノール／水に溶解した後、無水エタノー
ルを０．５ないし１．０時間にわたって加えることによ
り、粗精製結晶を再結晶してもよい。生成物１グラムあ
たり約１８ミリリットルの溶媒で十分である。次に混合
物を７０〜７５℃まで多少冷却して結晶種を加えた後、
１２ないし１８時間にわたってゆっくりと２０〜２５℃
に冷却して精製した結晶性一カリウム塩生成物を得る。

【００３０】どちらの方法で精製した生成物も、濾過し
て単離し、湿潤したケーキは、８５：１５エタノール／
水、９０：１０エタノール水、１００パーセントエタノ
ール、さらにヘキサンで順次洗浄する。窒素又は乾燥し
た空気流を１２ないし４８時間、２０〜２５℃でケーキ
に通じて生成物を乾燥する。この乾燥過程は、エタノー
ル含有量を＜０．５重量パーセントに減らすために必要
である。常温での減圧乾燥ではエタノールを十分に除去
できないし、高温では分解を引き起す。単離後、生成物
を＜−２０℃に保存する。

【００３１】他の塩が得たい場合、別の方法として、一
カリウム塩を以下の一般的方法で他の塩に変換できる
が、この場合、水、８０：２０水／エタノール又は８
０：２０水／アセトニトリル中の一カリウム塩を、好ま
しくは AMBERCHROM １６１である樹脂カラムに吸着す
る。次にカラムをベッドの２倍量の０．１Ｍ′H₂PO₄ 水
溶液、又は８０：２０水／エタノールで洗浄するが、こ
こにＭ′は所望のカチオンである。必要ならば、この溶
液のpHを４．５に調製する。次にカラムをベッドの２倍
量の水又は８０：２０水／エタノールで洗浄して過剰な
塩を除去する。一カチオン塩である生成物を２０：８０
水／エタノールでカラムから溶出する。生成物を多く含
む画分をひとつまとめて減圧下に濃縮する。残留水分は
エタノールを用いた共沸蒸留か凍結乾燥のいずれかで除
去することができる。カチオンによっては、塩を結晶化
して精製してもよい。当業者に知られる他の変換又は単
離方法を用いてもよい。以下の実施例はこの発明を説明
するものではあっても制限するものと考えてはならな
い。

【００３２】実施例Ｉ

【化１５】 テトラベンジルピロホスフェートの調製 窒素導入口、オーバーヘッドスターラー、テフロン加工
熱電対プローブ及び圧力を均一化するための補助漏斗を
とりつけたフラスコに３５０mlの無水（含水量５０μｇ
／ml以下）の過酸化物のないテトラヒドロフランを入れ
て、さらに５０．０ｇ（１７４mmol）のジベンジルリン
酸（ＤＢＰ）を入れて、得られた混合物を固体が溶解す
るまで（約１０〜１５分間）攪拌した。２１５mlＴＨＦ
中の１８．９ｇ（９１．６mmol）のジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（ＤＣＣ）の溶液を、補助漏斗から、温度
を約２０〜２５℃に保つような速さで、攪拌して冷却し
た（水浴）ＤＢＰに加えた。反応はわずかに発熱性であ
り、この添加に約３０分かかった。数分以内に、混合物
中にジシクロヘキシル尿素の沈澱が形成した。攪拌を２
０〜２５℃で約２時間つづけた。反応は溶出液に水
（０．０２Ｍ KH₂PO₄）アセトニトリルを用いたＶＹＤ
ＡＣ Ｃ−１８（３００Ａ ４．６×２５０mm）を使っ
てＨＰＬＣアッセイでモニターした。反応は約１時間で
完了した（アッセイでは反応していないＤＢＰが＜２パ
ーセントであった）。次に混合物を濾過して、ジシクロ
ヘキシル尿素を除去するために水分を除外した。濾過ケ
ーキを２５mlのＴＨＦで２回洗浄した。ＨＰＬＣでアッ
セイすると、溶液は、６２０mlのＴＨＦ（０．１３７
Ｍ）中にテトラベンジルピロホスフェート（tetrabenzy
l pyrophosphate 、ＴＢＰＰ）４５．９ｇ（９８％）の
収量を示した。その後、濾液は、次の工程まで水分をさ
けて０℃に保存した。

【００３３】リン酸化 窒素導入口、オーバーヘッド・スターラー、及びテフロ
ン加工熱電対プローブをとりつけたフラスコに、０．１
２７Ｍ ＴＢＰＰ溶液（４０．１mmol）２９３mlと乾燥
した（１３ｘモレキュラシーブで処理）ＤＭＦ１２０ml
を入れた。次に混合物を２５℃で減圧下（１００mb）で
体積約１４０mlまで濃縮した。セパレートベッセル内で
４０ｇの（７．１％の水分を考えると３７．２ｇ、３
４．９mmol）の化合物Ａを、数回にわけて１２０mlのＤ
ＭＦに加えた。得られた混合物をすべての固体が溶解す
るまで室温で攪拌した。この化合物Ａの溶液をＴＢＰＰ
溶液に加えて、混合物を−１５℃に冷却した。１．９６
Ｍ水酸化リチウム１８．７ml（３６．６mmol）を０．５
〜１時間にわたってよく攪拌しながら反応混合物に滴下
した。加える速さと外からの冷却は、内部温度を−１５
℃に保つように調節した。加え終わってから、混合物を
−１５℃で３時間攪拌した。反応の進行を１：１アセト
ニトリル／水（０．０２Ｍ KH₂PO₄）を用いたＺＯＲＢ
ＡＸＣ８（Dupont) カラム（４．６×２５０mm）を使っ
たＨＰＬＣによってモニターしてもよい。反応が完了し
た後、溶液を室温にまで放置する。同様なアッセイ方法
を用いると、収量は３９．１ｇとなった。

【００３４】溶媒の交換 Ａ．樹脂カラムの調製 １００ｇの AMBERCHROM CG−１６１（メディウム直径）
を、おだやかに振とうした８０：２０（ｖ／ｖ）アセト
ン／水溶液に加えて、混合物を室温で４〜１２時間おだ
やかに攪拌した。混合物を４．３×３０cmの調節可能な
ベッドカラムにスラリー詰めした。次に樹脂をアセトン
で洗浄した。洗浄は、低分子芳香族物質が溶出液中に検
出されなくなるまでつづけた。（溶出液の分析には、Ｄ
Ｂ−１（Ｊ＆Ｗ Associates) カラムを使ったキャピラ
リーガスクロマトグラフィーアッセイを用いた。）その
後、カラムを１００％エタノール１．５リットルで２０
ml／分の割合で洗浄し、その後５０：５０（ｖ／ｖ）エ
タノール／水１．５リットルで洗浄した。

【００３５】Ｂ．溶媒の取り換え ９．７グラム（１６２mmol）の酢酸を、化合物Ｂ（アッ
セイによると３８．５ｇ、２９．１mmol）を含む２０〜
２５℃のリン酸化混合物３３０mlに加えた。混合物を１
５分間攪拌した後、よく振とうしながら５０：５０（ｖ
／ｖ）エタノール／水２．６リットルに入れて希釈し
た。希釈したリン酸化反応混合物を流速２０ml／分で A
MBERCHROM 樹脂カラムにかけて、１４０mlの画分を回収
した。カラムは、４５：５５水（０．０２Ｍ KH₂PO₄）
／アセトニトリルを用いたＺＯＲＢＡＸ Ｃ８カラムを
使って、２１０nmで検出してＨＰＬＣアッセイでモニタ
ーした。次にカラムを約１．５リットルの５０：５０
（ｖ／ｖ）エタノール／水で洗浄してジメチルホルムア
ミドとジベンジルホスフェートを除去した。その後、化
合物Ｂを流速２０ml／分の９０：１０（ｖ／ｖ）エタノ
ール／水１．５リットルで溶出して、１４０mlの画分を
回収した。３ｇ／リットル以上を含んでいると決定した
画分を集めると、収量は３８．５ｇとなった。この溶液
を水素化分解するまでの間０℃に保存した。

【００３６】水素化分解 窒素雰囲気下に、２．４ｇ（５重量パーセント）のPd／
Ｃを、前もって窒素でパージした容器内の３８．５ｇ
（２９．１mol)の化合物Ｂを含む約９０：１０エタノー
ル／水溶液７７５mlに加えた。混合物を、予想される水
素の取り込みが完了するまで、約２時間２０〜２５℃で
４０psi で水素化する。反応が完了したら、容器を開口
して窒素を入れる。反応混合物を前もって洗浄した（９
０：１０エタノール／水）ＳＯＬＫＡ−ＦＬＯＣ（セル
ロースをベースにした濾過用具、James River Corp. Vi
rginia) のパッドを通して濾過して、濾過したケークを
２回２５mlの９０：１０エタノール／水で洗浄した。溶
液を酸生成物に関してＨＰＬＣと滴定の両方でアッセイ
した。収量は３２．２ｇとわかった。

【００３７】中和／結晶化 前記と同様に行なう一連の反応で得られる化合物ＩＡを
単離して精製し、以下のように結晶性塩とした：遊離酸
として５８．５mmolの化合物ＩＡを含む濾過した水素化
混合物１．６７リットルと２００mlの水の溶液を攪拌し
て、そこに２０〜２５℃の１０９mlの水を加えて、混合
物の水分を２０％にした。攪拌をつづけながら、１Ｍ水
酸化カリウム水溶液５８．５mlを、１時間にわたって滴
下すると、一カリウム塩が結晶しはじめた。補助的漏斗
を２０mlのエタノールで２回洗浄して、エタノールは混
合物とあわせる。攪拌した混合物を６０〜６５℃にあた
ためて、内部温度を６０〜６５℃に保ったまま０．５時
間にわたって５９２mlのエタノールを滴下した。次に混
合物を０．５〜１時間６０〜６５℃で攪拌した後、１５
時間かけて２０〜２５℃まで冷却する。生成物を濾過し
て単離し、ケーキを８５：１５（ｖ／ｖ）エタノール／
水１００mlで３回、９０：１０（ｖ／ｖ）エタノール／
水１００mlで１回、無水エタノール１００mlで２回、最
後にヘキサン１５０mlで３回順次洗浄した。洗浄終了
後、窒素流をケーキに１５時間通じて生成物を乾燥させ
て６０．３ｇ（水分の補正なし）の所望の生成物を得
た。生成物の純度は９３％だった。

【００３８】再結晶化 ６１ｇの結晶化した化合物Ｉの一カリウム塩を、３６６
mlの水と３６６mlのエタノールの混合物に加えて、混合
物をすべての固体が溶解するまで７５〜７８℃に加熱し
た。この温度に保ったまま、次に、無水エタノール１０
９８mlを１時間かけてしだいに加えた。加え終わった
後、溶液の温度を７０〜７５℃に下げて、さらに化合物
Ｉの一カリウム塩を結晶種として加えた。種を加えた混
合物をゆっくり攪拌しながら１５時間かけて２０〜２５
℃までゆっくりと冷却した。生成物を中程度の多孔度の
半融ガラス漏斗を通じて濾過して単離し、ケーキは、８
０：２０（ｖ／ｖ）エタノール／水１００mlで３回、９
０：１０（ｖ／ｖ）エタノール／水１００mlで１回、無
水エタノール１００mlで２回、最後にヘキサン１５０ml
で３回順次洗浄した。窒素流を１５時間ケーキに通じて
生成物を乾燥し、カリウム塩として化合物Ｉ ４３．０
ｇを得た。

【００３９】実施例Ｉａ一カリウム塩から一ナトリウム塩への変換 ８０：２０（ｖ／ｖ）水／エタノール（６００ml）中の
Ｍがカリウムである化合物ＩＢ６．０ｇの溶液を、 AMB
ERCHROM １６１／cdを充填した２．５×３０cmカラムに
ポンプを用いて流速２０ml／分で通じた。その後カラム
をベッドの体積（約３００ml）の倍の８０：２０（ｖ／
ｖ）水（０．１Ｍ NaH₂PO₄ 、pH４．５）／エタノール
で洗浄した後、ベッドの体積の倍の８０：２０（ｖ／
ｖ）水／エタノールで流速２０ml／分で洗浄した。生成
物を２０：８０（ｖ／ｖ）水／エタノールでカラムから
溶出して、４０mlの画分を回収した。含有量の多い（Ｈ
ＰＬＣで決定して０．５ｇ／リットルをこえるもの、約
１ベッド体積）分画をひとまとめにして、減圧下（１０
０mb、４０cm）に濃縮してエタノールを除去した。残留
水を除去して収量５．８ｇ（９８％）で化合物ＩＢの−
ナトリウム塩を得た。

【００４０】実施例II 以上の方法を、以下の表に指定する置換基を持った化合
物Ｉにより定義される属に入る代表的化合物の製造に用
いて、よい結果を得ることができる。 表 R₁ R₂ R₃ R₄ X X¹ Y Z R SEQ ID NO. OH OH OH OH H OH CH₃ CONH₂ C₁₇H₃₁ 1 OH OH OH OH CH₃ OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 2 OH H OH OH CH₃ OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 3 H H OH H CH₃ OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 4 H H H H CH₃ OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 5 OH OH H H CH₃ OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 6 H OH H OH CH₃ OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 7 H OH H OH H OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 8 OH OH H OH H OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 9 OH OH OH OH OH OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 10 OH OH OH OH CH₃ OH CH₃ CH₃ C₁₇H₃₁ 11 OH OH OH OH CH₃ OH CH₃ CH₃ C₁₇H₃₅ 11 H OH OH OH CH₃ OH CH₃ CH₃ C₁₇H₃₅ 12 H OH H H CH₃ OH CH₃ CH₃ C₁₇H₃₅ 13 H OH OH OH H OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 14 H OH OH OH CH₃ OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 15 OH OH H OH CH₃ OH CH₃ CONH₂ C₁₅H₃₁ 16 OH OH OH OH CH₃ OH H CONH₂ C₁₅H₃₁ 17 ────────────────────────────────── ホスフェート誘導体の有用性については、ニューモシス
チス・カリニ（Pneumocystis carinii) に対する効能に
関しての免疫抑制したラットについての以下の代表的研
究で見ることができる。

【００４１】遊離酸としての化合物Ｉを研究に用いた。
Sprague - Dawleyラット（体重およそ２５０ｇ）を飲み
水に入れたデキサゾン（２．０mg／ｌ）で免疫抑制し
て、５週間低タンパク質飼料で育てて、潜伏性感染によ
るニューモシスチス肺炎の進行をうながした。薬物処理
する前に、２体のラットを犠牲にしてニューモシスチス
カリニ（Pneumocystis carinii) 肺炎の存在を確認する
と、２体ともに感染していることがわかった。６体のラ
ット（体重約１５０ｇ）に、１日２回、４日間、賦形剤
（蒸留水）０．２５ml中の化合物Ｉを、尾の静脈から静
脈内（Ｉ．Ｖ．）に注射した。賦形剤のみのコントロー
ルもまた注射を行なった。すべての動物は飲み水の中の
デキサゾンを取り入れ、処置期間は低タンパク質飼料を
受けつづけた。処置が完了したら、すべての動物を犠牲
にして、肺をとり出して処理し、疾患の拡がりを染色ス
ライドを顕微鏡で調べて決定した。この研究の結果、化
合物Ｉは約０．６mg／kgのＥＤ₉₀で４日間でＰ．カリニ
（P. carinii) 嚢胞をとりのぞくのに効果があることが
示された。

【００４２】ラットに一日２回、４日間、腹腔内注射
（Ｉ．Ｐ．）することをのぞいて同様な実験において、
動物を犠牲にして肺をとり出して処理し、疾患の拡がり
を染色スライドを顕微鏡で分析して決定した。その結
果、遊離酸としての化合物Ｉが、約０．６mg／kgのＥＤ
₉₀で４日間でＰ．カリニ（P. carinii) 嚢胞をふせぐ効
果があることが示された。

【００４３】また、この化合物は、カンジダ（Candida)
菌に対して有用である。この特性は１％デキストロース
を含む イースト窒素ベース (Difco)培地（ＹＮＢＤ）
で行なうマイクロブロス希釈アッセイにおける最小殺菌
濃度（ＭＦＣ）の決定によって示すことができる。この
アッセイを行なう場合、化合物Ｉを１０％ジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）に可溶化して２５６０μｇ／mlに
希釈した。次に化合物をＹＮＢＤで２５７μｇ／mlに希
釈した。懸濁液０．１５mlを（各０．１５mlのＹＮＢＤ
を入れた）９６ウェルプレートの最上列に入れて、薬物
濃度を１２８μｇ／mlにした。さらに２倍希釈を最上列
から行なってゆき、最終的には１２８から０．０６μｇ
／mlまでの範囲の薬物濃度を作った。

【００４４】Sabouraud デキストロース寒天で成長させ
たイースト培養物をＹＮブロス（Difco)に移して３５℃
で振とうして（２５０rpm ）一晩インキュベートした。
インキュベーション後、各培養物を滅菌水で希釈して、
最終濃度１〜５×１０⁶ コロニー形成単位（ＣＦＵ）／
mlとした。

【００４５】９６ウェルマイクロプレートに、ウェルあ
たり１．５mlを与えるＭＩＣ−２０００（Pynatech) を
用いて接種し、ウェルあたり１．５〜７．５×１０³ 個
の細胞を含む最終接種物を作った。マイクロプレートを
３５℃で２４時間インキュィートした。最小阻害濃度
（ＭＩＣ）を、成長が全く見られない最低薬物濃度とし
て記録した。

【００４６】ＭＩＣを記録した後、プレートをゆすって
細胞を再懸濁した。その後、９６ウェルマイクロプレー
トの各ウェルからの１．５μｌのサンプルを、Sabourau
d デキストロース寒天を入れた１個のウェルトレイに移
した。接種したトレイを２４時間２８℃でインキュベー
トしてから、読みとりを行なった。ＭＦＣは、全く成長
していないか、あるいはスポットあたり４コロニー未満
の成長しか示さない最低の薬物濃度であると定義され
る。結果は以下の表のようである。 真菌株番号 最小殺菌濃度（μｇ／ml） C.アルビカンス（C. albicans) ＭＹ １０５５ ２ ＭＹ １２０８ ４ ＭＹ １０２８ ４ C.トロピカリス（C. tropicalis) ＭＹ １０１２ １ C.パラプシロシス（C. parapsilosis) ＭＹ １０１０ ３２

【００４７】出発物質の調製 出発物質である化合物Ａは、ＭＦ５４０４Ｚ．アルボリ
コラ（Z. arboricola)ＡＴＣＣ２０９５７の寒天斜面を
以下の組成のＫＦ種培地５４mlに接種して調製できる。
すなわち：コーンスティープリカー５．０ｇ；トマトペ
ースト４０．０ｇ；オート麦粉１０．０ｇ；グルコース
１０．０ｇ；微量元素１０ml；水１０００ml；pH６．
８。ここに微量元素は溶液となっていて、１リットルあ
たり：NHCl０．６ｇ； FeSO₄・７H₂O １．０ｇ；MnSO₄
・４H₂O １．０ｇ；CuCl・２H₂O０．０２５ｇ；CuCl₂
０．１ｇ；H₃BO₃ 、０．０５６ｇ；(NH₄)₆Mo₇O₂₄・４H₂
O０．０１９ｇ；及び ZnSO₄・７H₂O ０．２ｇであり、
接種した接地は４日間２５℃で２２０rpm でインキュベ
ートする。その後２０mlのサンプルをとり出して５００
mlのＫＦ接地を接種するのに用いて、接種した接地を２
２０rpm で３日間２５℃でインキュベートしてよい。こ
のように接種とインキュベーションをした４つの接地を
用いて、２ml／リットルのポリプロピレングリコールＰ
−２０００を含むＫＦ接地１８０リットルを接種し、こ
の接地を２５℃で９０リットル／分で通気して、０．７
kg／cm² ゲージの圧力下に２００rpm で振とうして培養
してもよい。その後、この培養サンプル２５リットルを
用いて、１リットルあたり以下の成分を含む培地４７５
リットルを接種するのに用いることができる。すなわ
ち：Ｄ−マンニトール４０ｇ；ＮＺ−Amine （タイプ
Ｅ；カゼイン加水分解物、Humko - Shefield, Memphis,
Tenn)、３３ｇ；Fidco - East Extract １０ｇ；硫酸
アンモニウム５ｇ；及びリン酸一カリウム９ｇ及び２ml
のポリプロピレングリコールＰ−２０００。次にこの培
地を１２０kgで２５分間滅菌した後、２５℃、２５０リ
ットル／分で通気して、０．７kg／cm² ゲージの圧力下
に、１５０rpmで振とうして５日間培養する。pHは初期
値６．０ないし５．５から低下するにまかせて、その後
５．５±０．４に５日間保った後、収穫して、一連のク
ロマトグラフィーによる分離によって単離する。

【００４８】多くの出発物質の化合物は、ある種の真菌
生物を栄養培地で培養して得られる天然生成物である。
他の出発物質は、適当な天然生成物の側鎖を脱アシル化
して核化合物を得た後、これを所望の側鎖のアシル化剤
でアシル化することによって得られる。Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ
₃ 及びＲ₄ がＯＨであり、ＸがＨ、Ｘ′がＯＨ、ＹがＣ
Ｈ₃ 、そしてＺが−CONH₂ である化合物も、ザレリオン
アルボリコラ（Zalerion arboricola)ＡＴＣＣ２０９５
７の培養によって得られる。Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 及びＲ₄
がＯＨであり、ＸがＣＨ₃ 、Ｘ′がＯＨ、ＹがＣＨ₃ 、
そしてＺが−CONH₂ 、そしてＲが９，１１−ジメチルト
リデシルである化合物を、栄養培地中でザレリオンアル
ボリコラ（Zalerion arboricola)ＡＴＣＣ２０８６８を
培養し、クロマトグラフィーによる分離で単離であるこ
とで得られるが、より詳細には、米国特許第４，９３
１，３５２号に説明されている。Ｚが−CONH₂ であり、
Ｒ₁ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ がＯＨ、Ｒ₂ がＨ、ＸがＨ又はＣ
Ｈ₃、そしてＸ′がメチル、ＹがＨである他の化合物
を、Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol. １
９、ｐ１３１（１９８４）が教えるように、クリプトス
ポリオプシス（Cryptosporiopsis) 種ＡＴＣＣ２０５９
４の培養によって得ることができる。

【００４９】Ｚが CONH₂でありＲがいろいろな基であ
る、ある種の他の化合物を、シュードモナス（Pseudomo
ndacea) 又はアクチノプラーネス（Actinoplanaceae)等
の科の微生物によって天然生成物の側鎖を脱アシル化
し、この脱シアル化したシクロヘキサペプチドを単離し
た後、活性アシル誘導体でアシル化することによって調
製できる。異なった親油性の側鎖をもついろいろな半合
成化合物を得るための代表的な方法、及び多くの化合物
を得るための方法に関して、核を得ることに関しては米
国特許第４，３０４，７１６号に、核を利用して誘導体
を調製することに関しては米国特許第４，２８９，１２
０号に記述が見られる。同様に、ＺがＨである半合成化
合物を得ることがてきる。すなわち、ＺがＨであるいろ
いろな天然生成物を脱アシル化する代表的な方法の記述
が米国特許第４，２９３，４８２号に見られる。シュー
ドモナス（Pseudomonas)種を用いた代表的な脱アシル化
においては、基質のシクロヘキサペプチド天然生成物の
ジメチルスルホキシド溶液を攪拌したpH６．５のリン酸
バッファー中のシュードモナス（Pseudomonas)種の細胞
懸濁液に加えた後、栄養培地中で３７℃で１８時間培養
して、脱アシル化をさせる。脱アシル化した生成物は、
細胞を分離するために遠心分離した上澄みから回収し、
精製した後、ハロゲン化アシル、ペンタクロロフェノキ
シド、スルホン酸アルキル、又はスルホン酸アリール等
の活性化酸誘導体と室温で１５〜２０時間反応させてア
シル化し、その後通常の方法で精製する。

【００５０】ＺがＨである構造を有し、エキノカンジン
（echinocandins)、アクリアシン（aculiacins) 、ムル
ンドカンジン（mulundocandin)として知られており、文
字及びナンバーコードで様々に同定される天然生成物
を、アスペルギルス（Aspergillus)菌の培養により得る
ことができる。すなわち、エキノカンジンはアスペルギ
ルス ルグロスス（Aspergillus rugulosus)によって、
アクリアシンはアスペルギルス アクレアトス（Asperg
illus aculeatus)によって、そして他のエキノカンジン
様化合物は Asp. ニゲル（niger)、Asp.ニドランス（ni
dulans) 等によって生産される。ＸとＸ′がいずれもＯ
Ｈである化合物を、Ｚ．アルボリコラ（Z. arboricola)
ＡＴＣＣ７４０３０を栄養培地中で３〜３０日間培養し
た後、生成物を通常の方法で回収することにより、得る
ことができる。Ｒ₁ とＲ₃ がＨであり、いろいろな他の
置換基を持つ化合物は、対応する天然生成物又はＲ₁ と
Ｒ₃ がＯＨである半合成化合物を０℃窒素雰囲気下に冷
却して攪拌しながら、トリフルオロ酢酸中のナトリウム
シアノボロヒドリドと反応させて、その後室温で反応を
完了させることによって調製できる。生成物は、トリフ
ルオロ酢酸を蒸発させて、残渣をメタノールに溶解し、
pHを約８に調製して、これを水中に注ぎ入れて沈澱生成
物を得ることによって回収できるが、さらにＨＰＬＣに
よって精製してもよい。Ｒ₁ がＯＨでＲ₃ がＨの化合物
を、還元を行なう前に化合物を氷酢酸又は二塩化メチレ
ン等の溶媒で溶液にしておくことを除いては同様な方法
で調製できる。Ｒ₁ がＨでＲ₃ がＯＨの化合物は、対応
する天然生成物又はＲ₁ とＲ₃ がＯＨである半合成化合
物を数回に分けて、トリフルオロ酢酸中でトリアセトキ
シボロヒドリドと反応させて攪拌することによって調製
できる。反応終了後に、減圧下に揮発性成分を除去し、
残渣を分取ＨＰＬＣで精製できる。

【配列表】

【００５１】

【００５２】

【００５３】

【００５４】

【００５５】

【００５６】

【００５７】

【００５８】

【００５９】

【００６０】

【００６１】

【００６２】

【００６３】

【００６４】

【００６５】

【００６６】

【００６７】

フロントページの続き (72)発明者 マロリー エフ．レーヴェ アメリカ合衆国，07746 ニュージャーシ ィ，マルボロ，79 ハイウェイ 189 (72)発明者 ディヴィッド ジェー．マスレー アメリカ合衆国，08558 ニュージャーシ ィ，スキルマン，グランドビュー ロード 317

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 構造式 【化１】 のシクロヘキサペプチドのリン酸エステル化合物の製造
   方法において、 （１）構造式 【化２】 のシクロヘキサペプチドを、温度を約−１３°から−１
   ７℃の範囲に保って、水酸化リチウムの存在下にテトラ
   ベンジルピロホスフェートと混合することにより、前記
   シクロヘキサペプチドをリン酸化して構造式 【化３】 を有する前記シクロヘキサペプチドのジベンジルホスフ
   ェートを得ること、及び （２）このようにして得たこのシクロヘキシルペプチド
   のジベンジルホスフェートエステルをPd／Ｃ上で水素化
   分解することにより、脱ベンジル化することからなる、 シクロヘキサペプチドのリン酸エステル化合物の製造方
   法。
2. 【請求項２】 構造式 【化４】 のシクロヘキサペプチドのリン酸エステル化合物の製造
   方法において、 （１）構造式 【化５】 のシクロヘキサペプチドを、温度を約−１３°から−１
   ７℃の範囲に保って、水酸化リチウムの存在下にテトラ
   ベンジルピロホスフェートと混合することにより、前記
   シクロヘキサペプチドをリン酸化して構造式 【化６】 を有する前記シクロヘキサペプチドのジベンジルホスフ
   ェートを得ること、及び （２）このようにして得たこのシクロヘキシルペプチド
   のジベンジルホスフェートエステルをPd／Ｃ上で水素化
   分解することにより、脱ベンジル化することからなる、 シクロヘキサペプチドのリン酸エステル化合物の製造方
   法。
3. 【請求項３】 構造式 【化７】 の化合物を簡単に製造する方法において、 （１）（ａ）構造式 【化８】 の化合物とジメチルホルムアミドをテトラベンジルピロ
   ホスフェートに加えて、完全に溶解するように攪拌し
   て、 （ｂ）内部温度を約−１５℃に保つような速度で攪拌し
   ながら、前記溶液に水酸化リチウム水溶液を加えて、反
   応が完了するまで攪拌を続けること、によってリン酸化
   すること; （２）（ａ）リン酸化混合物を酸性にして、５０：５０
   （ｖ／ｖ）エタノール／水に前記混合物を加え、官能基
   化していないカラムに得られた溶液を通して、カラムに
   ジベンジルホスフェートエステルを吸着させて、 （ｂ）カラムを５０：５０エタノール／水で洗浄して、 （ｃ）ジベンジルホスフェートエステルを９０：１０の
   エタノール／水で溶出すること、 によって溶媒を交換すること；および （３）（ａ）炭素触媒上のパラジウムの存在下に溶出液
   を水素と接触させて、（ｂ）濾過して触媒をとり除くこ
   と、 によってベンジルエステル基を水素化分解すること、 から成る製造方法。
4. 【請求項４】 水素化分解の濾液中の酸生成物を直接に
   変換させて結晶性一塩を生成する工程をさらに含む請求
   項３の方法。