ES2233070T3 - Sintesis de analogos peptidicos ciclicos modificados en el anillo. - Google Patents
Sintesis de analogos peptidicos ciclicos modificados en el anillo.Info
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Abstract
Un proceso para modificar un núcleo de anillo peptídico cíclico que comprende las etapas de: (i) proporcionar un compuesto peptídico cíclico que comprende una unidad peptídica que tiene un grupo ó-hidro xilo y un grupo y-hidroxilo; (ii) abrir el anillo de dicho compuesto peptídico cíclico para proporcionar un primer péptido lineal en el que la unidad peptídica que tiene el grupo y-hidroxilo es la unidad peptídica N-terminal de dicho primer péptido lineal; (iii) separar por escisión dicha unidad peptídica que tiene un grupo y-hidroxilo para proporcionar un segundo péptido lineal; (iv) unir al menos un aminoácido, unidad dipeptídica o unidad sintética a dicho segundo péptido lineal para producir un tercer péptido lineal; (v) ciclar dicho tercer péptido lineal para producir un compuesto peptídico cíclico modificado que tiene un núcleo de anillo modificado.
Description
Síntesis de análogos peptídicos cíclicos
modificados en el anillo.
La presente invención se refiere a la preparación
de análogos peptídicos cíclicos de anillo modificado mediante la
sustitución de unidad(es) peptídica(s) en el núcleo
del anillo peptídico cíclico de productos naturales o derivados
semisintéticos de los mismos, en particular, compuestos de tipo
equinocandina. Pueden producirse nuevos compuestos peptídicos
cíclicos semisintéticos a partir de ellos.
La equinocandina B es un producto natural con
actividad antifúngica que se ha modificado en el pasado de una
variedad de modos. Por ejemplo, se han preparado derivados sencillos
incluyendo productos de dihidro- y
tetrahidro-reducción y la modificación de grupos
activos pendientes del núcleo del anillo. El enfoque más común ha
sido la sustitución de la cadena lateral N-acilo. Por
ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.293.489, 4.320.052, 5.166.135 y
5.541.160 y los documentos EP 359529, 448353, 447186, 462531 y
561639 describen una variedad de compuestos de tipo equinocandina
derivatizados en N-acilo que proporcionan grados variables de
actividades antifúngicas y antiprotozoarias.
Otras modificaciones han incluido la acilación
del grupo hidroxilo del grupo fenólico pendiente. Por ejemplo, los
documentos GB 2.242.194 y EP 448343, 448354, 503960 y 525889
describen la introducción de radicales acilo, fosfono y sulfo que
tienen un grupo cargado a pH neutro para conferir solubilidad en
agua.
Los documentos GB 2.241.956 y EP 448355 describen
productos de la reducción con hidrógeno de compuestos
ciclohexapeptídicos.
Puede encontrarse una revisión de las familias de
equinocandina y sus análogos semisintéticos en Turner, W. et
al., Current Pharmaceutical Design, 2,
209-224 (1996). La revisión compara las actividades
in vitro e in vivo de los productos naturales de
equinocandina y sus análogos semisintéticos.
Cada uno de los enfoques descritos anteriormente
están limitados a reacciones con grupos activos pendientes del
núcleo de anillo peptídico cíclico. Algunos han intentado construir
sintéticamente el núcleo peptídico cíclico completo. (Véanse,
concretamente la patente de EE.UU. nº 5.696.084; J. Am. Chem.
Soc., 108, 6041 (1986); Evans, D.A. et al., J.
Am. Chem. Soc. 109, 5151 (1987); J. Med. Chem. 35,
2843 (1992); y Kurokawa, N. et al., Tetrahedron,
49, 6195 (1993)). Sin embargo, este enfoque no es eficaz de
costes y puede conducir a mezclas racémicas. Por lo tanto, existe la
necesidad de proporcionar un proceso más flexible y eficaz de costes
para modificar el núcleo hexapeptídico cíclico de productos
naturales para ampliar el alcance de los candidatos antifúngicos
potenciales.
Varios investigadores han dado a conocer la
escisión preferida de un enlace amida en compuestos que portan
grupos hidroxilo en las posiciones delta y gamma respecto al enlace
amida para proporcionar lactonas asimétricas utilizando ácidos tales
como ácido clorhídrico y ácido trifluoroacético; sin embargo,
ninguno ha aplicado el proceso a la escisión de un grupo aminoácido
terminal de un péptido lineal. (Véase, concretamente, K. Tanaka,
et al., Tetrahedron Lett. 26 (10), 1337 (1985); N.
Baba, et al., Chem. Lett. (5), 889 (1989); H. Yoda,
et al., Chem. Express, 4 (8), 515 (1989); y Y.
Yamamoto, et al., J. Org. Chem., 56 (3), 112
(1991)).
Hensen et al., J. Antibiotics
45 (12), 1875-1885 (1992) describe
neumocandina B_{0} y seis lipótidos relacionados a partir de
mutantes de Zalerion arboricola, que son agentes antifúngicos
y anti-Pneumocystic carinii.
La presente invención proporciona un método para
modificar el sistema de anillo peptídico cíclico de compuestos de
tipo equinocandina para producir nuevos análogos que tienen
actividad antifúngica. El proceso inventivo permite hacer cambios en
la estructura peptídica cíclica de productos naturales y
semisintéticos que no eran anteriormente posibles. Por ejemplo,
pueden incorporarse rasgos tales como solubilidad en agua al núcleo
de anillo peptídico cíclico, sitios para modificación adicional,
aumento o reducción del número de unidades aminoacídicas o
peptídicas en el núcleo de anillo, y aumento o reducción del número
total de miembros (o átomos) en el núcleo de anillo.
El proceso incluye las etapas de (i) proporcionar
un compuesto peptídico cíclico que comprende una unidad peptídica
que tiene un grupo \delta-hidroxilo y un grupo
\gamma-hidroxilo; (ii) abrir el anillo del
compuesto peptídico cíclico para proporcionar un primer péptido
lineal, siendo la unidad peptídica que tiene el grupo
\gamma-hidroxilo la unidad peptídica
N-terminal del primer péptido lineal; (iii) separar
por escisión la unidad peptídica que tiene un grupo
\gamma-hidroxilo para proporcionar un segundo
péptido lineal (preferiblemente añadiendo ácido trifluoroacético o
ácido clorhídrico al primer péptido lineal en un disolvente
orgánico); (iv) unir al menos un aminoácido, una unidad dipeptídica
o una unidad sintética al segundo péptido lineal para producir un
tercer péptido lineal; (v) ciclar el tercer péptido lineal para
producir un compuesto peptídico cíclico modificado que tiene un
núcleo de anillo modificado. Como alternativa, puede separarse por
escisión una segunda unidad peptídica del segundo péptido lineal
producido en la etapa (iii) antes de unir el aminoácido, dipéptido o
unidad(es) sintética(s) en la etapa (iv) y posterior
ciclación en la etapa (v). La adición de dos o más unidades en la
etapa (iv) puede realizarse de un modo por etapas (por ejemplo, se
une primero una unidad y después se une una segunda unidad). Es de
particular interés la modificación de compuestos de tipo
equinocandina para producir nuevos compuestos hexapeptídicos y
heptapeptídicos cíclicos que muestran inhibición de la actividad
fúngica y parasítica. El proceso proporciona también un medio
conveniente para producir compuestos peptídicos cíclicos que tienen
las fórmulas I y II (incluyendo sales, ésteres e hidratos
farmacéuticamente aceptables de los mismos).
en las
que
R es un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un
grupo alquinilo, un grupo arilo o un grupo heteroarilo;
R_{2} es -H ó -CH_{3};
R_{3} es -H, -CH_{3}, -CH_{2}CONH_{2} ó
-CH_{2}CH_{2}NH_{2};
R_{4} es -H o -OH;
R_{5} es -OH, -OPO_{3}H_{2} o
-OSO_{3}H;
R_{6} es -H o -OSO_{3}H;
R_{7} es -CH_{3} o -H;
(Y) se representa por la siguiente fórmula
--- A ---
\uelm{C}{\uelm{\para}{NH --- W}}H ---
\delm{C}{\delm{\dpara}{O}} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\para}{B}}H
---
en la
que
A es -(CH_{2})_{a}- en la que a=
1-4,
-CHR'-CHR''-(CH_{2})_{b}- en la que R' y
R'' son independientemente -H, -OH, C_{6}H_{5}O-, -SH,
-NH_{2}, C_{n}H_{2n+1}NH-, C_{n}H_{2n+1}O-,
C_{n}H_{2n+1}S- o -C_{n}H_{2n+1} en las que n=
1-4 y b= 0-1,
-(CH_{2})_{c}-C(O)NH(CH_{2})_{d}-
en la que c= 1-2 y d= 1-2,
-N=CH-(CH_{2})_{e}- en la que e= 0-2,
-NR'''(CH_{2})_{f}- en la que R''' es -H;
-C(O)CH_{2}NH_{2},
-C(O)CH(NH_{2})CH_{2}NH_{2} o
-C_{n}H_{2n+1} en las que n= 1-4 y f=
1-3,
-(CH_{2})_{g}-SO_{2}-(CH_{2})_{h}-
en la que g= 1-2 y h= 1-2,
en la que i= 1 ó 2,
o
en la que j es 1 ó 2 y Z es un
grupo amino, un grupo alquilamino o un grupo
piperidilamino;
B es un grupo alquilo C1 a C6 sustituido o no
sustituido (por ejemplo isopropilo, p-hidroxibencilo,
hidroximetilo o \alpha-hidroxietilo);
y W es un hidrógeno o C(O)R en la
que R es como se define anteriormente.
Se proporcionan compuestos peptídicos cíclicos
que tienen las fórmulas I y II (anteriores) en las que
A es -(CH_{2})_{a}- en la que a= 1, 2
ó 4, -CHR'- CHR''-(CH_{2})_{b}- en la que R' y R'' son
independientemente -H, -OH, C_{6}H_{5}O-, -SH, -NH_{2},
C_{n}H_{2n+1}NH-, C_{n}H_{2n+1}O-, C_{n}H_{2n+1}S- o
-C_{n}H_{2n+1} en las que n= 1-4 y b= 0,
-(CH_{2})_{c}-C(O)NH(CH_{2})_{d}-
en la que c= 1-2 y d= 1-2,
-N=CH-(CH_{2})_{c}- en la que e= 0-2,
-NR'''(CH_{2})_{f}- en la que R''' es -H,
-C(O)CH_{2}NH_{2},
-C(O)CH(NH_{2})CH_{2}NH_{2} o
-C_{n}H_{2n+1} en la que n= 1-4 y f=
1-3,
-(CH_{2})_{g}-SO_{2}(CH_{2})_{h}-
en la que g= 1-2 y h= 1-2,
en la que i= 1 ó 2,
o
en la que j es 1 ó 2 y Z es un
grupo amino, un grupo alquilamino o un grupo
piperidilamino.
Una composición farmacéutica puede comprender los
compuestos I y II descritos anteriormente (incluyendo sales, ésteres
e hidratos farmacéuticamente aceptables de los mismos) en un
vehículo farmacéuticamente inerte. Los nuevos compuestos y
composiciones farmacéuticas descritos anteriormente pueden
utilizarse para inhibir el crecimiento fúngico y la actividad
parasítica, así como para tratar una infección fúngica en un ser
humano con un método que comprende administrar a un ser humano
necesitado de dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz
del nuevo compuesto antifúngico descrito anteriormente.
Como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "compuestos de tipo equinocandina" designa compuestos
que tienen la siguiente estructura general, incluyendo cualquier
derivado sencillo de la misma:
en la que R es un grupo alquilo, un
grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo o un grupo
heteroarilo; R_{1} es -H o -OH, R_{2} es -H o -CH_{3}; R_{3}
es -H, -CH_{3}, -CH_{2}CONH_{2} o
-CH_{2}CH_{2}NH_{2};
R_{4} es -H o -OH; R_{5} es -OH,
-OPO_{3}H_{2} o -OSO_{3}H; R_{6} es -H o -OSO_{3}H y
R_{7} es -CH_{3} o -H.
El término "alquilo" designa un radical
hidrocarburo de fórmula general C_{n}H_{2n+1} que contiene de 1
a 30 átomos de carbono a menos que se indique otra cosa. El radical
alcano puede ser lineal, ramificado, cíclico o multicíclico. El
radical alcano puede estar sustituido o no sustituido. De forma
similar, la porción alquilo de un grupo alcoxi o alcanoato puede
tener la misma definición que anteriormente.
El término "alquenilo" designa un
hidrocarburo acíclico que contiene al menos un doble enlace
carbono-carbono. El radical alqueno puede ser
lineal, ramificado, cíclico o multicíclico. El radical alqueno puede
ser sustituido o no sustituido. El término "alquinilo" designa
un hidrocarburo acíclico que contiene al menos un triple enlace
carbono-carbono. El radical alquino puede ser lineal
o ramificado. El radical alquino puede estar sustituido o no
sustituido.
El término "arilo" designa restos aromáticos
que tienen sistemas de anillo sencillos (por ejemplo fenilo) o
condensados (por ejemplo naftaleno, antraceno, fenantreno, etc.).
Los grupos arilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los
grupos arilo sustituidos incluyen una cadena de restos aromáticos
(por ejemplo bifenilo, terfenilo, fenilnaftalilo, etc.).
El término "heteroarilo" designa restos
aromáticos que contienen al menos un heteroátomo en el sistema de
anillo aromático (por ejemplo pirrol, piridina, indol, tiofeno,
furano, benzofurano, imidazol, pirimidina, purina, bencimidazol,
quinolina, etc.). El resto aromático puede consistir en un sistema
de anillo sencillo o condensado. Los grupos heteroarilo pueden estar
sustituidos o no sustituidos.
En el campo de la química orgánica, y
particularmente en el campo de la bioquímica orgánica, es
ampliamente conocido que la sustitución significativa de los
compuestos es tolerada o incluso útil. En la presente invención, por
ejemplo, el término grupo alquilo permite sustituyentes que son
alquilo clásico, tales como metilo, etilo, propilo, hexilo,
isooctilo, dodecilo, estearilo, etc. El término grupo abarca y
permite específicamente sustituciones en alquilos que son comunes en
la técnica, tales como hidroxi, halógeno, alcoxi, carbonilo, ceto,
éster, carbamato, etc., así como incluye el resto alquilo no
sustituido. Sin embargo, se entiende generalmente por los expertos
en la técnica que los sustituyentes deben seleccionarse para no
afectar adversamente a las características farmacológicas del
compuesto o interferir adversamente con el uso del medicamento. Los
sustituyentes adecuados para cualquiera de los grupos definidos
anteriormente incluyen alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, halo,
hidroxi, alcoxi, ariloxi, mercapto, alquiltio, ariltio, mono- y
dialquilamino, sales de amonio cuaternario, aminoalcoxi,
hidroxialquilamino, aminoalquiltio, carbamilo, carbonilo, carboxi,
glicolilo, glicilo, hidrazino, guanilo y combinaciones de los
mismos.
El esquema sintético descrito a continuación
ilustra los procedimientos generales para modificar el sistema de
anillo peptídico cíclico de compuestos de tipo equinocandina
manteniendo la quiralidad. Puede abrirse el anillo peptídico cíclico
de cualquier producto natural de tipo equinocandina o derivado
semisintético y escindirse la unidad peptídica ornitina terminal a
condición de que esté presente y no bloqueado el grupo
\gamma-hidroxilo de la unidad peptídica ornitina.
La expresión "producto natural" designa aquellos metabolitos
secundarios, habitualmente de estructura relativamente compleja, que
son de distribución más restringida y más característicos de una
fuente específica en la naturaleza. Los materiales de partida
productos naturales que pertenecen a la familia de péptidos cíclicos
de equinocandina incluyen equinocandina B, equinocandina C,
aculeacina A\gamma, mulundocandina, esporiofungina A, neumocandina
A_{0}, WF11899A y neumocandina B_{0}. Con fines ilustrativos, el
siguiente esquema sintético parte de cilofungina.
Como se muestra anteriormente, el anillo
hexapeptídico cíclico (1) se abre en primer lugar utilizando
catálisis básica y después se reduce con borohidruro de sodio,
proporcionando el hexapéptido lineal (2). Tras tratamiento con
trietilsilano en ácido trifluoroacético (TFA), se retira el
hidroxilo bencílico y se escinde la unidad de ornitina,
proporcionando el pentapéptido lineal (3). El pentapéptido lineal
(3) puede protegerse ahora y activarse la amida primaria,
proporcionando un intermedio (4) que puede reciclarse con una unida
unidad aminoacídica u otra unidad sintética para producir un nuevo
compuesto cíclico (5). El compuesto cíclico (5) puede modificarse
adicionalmente desprotegiendo y acilando el grupo amino pendiente
(si está presente), proporcionando el compuesto cíclico modificado
(6) que tiene una cadena lateral N-acilo. Los expertos en la
técnica apreciarán que la cadena lateral N-acilo abarca una
variedad de restos de cadena lateral conocidos en la técnica. Los
restos de cadena lateral adecuados incluyen grupos alquilo, grupos
alquenilo, grupos alquinilo, grupos arilo, grupos heteroarilo
sustituidos y no sustituidos y combinaciones de los mismos.
Preferiblemente, la cadena lateral contiene tanto una sección lineal
rígida como una sección alquilo flexible para maximizar la potencia
antifúngica. Además, pueden hacerse modificaciones adicionales en
cualquier funcionalidad nueva introducida mediante la incorporación
del nuevo aminoácido, péptido o unidad(es)
sintética(s) que contiene dicha funcionalidad.
Como alternativa, puede escindirse otra unidad
peptídica del intermedio (3), proporcionando un tetrapéptido (7) que
puede reciclarse con una nueva unidad aminoacídica, unidad
dipeptídica u otra unidad sintética, produciendo un nuevo compuesto
cíclico (8). Como el compuesto cíclico (5), el compuesto (8) puede
modificarse también adicionalmente mediante desprotección y
acilación del grupo amino pendiente (si está presente) para unir una
nueva cadena lateral N-acilo o modificación de cualquier
funcionalidad nueva introducida mediante la incorporación de las
nuevas unidades aminoacídicas, peptídicas o sintéticas.
Como se ilustra en el esquema sintético anterior,
el núcleo de anillo se abre selectivamente en el enlace entre
L-prolina C-terminal y
R-ornitina N-terminal utilizando
catálisis básica estándar bien conocida por los expertos en la
técnica. Una vez se abre el hexapéptido cíclico, el aminoácido
ornitina terminal puede entonces escindirse y unirse un nuevo
aminoácido (u otra unidad sintética) utilizando procesos de
formación de péptido (o procesos de condensación) estándar bien
conocidos por los expertos en la técnica. La unidad de ornitina
terminal se escinde con ácido trifluoroacético o ácido clorhídrico
en un disolvente orgánico tal como cloruro de metileno, tolueno o
dioxano. Las condiciones de reacción preferida son ácido
trifluoroacético en cloruro de metileno.
Puede unirse cualquier unidad aminoacídica o
peptídica al péptido lineal. Teóricamente, es también posible
condensar con el péptido otras unidades sintéticas que sean capaces
de ciclación. Por ejemplo, puede formarse un enlace sulfonamida
entre un grupo amino-terminal en el péptido lineal y
un grupo sulfonilo en una unidad sintética. Puede considerase
cualquier número de otros enlaces; sin embargo, la actividad
farmacéutica de dichos compuestos es actualmente desconocida.
La inserción de un nuevo aminoácido, unidad
dipeptídica u otra unidad sintética permite cambiar el tamaño del
anillo ciclopeptídico. El número de átomos en el sistema de anillo
puede aumentarse o reducirse desde la estructura de anillo de
equinocandina de 21 miembros original dependiendo del(de los)
compuesto(s) particular(es) insertado(s) en el
anillo. Teóricamente, el tamaño de anillo está limitado sólo por la
configuración del péptido lineal. Si el péptido lineal es demasiado
corto o demasiado largo, los extremos no pueden encontrarse en una
proximidad suficientemente cercana como para reaccionar, y los
extremos pueden polimerizar con otro péptido lineal en lugar de
cerrarse formando un anillo. La configuración óptima del péptido
lineal para el cierre de anillo variará dependiendo de los
aminoácidos particulares que constituyan la estructura peptídica.
Para compuestos de tipo equinocandina, preferiblemente la estructura
de anillo final contiene entre 19 y 22 miembros, más preferiblemente
la estructura de anillo final es un anillo de 21 ó 22 miembros, lo
más preferiblemente la estructura de anillo final es un anillo de 21
miembros.
Es bien conocido que la cadena lateral acilo
pendiente de la estructura de anillo de equinocandina desempeña un
papel importante en la actividad tanto de materiales de tipo
equinocandina productos naturales como semisintéticos. En
consecuencia, puede utilizarse cualquier aminoácido o unidad
sintética para inserción en el anillo a condición de que el producto
ciclado final contenga al menos un grupo amino capaz de
acilación.
Cuando el compuesto insertado contiene más de una
unidad, las unidades pueden unirse una cada vez al penta- o
tetrapéptido lineal o las unidades individuales pueden combinarse y
después añadirse al penta- o tetrapéptido lineal en forma de una
unidad de bloque. Preferiblemente, las unidades se añaden en forma
de una unidad de bloque para minimizar la racemización.
La acilación del grupo amino puede realizarse en
una variedad de modos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, el grupo amino puede acilarse mediante reacción con un
haluro de acilo apropiadamente sustituido, preferiblemente en
presencia de un secuestrante de ácido tal como una amina terciaria
(por ejemplo trietilamina). La reacción se lleva a cabo típicamente
a una temperatura entre aproximadamente -20ºC a 25ºC. Los
disolventes de reacción adecuados incluyen disolventes apróticos
polares tales como dioxano o dimetilformamida. La elección del
disolvente no es crítica, a condición de que el disolvente empleado
sea inerte a la reacción en curso y los reactivos estén
suficientemente disueltos para efectuar la reacción deseada.
El grupo amino puede acilarse también mediante
reacción con un ácido carboxílico apropiadamente sustituido, en
presencia de un agente de acoplamiento. Los agentes de acoplamiento
adecuados incluyen diciclohexilcarbodiimida (DCC),
N,N'-carbonildiimidazol, cloruro
bis-(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico
(BOP-Cl),
N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina
(EEDQ), hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-iloxitripirrolidino-fosfonio
(PyBOP) y simila-
res.
res.
Como alternativa, el grupo amino puede acilarse
con un éster activado de un ácido carboxílico tal como ésteres de
carboxilato de p-nitrofenilo,
2,4,5-triclorofenilo, hidrato de hidroxibenzotriazol
(HOBT-H_{2}O), pentafluorofenol y
N-hidroxisuccinimida. Son restos acilantes preferidos los
ésteres de carboxilato de 2,4,5-triclorofenilo y
HOBT. La reacción se desarrolló típicamente durante 1 a 65 horas a
una temperatura de aproximadamente 0ºC a 30ºC en un disolvente
aprótico. La reacción se completa generalmente después de
aproximadamente 24 a 48 horas cuando se lleva a cabo a una
temperatura entre aproximadamente 15ºC y 30ºC. Los disolventes
adecuados incluyen tetrahidrofurano y dimetilformamida o mezclas de
los mismos. El grupo amino está generalmente presente en
proporciones equimolares respecto al éster activo o con un ligero
exceso del grupo amino.
Los compuestos pueden aislarse y utilizarse
per se o en forma de su sal o hidrato farmacéuticamente
aceptable. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable"
designa sales de adición de ácido no tóxicas derivadas de ácidos
inorgánicos y orgánicos. Los derivados de sal adecuados incluyen
haluros, tiocianatos, sulfatos, bisulfatos, sulfitos, bisulfitos,
arilsulfonatos, alquilsulfatos, fosfonatos, monohidrogenofosfatos,
dihidrogenofosfatos, metafosfatos, pirofosfonatos, alcanoatos,
cicloalquilalcanoatos, arilalconatos, adipatos, alginatos,
aspartatos, benzoatos, fumaratos, glucoheptonatos, glicerofosfatos,
lactatos, maleatos, nicotinatos, oxalatos, palmitatos, pectinatos,
picratos, pivalatos, succinatos, tartratos, citratos, canforatos,
canfosulfonatos, digluconatos, trifluoroacetatos y similares.
Los compuestos de anillo modificado pueden
utilizarse en una variedad de formulaciones farmacéuticas. Una
formulación típica comprende el compuesto de anillo modificado (o su
sal, éster o hidrato farmacéuticamente aceptable) en combinación con
un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. El
ingrediente activo se formula típicamente en formas de dosificación
farmacéutica para proporcionar una dosificación fácilmente
controlable del fármaco y para proporcionar al paciente un producto
elegante y fácilmente manejable. Las formulaciones pueden comprender
de 0,1 a 99,9% en peso de ingrediente activo, más generalmente de
aproximadamente 10% a aproximadamente 30% en peso.
Como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "dosis unitaria" o "dosificación unitaria"
designa unidades físicamente discretas que contienen una cantidad
predeterminada de ingrediente activo calculada para producir un
efecto terapéutico deseado. Cuando se administra una dosis unitaria
por vía oral o parenteral, se proporciona típicamente en forma de un
comprimido, cápsula, píldora, paquete de polvos, composición tópica,
supositorio, oblea, unidades medidas en ampollas o en envases
multidosis, etc. Como alternativa, puede administrarse una dosis
unitaria en forma de un aerosol seco o líquido que puede inhalarse o
pulverizarse.
La dosificación a administrar puede variar
dependiendo de las características físicas del paciente, de la
gravedad de los síntomas del paciente y del medio utilizado para
administrar el fármaco. La dosis específica para un paciente dado se
fija habitualmente por el criterio del médico a cargo.
Son bien conocidos vehículos, diluyentes y
excipientes adecuados por los expertos en la técnica, e incluyen
materiales tales como carbohidratos, ceras, polímeros solubles y/o
hinchables en agua, materiales hidrófilos o hidrófobos, gelatina,
aceites, disolventes, agua y similares. El vehículo, diluyente o
excipiente particular utilizado dependerá de los medios y los fines
para los que se aplique el ingrediente activo. Las formulaciones
pueden incluir también agentes humectantes, agentes lubricantes,
emulsionantes, agentes de suspensión, conservantes, edulcorantes,
estabilizantes, agentes perfumantes, agentes aromatizantes y
combinaciones de los mismos.
Una composición farmacéutica puede administrarse
utilizando una variedad de métodos. Los métodos adecuados incluyen
tópico (por ejemplo ungüentos o pulverizadores), oral, por inyección
e inhalación. El método de tratamiento particular utilizado
dependerá del tipo de infección a la que se dirija.
Los compuestos de tipo equinocandina se ha
mostrado que exhiben actividad antifúngica y antiparasítica tal como
inhibición del crecimiento de varios hongos infecciosos, incluyendo
Candida spp. (concretamente C. albicans, C. parapsilosis,
C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis o C. lusitaniaw);
Torulopus spp. (concretamente T. glabrata);
Aspergillus spp. (concretamente A. fumigatus);
Histoplasma spp. (concretamente H. capsulatum);
Cryptococcus spp. (concretamente C. neoformans);
Blastomyces spp. (concretamente B. dermatitidis);
Fusarium spp.; Trichophyton spp., Pseudallescheria boydii,
Coccidioides immits, Sporothrix schenckii, etc.
Los compuestos de este tipo inhiben también el
crecimiento de ciertos organismos responsables principalmente de
infecciones oportunistas en individuos inmunosuprimidos, tales como
la inhibición del crecimiento de Pneumocystis carinii (el
organismo causante de la neumonía por neumocistits (PCP) en SIDA y
otros pacientes inmunocomprometidos. Otros protozoos que se inhiben
mediante compuestos de tipo equinocandina incluyen Plasmodium
spp., Leishmania spp., Trypanosoma spp., Cryptosporidium spp.,
Isospora spp., Cyclospora spp., Trichomnas spp., Microsporidiosis
spp., etc.
Estos compuestos son útiles para combatir
infecciones fúngicas sistémicas o infecciones fúngicas dérmicas. En
consecuencia, la actividad fúngica puede inhibirse mediante un
método que comprende poner en contacto un compuesto de fórmula I o
II (o una sal, éster o hidrato farmacéuticamente aceptable del
mismo) con un hongo. Un método preferido incluye inhibir la
actividad de Candida albicans o Aspergillus fumigatus.
La expresión "poner en contacto" incluye una unión o conexión o
contacto aparente o tangencia mutua de un compuesto con un parásito
u hongo. La expresión no implica limitaciones adicionales al
proceso, tales como mediante mecanismo de inhibición. Los métodos se
definen para abarcar la inhibición de la actividad parasítica y
fúngica mediante la acción de los compuestos y sus propiedades
antiparasítica y antifúngica inherentes.
Se describe también un método para tratar una
infección fúngica que comprende administrar una cantidad eficaz de
un compuesto de fórmula I o II (o una sal, éster o hidrato
farmacéuticamente aceptable del mismo) a un hospedador necesitado de
dicho tratamiento. Un método preferido incluye tratar una infección
por Candida albicans o Aspergillus fumigatis. La
expresión "cantidad eficaz" designa una cantidad de compuesto
activo que puede inhibir la actividad fúngica. La dosis administrada
variará dependiendo de factores tales como la naturaleza y gravedad
de la infección, la edad y la salud genérica del hospedador y la
tolerancia del hospedador ante el agente antifúngico. El régimen de
dosificación particular puede variar igualmente según estos
factores. El medicamento puede administrarse en una dosis diaria
única o en dosis múltiples durante el día. El régimen puede durar
desde aproximadamente 2-3 días hasta aproximadamente
2-3 semanas o más. Una dosis diaria típica
(administrada en dosis única o divididas) contiene un nivel de
dosificación entre aproximadamente 0,01 mg/kg y 100 mg/kg de peso
corporal de un compuesto activo. Las dosis diarias preferidas están
generalmente entre aproximadamente 0,1 mg/kg y 60 mg/kg, y más
preferiblemente entre aproximadamente 2,5 mg/kg y 40 mg/kg.
Aunque los compuestos descritos en la presente
memoria pueden utilizarse para inhibir la actividad fúngica y
parasítica en una variedad de circunstancias (por ejemplo seres
humanos, animales, agricultura, etc.), preferiblemente los métodos
de uso están limitados al tratamiento de seres humanos para reducir
el potencial de desarrollo de resistencia ante productos
farmacéuticos.
A menos que se indique otra cosa, todos los
productos químicos pueden adquirirse de suministradores comerciales
tales como Aldrich Chemical (Milwaukee, WI), Sigma y otras fuentes
comerciales bien conocidas por los expertos en la técnica. Los
siguientes acrónimos son representativos de los correspondientes
grupos funcionales o compuestos:
BOC: terc-butoxicarbonilo,
(CH_{3})_{3}C-O-C(O)-,
CBZ: benciloxicarbonilo,
C_{6}H_{5}CH_{2}-O-C(O)-,
o-Cl-CBZ:
orto-clorobenciloxicarbonilo,
FMOC: fluorenilmetiloxicarbonilo,
TBDMS: terc-butildimetilsililo,
TFA: ácido trifluoroacético
AcN: acetonitrilo,
DMF: dimetilformamida,
THF: tetrahidrofurano,
TDM:
4,4'-tetrametildiaminodifenilmetano,
CAM: molibdato cérico de amonio.
El siguiente conjunto de ejemplos ilustra las
condiciones de reacción generales para escindir e insertar una
nueva(s)
unidad(es) en un núcleo ciclohexapeptídico.
unidad(es) en un núcleo ciclohexapeptídico.
Se añadió una solución de hidróxido de sodio 1 N
(40 ml) a una solución agitada de cilofungina (1) (100 g, 96 mmol)
en 350 ml de 55% de acetonitrilo/45% de agua. Se monitorizó la
reacción mediante cromatografía líquida a alta presión (columna
C-18, 50% de ACN/agua, 230 nm). Después de 1 hora,
la mezcla de reacción contenía >90% del aldehído intermedio. A
continuación, se añadió borohidruro de sodio (1,8 g, 48 mmol) y se
continuó la agitación durante 20 min. La HPLC mostró la conversión
completa al producto alcohol final. Se inactivó la reacción
añadiendo ácido acético gota a gota hasta que se terminó el
desprendimiento de gas. La mayoría del acetonitrilo se retiró
mediante rotavapor seguido de liofilización para retirar el resto,
proporcionando 98,1 g de una mezcla del producto sólido
I-2 y sales inorgánicas. (93% de pureza por
HPLC).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió la mezcla no purificada de compuesto
I-2 (98,1 g) descrito anteriormente en ácido
trifluoroacético (300 ml) y diclorometano (100 ml). Se enfrió la
mezcla en un baño de hielo. Se añadió trietilsilano (32 ml, 0,2 mol)
y se agitó la reacción a 0ºC durante 1 hora. Se retiró el baño de
hielo y se dejó la reacción a temperatura ambiente durante 18 horas.
Se retiró el disolvente a vacío y se redisolvió el residuo en
metanol para purificación por HPLC. Se purificó el residuo mediante
pasada a través de una columna C-18 con 50% de
acetonitrilo/agua con 0,1% de TFA para retirar más subproductos
lipófilos. Se purificaron los picos polares con 10% de
acetonitrilo/agua con 0,1% de TFA. La liofilización proporcionó 57,8
g (98% de rendimiento) de sal de ácido trifluoroacético del
pentapéptido puro (I-3). EM FAB: 653,3 (M+1).
Se añadió bicarbonato de sodio sólido en exceso a
una solución enfriada en baño de hielo de I-3 (50,3
g, 66 mmol) en agua (200 ml) y tetrahidrofurano (100 ml) hasta que
no apareció formación de espuma adicional y a pH > 8. Se añadió
cloruro de carbobenciloxi (10 ml, 70 mmol) y se monitorizó la
reacción mediante HPLC (25% de AcN/agua, 0,1% de TFA, 230 nm). Se
monitorizó el pH y se añadió ocasionalmente más bicarbonato de sodio
para mantener básica la solución. Después de 1 hora, se completó la
reacción y se retiró el disolvente a vacío. Se suspendió el residuo
en metano, se retiraron los sólidos inorgánicos mediante filtración
y se pasó la solución a través de una HPLC preparativa (25% de
metanol/agua). La retirada de disolventes proporcionó 25,2 g (49% de
rendimiento) de I-4 en forma de una espuma blanca.
EM FAB= 787,38 (M+1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron el compuesto I-4
(25,2 g, 32 mmol), imidazol (20,6 g, 303 mmol) y cloruro de
terc-butildimetilsililo (45,6 g, 303 mmol) en
dimetilformamida (250 ml) siguiendo la reacción por TLC (25% de
acetato de etilo/hexano). Después de 6 horas, se retiró el
disolvente a vacío, se suspendió el residuo y se sometió a
sonicación en éter. Se lavó la solución de éter con HCl 1 N, se secó
sobre MgSO_{4} y se redujo a vacío, proporcionando una espuma. Se
purificó el producto bruto mediante cromatografía ultrarrápida (600
g de sílice, 25% de acetato de etilo/hexano), proporcionando 32,9 g
(70% de rendimiento) de una espuma blanca. Los datos de RMN fueron
consistentes con la estructura de 1-5. EM FAB=
1472,9 (M).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el compuesto I-5
(32,9 g, 22,3 mmol) en acetonitrilo (250 ml) y tetrahidrofurano (50
ml). Se añadieron dicarbonato de di-terc-butilo (16,1 g, 73,6
mmol) y dimetilaminopiridina (299 mg, 2,2 mmol) con agitación. Se
siguió la reacción mediante TLC (20% de acetato de etilo/hexano) y
se añadieron 3 g adicionales de dicarbonato de di-terc-butilo
después de 2 horas. Después de 2,5 horas adicionales, se añadieron
varios ml de ácido acético para inactivar la dimetilaminopiridina.
Se retiró el disolvente a vacío manteniendo la temperatura por
debajo de 40ºC. Se purificó por cromatografía el residuo (500 g de
sílice, 15% de acetato de etilo/hexano), proporcionando 33,6 g (89%
de rendimiento) de una espuma blanca. Los datos de RMN fueron
consistentes con la estructura de I-6. EM FAB=
1672,0 (M).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron NaHCO_{3} (690 mg, 8,25 mmol) e
isotiocianato de fenilo (0,99 ml, 8,25 mmol) a una solución del
compuesto pentapeptídico I-3 (5,75 g, 7,50 mmol) en
DMF anhidra (200 ml), y la reacción se agitó a temperatura ambiente
durante 36 horas. Se retiraron los sólidos mediante filtración y se
concentró el filtrado a vacío. Se disolvió el aceite resultante en
TFA (70 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora,
seguido de la retirada del disolvente a vacío. Los sólidos
resultantes se trataron con agua (150 ml), se sometieron a
sonicación y se retiraron los materiales insolubles mediante
filtración. La HPLC en fase inversa del filtrado (elución con 4% de
AcN/0,1% de TFA/H_{2}O) seguido de liofilización proporcionó 3,20
g de un sólido blanco esponjoso, 64% de rendimiento. El espectro de
RMN-^{1}H (300 MHz) fue consistente con la
estructura de 1-7. EM FAB (M^{+} de base libre)=
552.
El ejemplo 1 ilustra las condiciones de reacción
generales para convertir el intermedio pentapeptídico
(I-6) en un hexapéptido cíclico análogo de un
compuesto de tipo equinocandina.
Se agitó durante una noche una solución de
N-\alpha-BOC-N-\gamma-(2-cloro-CBZ)-L-ornitina
(480 mg, 1,2 mmol), N-hidroxisuccinimida (138 mg, 1,2 mmol) y
diciclohexilcarbodiimida (247 mg, 1,2 mmol) en 4 ml de
tetrahidrofurano para formar el éster activo. Se añadió una solución
de I-6 (1,0 g, 0,598 mmol) en etanol (5 ml) a una
suspensión de 10% de Pd/C (250 mg) en 5 ml de etanol seguido de 10
ml de ácido acético glacial. Se puso la mezcla en atmósfera de
bombona de H_{2} y después de 1 hora había desaparecido el
material de partida. Se retiró el catalizador mediante filtración y
se redujo cuidadosamente la solución a alto vacío, manteniendo la
temperatura por debajo de 40ºC. Se disolvió el aceite resultante en
éter y se añadió la solución de éster activo en tetrahidrofurano
anteriormente preparada, seguido de trietilamina en exceso hasta que
la solución se alcalinizó para papel pH. Después de agitar durante 2
horas, se extrajo la solución con una solución saturada de
NaHCO_{3} seguido de una solución diluida de HCl y después otra
porción de solución saturada de NaHCO_{3}. Se secó la fase
orgánica sobre MgSO_{4} y se redujo a vacío, proporcionando 0,85 g
del producto bruto. La purificación mediante cromatografía
ultrarrápida (25% de acetato de etilo/hexano) proporcionó 0,53 g del
producto acoplado E1-1 (47% de rendimiento). Los
datos de RMN fueron consistentes con la estructura de
E1-1. FAB EM= 1922,2 (M+1).
Se dispuso una solución de E1-1
(0,53 g, 0,27 mmol) en etanol/ácido acético (10 ml de cada uno) con
Pd/C al 10% (200 mg) en atmósfera de bombona de hidrógeno. Después
de 2 horas, la TLC (30% de acetato de etilo/hexano) indicó una
reacción terminada. Se retiró el catalizador mediante filtración y
se redujo el disolvente a vacío a 40ºC hasta que el residuo fue un
aceite espeso. Se disolvió el residuo en etiléter (150 ml) y se
añadió trietilamina en exceso hasta que la solución se alcalinizó
para papel pH (\sim2 ml). Después de 18 horas, la TLC indicó un
punto de producto único. Se retiró el disolvente a vacío y se
purificó el residuo sobre una columna ultrarrápida, proporcionando
343 mg de un sólido blanco (81% de rendimiento). Los datos de RMN
fueron consistentes con la estructura de E1-2. EM
FAB = 1536,0 (M+1).
Se disolvió el compuesto E1-2
(510 mg, 0,322 mmol) en 5 ml de ácido trifluoroacético a 0ºC.
Después de 0,5 h, se añadió agua (0,5 ml) y se agitó la mezcla
durante 0,5 horas más. Se retiró el disolvente a vacío y se disolvió
el residuo en HCl 1 N (2 ml) y tetrahidrofurano (2 ml). Se refrigeró
la solución durante 48 horas, después de lo cual el análisis por
HPLC (15% de AcN/agua, 230 nm) mostró un pico de producto único. Se
retiró el disolvente a alto vacío, proporcionando un residuo de
espuma que se disolvió en dimetilformamida (8 ml). Se añadieron el
éster activo de terfenilhidroxibenzotriazol (191 mg, 0,4 ml) y
trietilamina (0,2 ml, 1,4 mmol) a la solución. Después de 4 horas,
la HPLC (60% de AcN/agua, 230 nm) mostró la conversión completa en
un nuevo pico de producto. Se retiró el disolvente a alto vacío y se
purificó mediante HPLC preparativa utilizando las condiciones
analíticas. La retirada de disolvente de las fracciones puras
proporcionó 238 mg (66% de rendimiento) de un sólido blanco. Los
datos de RMN fueron consistentes con la estructura de
E1-3. EM FAB calculado para
C_{58}H_{74}N_{7}O_{14} 1092,5294; encontrado 1092,5301
(M).
Los siguientes ejemplos proporcionan
ilustraciones adicionales de la conversión de intermedios clave
(1-6) en un análogo hexapeptídico cíclico. De manera
similar, se convirtió I-6 en cada uno de los
siguientes péptidos cíclicos:
El acoplamiento con
N\alpha-BOC-N\delta-CBZ-D-ornitina
y posterior ciclación proporcionó 63,9 mg de E1-4
(anillo de 21 miembros). EM FAB calculado para
C_{58}H_{74}N_{7}O_{14} 1092,5294; encontrado:
1092,5280.
El acoplamiento con
N\alpha-BOC-N\varepsilon-CBZ-L-lisina
y posterior ciclación proporcionó 44,1 mg de E1-5
(anillo de 22 miembros). EM FAB calculado para
C_{59}H_{76}N_{7}O_{14} 1106,5450; encontrado:
1106,5464.
El acoplamiento con ácido
N\alpha-FMOC-N\delta-CBZ-L-2,4-diaminobutírico
y posterior ciclación proporcionaron 65,0 mg de E1-6
(anillo de 20 miembros). EM FAB calculado para
C_{57}H_{72}N_{7}O_{14}= 1078,5137; encontrado:
1078,5128.
El acoplamiento con ácido
N\alpha-BOC-N\beta-CBZ-L-2,3-diaminopropiónico
y posterior ciclación proporcionaron 25,5 mg de E1-7
(anillo de 19 miembros). EM FAB calculado para
C_{56}H_{70}N_{7}O_{14}: 1064,4981; encontrado:
1064,4994.
La Tabla 1 resume los datos de actividad para los
compuestos E1-3 a E1-7 en
comparación con el siguiente compuesto de equinocandina
semisintético comparativo C1, que ha demostrado actividad
antifúngica in vitro e in vivo. En un modelo de múrido
de recuperación de órganos, el compuesto C1 redujo
significativamente el número de A. fumigatus recuperados de
los riñones y fue tan eficaz como la anfotericina B basándose en
mg/kg cuando ambos se administraron por vía intraperitoneal. En un
modelo de Pneumocystitis carinii, el compuesto C1 redujo el
número de quistes en los pulmones de ratas inmunosuprimidas
gravemente infectadas en más de un 99% cuando se administró por vía
oral a 5 mg/kg una vez al día durante 4 días. La administración
profiláctica oral de 1 mg/kg dos veces al día durante 4 semanas dio
como resultado una reducción de >90% de todas las formas del
ciclo vital. (Véase Turner, W.W., y M.J. Rodríguez, Current
Pharmaceutical Design, 1996, 2, pág. 214).
Se determinaron in vitro la actividad
antifúngica de los compuestos comparativo y de ensayo obteniendo la
concentración mínima inhibitoria (CMI) del compuesto utilizando un
ensayo de dilución en agar estándar o un ensayo de difusión en
disco.
El ejemplo 2 ilustra la conversión del intermedio
I-6 en un análogo hexapeptídico azacíclico de un
compuesto de tipo equinocandina.
Se utilizó el siguiente procedimiento descrito en
Baldwin y Flinn, Tetrahedron Lett. 26 (31), 3605,
(1987) para preparar E2-1. Se trató una suspensión
de L-homoserina (5 g, 42 mmol) en 20 ml de agua con
bicarbonato de sodio sólido (3,5 g, 42 mmol). Se agitó la mezcla a
temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Se añadió
una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (anhídrido de
BOC) (13,75 g, 63 mmol) en 20 ml de p-dioxano a la mezcla, y
después se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante
aproximadamente 60 horas. Se redujo la solución homogénea resultante
a vacío, proporcionando un aceite incoloro. Se añadió una solución
de bromuro de bencilo (10,8 g, 63 mmol) en 50 ml de dimetilformamida
al residuo. Se añadieron otros 1,8 g (0,5 eq. más) de bicarbonato de
sodio sólido a la reacción, y se dejó agitar la mezcla a temperatura
ambiente durante una noche. Se monitorizó la reacción mediante
cromatografía en capa fina (cloroformo/metanol 1:1, más 1 gota de
ácido acético glacial, desarrollado utilizando tinción con TDM). Se
retiraron los productos volátiles a vacío y se añadió acetato de
etilo al residuo resultante. Se lavó la fase orgánica con agua (2
veces) y después con salmuera. Se secó la fase orgánica sobre
sulfato de sodio, se filtró y se concentró, proporcionando 14,7 g de
un aceite amarillo claro. Se disolvió el residuo en 50 ml de
dimetilsulfóxido. Se añadió trietilamina (12,7 g, 126 mmol) y se
enfrió la mezcla en un baño de hielo. Se añadió con agitación una
suspensión de complejo de trióxido de azufre/piridina (20 g, 126
mmol) en 50 ml de dimetilsulfóxido. Se retiró el baño de hielo y se
dejó calentar la mezcla hasta temperatura ambiente. Después de
aproximadamente 10 minutos, se vertió la mezcla de reacción en 200
ml de agua con hielo. Se extrajo la fase acuosa dos veces con
acetato de etilo, se lavó el extracto de acetato de etilo una vez
con bisulfato de sodio 0,1 N, una vez con agua y después finalmente
con salmuera. Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se
filtró y se concentró a vacío, proporcionando un aceite amarillo. La
cromatografía de purificación en columna de gel ultrarrápido
(aproximadamente 250 g, 30% de acetato de etilo/hexano) proporcionó
11,1 g (86%) de un aceite amarillo claro. Los datos de RMN y
análisis elemental (C, H, N) fueron consistentes con la estructura
de E2-1. EM (FD+)= 308.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el compuesto E2-1 (4
g) en 50 ml de metanol y se enfrió después en un baño de hielo. Se
introdujo una ligera capa de HCl gaseoso sobre la solución con
agitación (aproximadamente se dejó entra gas durante
2-3 segundos) y se dejó continuar agitando la
solución en frío. Se monitorizó la reacción mediante TLC (30% de
acetato de etilo/hexano, tinción con CAM). Se añadieron cantidades
adicionales de HCl gaseoso según fuera necesario para conducir la
reacción hasta su terminación. Después de aproximadamente 2 horas,
la reacción parecía haber terminado. Todavía fría, se inactivó la
reacción añadiendo bicarbonato de sodio sólido y manteniendo el pH
ligeramente básico. Se retiraron los productos volátiles a vacío. Se
añadió éter al residuo. Se lavó la fase de éster una vez con
bicarbonato de sodio saturado. La fase acuosa se volvió a extraer
con éter. Se lavaron después los extractos combinados de éter una
vez con salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y
se concentraron a vacío, proporcionando 4,6 g (100%) de un aceite
transparente incoloro. Los datos de RMN y análisis elemental (CHN)
fueron consistentes con la estructura de E2-2. EM
(FD+)= 354 (M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el compuesto E2-2
(4,2 g, 11,9 mmol) en 50 ml de acetato de etilo. Se hizo el vacío/se
purgó la solución con nitrógeno 3 veces, después se añadieron 1,9 g
de catalizador paladio sobre carbón al 5%. Se volvió a hacer el
vacío en el matraz y después se introdujo hidrógeno en el matraz. Se
monitorizó la reacción mediante TLC (40% de acetato de etilo/hexano)
y después de aproximadamente 2 horas se terminó la reacción. Se
retiró el hidrógeno a vacío, se purgó la solución con nitrógeno, se
añadió auxiliar de filtración Celite, se agitó, se filtró a través
de un pequeño lecho de Celite en un embudo de vidrio sinterizado, se
aclaró con acetato de etilo y se concentró el filtrado a vacío
proporcionando 3,1 g (100%) de un aceite incoloro. Los datos de RMN
fueron consistentes con la estructura de E2-3. EM
(FD+)= 264 (M+H), análisis elemental (CHN): % teórico (C 50,18, H
8,04, N 5,32). % observado: (C 51,14, H 7,56, N 5,65).
Se disolvió el compuesto I-6 en 5
ml de etanol y se añadió a una suspensión de 200 mg de paladio sobre
carbón al 10% en 10 ml de etanol (todo bajo atmósfera de nitrógeno).
Se añadió ácido acético glacial (2 ml) y después se introdujo una
atmósfera de hidrógeno mediante una bombona.
Mientras tanto, se disolvió el compuesto
E2-3 (0,2 g, 0,76 mmol) en 2 ml de tetrahidrofurano
(Sure Seal, o recién destilado a partir de hidruro de litio y
aluminio), se añadieron 96 mg (0,84 mmol) de
N-hidroxisuccinimida, seguido de 172 mg (0,84 mmol) de
diciclohexilcarbodiimida. Se agitó la mezcla de reacción a
temperatura ambiente. Después de aproximadamente 10 minutos, se
observó un gran precipitado. Se dejaron agitar ambas reacciones a
temperatura ambiente durante aproximadamente 2 a 3 horas y se
monitorizaron mediante TLC (25% de acetato de etilo/hexano, tinción
con CAM).
Después de la terminación de la reacción de
hidrogenación, se purgó la mezcla con nitrógeno, se añadió auxiliar
de filtración Celite, se agitó y después se filtró a través de un
lecho de Celite en un embudo de vidrio sinterizado. Se concentró el
filtrado a vacío, no dejando subir la temperatura del baño por
encima de 45ºC. Se disolvió el residuo en 8 ml de tetrahidrofurano y
después se añadieron aproximadamente 2 ml de trietilamina para
llevar el pH a entre 6 y 7. Se filtró directamente en este
recipiente el éster activo recién formado a partir de la segunda
reacción y se añadió suficiente trietilamina para mantener básica la
mezcla de reacción (aproximadamente pH 9-10). Se
agitó la reacción a temperatura ambiente durante una noche. La
reacción se monitorizó mediante TLC (25% de acetato de etilo/hexano,
tinción con CAM).
Se retiraron los productos volátiles a vacío, se
añadió cloroformo al residuo, se lavó la fase orgánica una vez con
ácido clorhídrico 1 N, una vez con una solución saturada de
bicarbonato de sodio y una vez más con ácido clorhídrico 1 N, y
finalmente una vez con salmuera. Se secó la solución sobre sulfato
de sodio, se filtró y se concentró a vacío, proporcionando 1 g de
E2-4 en forma de una espuma blanca. Se utilizó el
material sin purificación adicional en la reacción posterior. Sin
embargo, la reacción puede realizarse utilizando cromatografía de
purificación en gel de sílice ultrarrápido (aproximadamente 100 g de
sílice, 20% de acetato de etilo/hexano). Rendimiento: 395 mg (37%)
de una espuma blanca. Los datos de RMN fueron consistentes con la
estructura de E2-4. EM (FAB)= 1726
(M-terc-butilo).
Se cargó un matraz con el compuesto
E2-4 (374 mg, 0,21 mmol) y 8 ml de tetrahidrofurano.
Se añadió hidrato de hidrazina (13,6 mg, 0,27 mmol, 13,6 \mul) y
se agitó a temperatura ambiente. Se monitorizó la reacción mediante
TLC (25% de acetato de etilo/hexano, tinción con CAM). Después de
aproximadamente 15 minutos, se retiraron los productos volátiles
proporcionando una espuma blanca. La cromatografía en columna de gel
de sílice ultrarrápido (aproximadamente 25 g, 25%\rightarrow50% de
acetato de etilo/hexano) proporcionó 250 mg (75%) de una espuma
blanca. Los datos de RMN fueron consistentes con la estructura de
E2-5. EM (FAB)= 1541 (M-terc-butilo).
Se suspendió cloruro estannoso (1,5 g) y
bicarbonato de sodio sólido (400 mg) en 800 ml de cloruro de
metileno. Se agitó la mezcla durante aproximadamente 15 minutos a
temperatura ambiente. Se añadió una solución del compuesto
E2-5 (3,2 g) en 100 ml de cloruro de metileno. Se
aclaró el envase que contenía el compuesto E2-5 con
otros 100 ml de disolvente y se añadieron al recipiente de reacción.
Se monitorizó la reacción mediante TLC (40% de acetato de
etilo/hexano, tinción con CAM). Después de aproximadamente 3 horas,
se separaron por filtración los sólidos residuales y se concentró el
filtrado a vacío, proporcionando 3 g (100%) de E2-6
en forma de un sólido amarillo pálido. Todo intento de purificación
fracasó a causa de la inestabilidad. EM (FAB)= 1534 (ión
original).
Se disolvió el compuesto E2-6 (6
g, 3,9 mmol) en 400 ml de tetrahidrofurano, y se añadieron 425 mg
(6,76 mmol) de cianoborohidruro de sodio seguido de 1 ml de ácido
acético glacial. Se dejó agitar la mezcla a temperatura ambiente
monitorizando mediante TLC (40% de acetato de etilo/hexano, tinción
con CAM). Después de aproximadamente 2 horas, se retiraron los
productos volátiles a vacío, se añadió acetato de etilo al residuo,
se lavó dos veces con agua, una vez con salmuera, se secó sobre
sulfato de sodio, se filtró y se concentró a vacío, proporcionando
5,2 g de una espuma blanca. Se disolvió el sólido en 125 ml de
metanol y se dejó agitar a temperatura ambiente durante 6 días. Se
retiraron los productos volátiles a vacío, proporcionando 4,8 g de
una espuma blanca. La cromatografía en columna de gel de sílice
ultrarrápida (aproximadamente 200 g, 25% \rightarrow 35% de
acetato de etilo/hexano) proporcionó 2,2 g (37%) de una espuma
blanca. Los datos de RMN fueron consistentes con la estructura de
E2-7. EM (FAB+)= 1537 (M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron una solución del compuesto
E2-7 (650 mg, 0,4 mmol) en 15 ml de tetrahidrofurano
y bicarbonato de sodio sólido (67 mg) a un recipiente de reacción
equipado con un septo de goma y una barra de agitación. Se burbujeó
la solución con nitrógeno y se agitó. Se enfrió la mezcla en un baño
de hielo y se añadió cloroformiato de bencilo (144 mg, 0,8 mmol, 12
\mul) mediante jeringuilla. Se agitó la mezcla en frío durante
aproximadamente 1 hora. Se retiró el baño de hielo y se dejó agitar
la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas. Se
monitorizó la reacción mediante TLC (20% y 40% de acetato de
etilo/hexano, tinción con CAM). Se retiraron los productos volátiles
a vacío. Se disolvió el residuo en éter, se lavó dos veces con agua,
una vez rápidamente con ácido clorhídrico diluido, una vez con una
solución saturada de bicarbonato de sodio, una vez con salmuera, se
secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a vacío,
proporcionando 700 mg de una espuma blanca. La cromatografía en
columna de gel de sílice ultrarrápido (35 g de sílice, 20% de
acetato de etilo/hexano) proporcionó 460 mg (65%) de una espuma
blanca. Los datos de RMN fueron consistentes con la estructura de
E2-8. EM (FAB)= 1670 (ión original).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el compuesto E2-8
(1,2 g, 0,72 mmol) en ácido trifluoroacético frío (10 ml), se
dispuso en un baño de hielo y se agitó durante aproximadamente 1,5
h. Se añadió agua fría (5 ml) y se continuó la agitación en el baño
de hielo durante aproximadamente 1 h. Se retiraron los productos
volátiles a vacío, se añadieron 5 ml de tetrahidrofurano y 5 ml de
ácido clorhídrico 1 N y se agitó durante una noche a temperatura
ambiente.
Se retiraron los productos volátiles a vacío, se
añadió tolueno al residuo y después se evaporó. Se repitió dos veces
más el procedimiento para retirar el ácido trifluoroacético en
exceso. Se añadió éter al residuo y después se sometió a sonicación,
proporcionando un sólido blanco. Se separó por filtración el éter y
se aclaró el residuo varias veces con éter. Se secó el residuo a
alto vacío, proporcionando 660 mg (100%) de un sólido blanco. El
análisis por HPLC-FI (C-18 Bondapak,
AcN/agua/TFA al 1% 70:20:10, 230 nm) muestra que el material es un
97% puro. Los datos de RMN fueron consistentes con la estructura de
E2-9. EM (FAB)= 885,5 (M+H).
Se disolvió el compuesto E2-9
(600 mg, 0,68 mmol) en 10 ml de dimetilformamida y se añadió
suficiente diisopropiletilamina para alcalinizar la solución para
papel pH (aproximadamente 0,5 ml). Se añadió éster de
hidroxibenzotriazol activo de la cadena lateral terfenilo (388 mg,
0,81 mmol) al recipiente de reacción y se dejó agitar a temperatura
ambiente durante una noche. Se monitorizó la reacción mediante
HPLC-FI (AcN/agua 60:40, 230 nm).
Se retiró el disolvente a vacío, y se añadió una
mezcla de metanol/acetonitrilo 1:1 al residuo resultante, seguido de
agitación y después filtración. Se suspendió el sólido blanco
resultante en éter, se agitó, se filtró y se repitió el proceso. Se
realizó el mismo procedimiento utilizando cloruro de metileno,
después finalmente una vez más con éter. Se secó el residuo a vacío,
proporcionando 735 mg (88%) de un sólido blanco, compuesto
E2-10(a). EM (FAB)= 1227,6 (ión
original).
Se suspendió el sólido blanco (632 mg, 0,5 mmol)
en ácido acético glacial (100 ml) y se sometió a hidrogenación
catalítica en atmósfera de bombona de hidrógeno durante una noche
(100 mg de paladio sobre carbón al 10%). Se monitorizó la reacción
mediante HPLC en fase inversa (C-18 Bondapak,
AcN/agua/TFA al 1% 60:30:10, 230 nm). Se purgó el recipiente de
reacción con nitrógeno, se añadió auxiliar de filtración Celite, se
agitó, se filtró a través de un lecho de Celite en un embudo de
vidrio sinterizado, se lavó el catalizador con una mezcla de
metanol/AcN/agua 1:1:1 y se concentró el filtrado hasta sequedad. Se
añadió tolueno y se dejó evaporar después hasta sequedad,
proporcionando 440 mg (81%) de un sólido blanco, compuesto
E2-10(b). EM (FAB)= 1093,5 (ión
original).
El siguiente procedimiento ilustra una
preparación típica para las alquilaciones. Se disolvió o suspendió
el compuesto E2-10(b) (100 mg, 0,086 mmol) en
10 ml de dimetilformamida. Se añadieron dos equivalentes del
correspondiente aldehído (para formaldehído utilizar 5,2 mg (15
\mul)) (para acetaldehído utilizar 7,6 mg (10 \mul) y para
propionaldehído utilizar 10 mg (12,5 \mul), todos 0,173 mmol),
seguido de suficiente ácido acético glacial (aproximadamente
3-4 gotas) para hacer ácida la mezcla. Se añadió
cianoborohidruro de sodio (11 mg, 0,173 mmol) y la mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante una noche. Se monitorizó la reacción
mediante HPLC en fase inversa (C-18 Bondapak,
AcN/agua/TFA al 1% (55:35:10), 280 nm). Se inactivó la reacción con
agua para obtener una solución transparente y un material gomoso
blanco en el fondo del matraz. Se retiraron los disolventes a vacío,
se añadió acetonitrilo, se filtró y se lavó con éter, obteniéndose
un polvo blanco (150 mg para metilo, 250 mg para etilo y 250 mg para
propilo). Se aislaron todos los materiales alquilados utilizando
HPLC-FI preparativa (AcN/agua/HCl al 1% 50:40:10,
230 nm para metilo y etilo y AcN/agua/HCl al 1% 55:35:10, 230 nm,
para propilo).
Rendimiento: 64 mg para el derivado metilo
E2-11(a) que tiene un EM (FAB)= 1107,54 (masa
exacta).
59 mg para el derivado etilo
E2-11(b) que tiene un EM (FAB)= 1121,55 (masa
exacta).
73 mg para el derivado propilo
E2-11(c) que tiene un EM (FAB)= 1135,57 (masa
exacta).
Se disolvió CBz-glicina (2 g, 9,6
mmol) en 25 ml de tetrahidrofurano, se añadió pentafluorofenol (2,2
g, 11,9 mmol) seguido de clorhidrato de
1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida
(EDAC) (2,2 g, 11,5 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente
en atmósfera de nitrógeno. Se monitorizó la reacción mediante TLC
(40% de acetato de etilo/hexano, tinción con UV y CAM). Después de
aproximadamente 1 hora, se retiró el disolvente a vacío, se disolvió
el residuo en cloruro de metileno, se lavó la fase orgánica una vez
con una solución de bisulfito de sodio 1 M, tres veces con hidróxido
de sodio 1 N y finalmente una vez con salmuera. Se secó la fase
orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a vacío,
proporcionando 3,3 g (92%) de un sólido rosa claro. El material
tenía datos de RMN consistentes.
El compuesto E2-7 (700 mg, 0,45
mmol) se disolvió en 15 ml de tetrahidrofurano. Se añadió el éster
activo anterior (504 mg, 1,3 mmol), más unas pocas gotas de
trietilamina. Se calentó la mezcla casi a reflujo durante
aproximadamente 4 horas, después se enfrió a temperatura ambiente y
se dejó agitar durante una noche. Se retiraron los productos
volátiles a vacío, se añadió éter al residuo, se lavó dos veces con
hidróxido de sodio 1 N, una vez con salmuera, se secó sobre sulfato
de sodio, se filtró y se concentró a vacío, proporcionando 1,1 g de
una espuma blanca. La purificación en columna de gel de sílice
ultrarrápido (30% de acetato de etilo/hexano 20:80) proporcionó 0,75
g (95%) de una espuma blanca. El material tenía datos de RMN
satisfactorios. EM (FAB): 1727,9 (ión original).
Se retiraron los grupos protectores sililo y BOC
siguiendo el método anterior para la preparación del compuesto
E2-9. Se monitorizó la reacción mediante
HPLC-FI (AcN/agua/TFA al 1% 25:65:10, 230 nm).
Rendimiento= 490 mg de un polvo blanco.
La cadena lateral terfenilo se acopló con el
producto anterior según el método para la preparación del compuesto
E2-10(b). Cantidades de reacción: 490 mg del
compuesto anterior, 260 mg (0,544 mmol) del éster activo de
terfenilo, 10 ml de dimetilformamida, y suficiente
diisopropiletilamina para alcalinizar la reacción. La reacción fue
seguida por HPLC-FI (AcN/agua/TFA al 1% 25:65:10
para el material de partida, 230 nm y AcN/agua/TFA al 1% 60:30:10
para el producto, 280 nm). Se retiró el disolvente a alto vacío,
proporcionando un residuo blanco gomoso. La trituración con éter (2
lavados) proporcionó 800 mg de un polvo amarillo pálido.
Se sometió el producto anterior a las mismas
condiciones de hidrogenólisis que para el compuesto
E2-10(a). Cantidades de reactivos: 400 mg de
paladio sobre carbón al 10%, 100 ml de ácido acético glacial. La
reacción durante una noche proporcionó 600 mg de un sólido
blanquecino. Se aisló el producto utilizando HPLC-FI
(AcN/agua/TFA al 1% (50:40:10), 280 nm).
Rendimiento= 188 mg de un polvo blanco. Los datos
de RMN fueron consistentes con la estructura de
E2-12. EM (FAB)= 1150,54 (masa exacta).
Siguiendo el procedimiento anterior para la
preparación del compuesto E2-12, se preparó el éster
activo del ácido
L-di-CBz-diaminopropiónico.
Las estequiometrías de reacción fueron: ácido
L-di-CBz-diaminopropiónico
- 581 mg (1,56 mmol), pentafluorofenol - 344 mg (1,87 mmol),
clorhidrato de
1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida
(EDAC) - 360 mg (1,87 mmol), tetrahidrofurano - 12 ml. Sistema de
TLC: cloroformo/metanol/ácido acético glacial 75:25:gota, para
material de partida; 40% de acetato de etilo/hexano, tinción con TDM
para el producto. El mismo procesamiento proporcionó 720 mg (86%) de
un sólido blanco. El material tenía datos de RMN satisfactorios.
De nuevo, después del procedimiento anterior para
acoplar el éster activo (710 mg, 1,32 mmol) al compuesto
E2-7 (800 mg, 0,52 mmol) y calentar a reflujo
durante 2 días, un procesamiento estándar proporcionó 1,1 g de una
espuma blanca. La cromatografía en columna de gel de sílice
ultrarrápido (100 g de sílice, 20% de acetato de etilo/hexano)
proporcionó 0,56 g (57% de rendimiento) de una espuma blanca. EM
(FAB)= 1891 (ión original).
Se retiraron los grupos protectores sililo y BOC
siguiendo el procedimiento anterior para la preparación del
compuesto E2-9. Se monitorizó la reacción mediante
HPLC-FI (AcN/agua/TFA al 1% 50:40:10, 230 nm).
Rendimiento= 550 mg.
Se acopló la cadena lateral terfenilo al producto
anterior según el método para la preparación del compuesto
E2-10(b). Cantidades de reacción: 550 mg del
compuesto anterior, 239 mg (0,5 mmol) del éster de terfenilo activo,
10 ml de dimetilformamida y suficiente diisopropiletilamina para
alcalinizar la reacción. La reacción fue seguida por
HPLC-FI (AcN/agua/TFA al 1% 70:20:10 para el
material de partida, 230 nm, y AcN/agua/TFA al 1% 40:50:10 para el
producto, 280 nm). Se retiró el disolvente a alto vacío,
proporcionando un residuo blanco gomoso. La trituración con éter (2
lavados) proporcionó 850 mg de un polvo blanquecino.
Se sometió el producto anterior a las mismas
condiciones de hidrogenólisis que para el compuesto
E2-10(a). Cantidades de reactivos: 400 mg de
paladio sobre carbón al 10%, 100 ml de ácido acético glacial. La
reacción durante una noche proporcionó 580 mg de un sólido
blanquecino. Se aisló el producto utilizando HPLC-FI
(gradiente de AcN/agua/TFA al 1% (esquema de elución 45:45:10
\rightarrow 55/10, 280 nm). Se aislaron dos productos separados,
que tenían ambos el mismo peso molecular. No se determinó nunca
cuáles eran las estereoquímicas relativas de los dos compuestos. El
rendimiento de un isómero de E2-13 fue de 76 mg y el
rendimiento del otro isómero de E2-13 fue de 116 mg.
EM (FAB)= 1179,6 (ión original) para ambos.
La Tabla 2 resume los datos de actividad para los
compuestos E2-9 a E2-13 en
comparación con el compuesto comparativo semisintético de
equinocandina C1. Se utilizaron los mismos procedimientos de ensayo
que se describen en el ejemplo 1 anterior.
El ejemplo 3 ilustra adicionalmente la inserción
de una nueva unidad para proporcionar un análogo de un compuesto de
tipo equinocandina.
Se preparó CbzNHCH_{2}CH_{2}SH como se
describe en I. Shinkai, T. Liu, R. Reamer, M. Sletzinger,
Synthesis, 924, 1980.
Se preparó éster metílico de
N-BOC-O-toluenosulfonilserina
como se describe en N.A. Sasaki, C. Hashimoto, P.A. Potier,
Tetrahedron Lett., 28, 6069-6072,
1987.
Se trituró hidruro de sodio (72 mg, 1,8 mmol,
suspensión al 60% en aceite mineral) con hexanos en atmósfera de
nitrógeno en un matraz de fondo redondo de 3 bocas. Se dispuso el
matraz en un baño a 0ºC y se añadió una solución de
CbzNHCH_{2}CH_{2}SH (470 mg, 1,87 mmol, 85% de pureza) en DMF (5
ml). Se agitó la mezcla resultante a 0ºC durante 20 min, lo que dio
como resultado una solución incolora. Se añadió éster metílico de
N-BOC-O-toluenosulfonilserina
(671 mg, 1,8 mmol) en forma de un sólido y se lavó en el matraz con
2 ml adicionales de DMF. Se agitó la mezcla resultante a 0ºC durante
3 horas, después se vertió en agua y se extrajo dos veces con
acetato de etilo. Se lavaron los extractos orgánicos combinados con
agua, solución de hidróxido de sodio 1 N, agua y salmuera, después
se secaron sobre MgSO_{4} y se concentró a vacío, proporcionando
900 mg de un aceite. La cromatografía radial eluyendo con acetato de
etilo al 25% \rightarrow 50% en hexanos proporcionó 570 mg (76%)
del propiolato de
(R)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]-3-[(2'-N-benciloxicarbonilamino)etanotio]metilo
deseado. Anal. calculado para C_{19}H_{28}N_{2}O_{6}S, C
55,32, H 6,84, N 6,79; encontrado: C 55,26, H 6,95, N 6,94.
[\alpha]_{D} -1,9º (c= 10).
Se trató el compuesto E3-1 (520
mg, 1,26 mmol) en dioxano (3 ml) con una solución de LiOH 0,5 M (3
ml) y se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Se retiró
el dioxano a vacío y se repartió el residuo entre una solución de
ácido clorhídrico 1 N y acetato de etilo. Se lavó el extracto
orgánico con salmuera, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró a
vacío, proporcionando 500 mg de un aceite incoloro correspondiente
al compuesto E3-2. Anal. calculado para
C_{18}H_{26}N_{2}O_{6}S+0,4 H_{2}O, C: 53,29, H 6,65, N
6,90; encontrado: C 53,61, H 6,82, N 6,85. [\alpha]_{D}=
-0,9º (c= 10). EM: (m+1) 399.
Se disolvió el compuesto E3-2
(0,95 g, 2,38 mmol) en MeOH (15 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadió una
solución de Oxone® (1,77 g, 5,7 mmol) en agua (15 ml) y se agitó la
mezcla resultante a 0ºC durante 1 hora y después a temperatura
ambiente durante una noche. Se retiró el MeOH a vacío y se repartió
el residuo entre acetato de etilo y agua. Se extrajo la fase acuosa
varias veces más con acetato de etilo. Se lavaron los extractos
orgánicos combinados con salmuera, se secaron sobre MgSO_{4} y se
concentraron a vacío, proporcionando 800 mg (78%) de una espuma
incolora correspondiente al compuesto E3-3. Anal.
calculado para C_{18}H_{26}N_{2}O_{8}S, C: 50,22, H 6,09, N
6,51. Encontrado: C 50,13, H 5,86, N 6,45. [\alpha]_{D}=
-7º (c= 10). EM: (m+1) 431.
Se añadió diciclohexilcarbodiimida (76 mg, 0,37
mmol) y 2 ml adicionales de THF a una solución del compuesto
E3-3 (160 mg, 0,37 mmol) y
N-hidroxisuccinimida (43 mg, 0,37 mmol) en THF seco (5 ml).
Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas, después
se enfrió a 0ºC para ayudar a precipitar la diciclohexilurea.
Mientras tanto, se disolvió el
diBOC-CBZ-sililpentapéptido
I-6 (565 mg, 0,337 mmol) en etanol absoluto (10 ml)
y ácido acético glacial (95 ml), se desgasificó y después se añadió
Pd/C al 10% (160 mg) a la mezcla. Se agitó la mezcla en atmósfera de
H_{2} (presión de bombona) durante 3 horas. Se retiró el
catalizador mediante filtración y se concentró el filtrado a vacío
hasta un aceite espeso. Se añadieron THF (10 ml) y ácido acético (1
ml) y se retiraron de nuevo los disolventes a vacío para retirar
todo el etanol residual. Se filtró directamente el éster activo NHS
del compuesto E3-3 preparado anteriormente en el
matraz que contenía el pentapéptido desbloqueado a través de un
embudo de vidrio sinterizado, lavando el DCU precipitado con 3 ml
adicionales de THF. Se alcalinizó la solución resultante para papel
de tornasol mediante la adición gota a gota de trietilamina. Se
agitó después la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas
adicionales, después se diluyó con acetato de etilo, se lavó con una
solución saturada de bicarbonato de sodio y salmuera, después se
secó sobre MgSO_{4} y se concentró a vacío. La cromatografía
ultrarrápida eluyendo con hexano:acetato de etilo:cloruro de
metileno 7:2:1 proporcionó el producto de acoplamiento deseado
E3-4 en forma de una mezcla de isómeros. El isómero
menos polar proporcionó 140 mg que tenían una EM= 1950,9 (m+).
Fracciones mixtas: 224 mg. El isómero más polar proporcionó 155 mg
que tenían una EM= 1951,9 (m+1). Rendimiento total: 519 mg, 78%.
Se repitió esta reacción a escala de 0,6 mmol,
proporcionando 400 mg del producto deseado en forma de una mezcla de
isómeros. Anal. calculado para
C_{93}H_{168}N_{8}O_{22}SSi_{6}, C 57,25, H 8,68, N 5,75;
encontrado: C 57,55, H 8,63, N 5,79. (El estereocentro del ácido
E3-3 racemizó en la reacción de acoplamiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Se desgasificó una solución del compuesto
E3-4 (390 mg, 0,2 mmol, mezcla de diastereómeros) en
etanol absoluto (10 ml) y ácido acético glacial (10 ml), y después
se trató con Pd/C al 10% (390 mg). Se agitó la mezcla en atmósfera
de H_{2} (presión de bombona) durante 2 horas. Se retiró el
catalizador mediante filtración a través de Celite y se concentró el
filtrado a vacío, teniendo cuidado de dejar algo de ácido acético
presente. Se diluyó el residuo con dietiléter (175 ml) y se añadió
trietiamina hasta que la mezcla se alcalinizó para papel tornasol
(fue necesario aproximadamente 1 ml). Se agitó la solución
resultante a temperatura ambiente durante una noche, después se lavó
con una solución de ácido clorhídrico 0,1 N, salmuera, se secó sobre
MgSO_{4} y se concentró a vacío, proporcionando una espuma. La
cromatografía ultrarrápida en gel de sílice eluída con 30% de
acetato de etilo en hexanos proporcionó el material de anillo
cerrado deseado E3-5. El isómero menos polar
proporcionó 105 mg de una espuma que tenía una EM: (m+) 1599,9. El
isómero más polar proporcionó 110 mg de una espuma que tenía una EM=
1599,8 (m+). El rendimiento total fue 215 mg, 67%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el isómero más polar del compuesto
E3-5 (160 mg, 0,1 mmol) en ácido trifluoroacético (5
ml) que se había enfriado a 0ºC. Después de 30 min, se añadió agua
(0,5 ml) y se agitó la mezcla durante 30 min adicionales a 0ºC. Se
concentró la mezcla a vacío, se disolvió el residuo en THF y se
concentró a vacío. Se disolvió el residuo en THF (3 ml), se añadió
una solución de ácido clorhídrico 1 N (1 ml) y se dispuso la mezcla
en frigorífico durante una noche. Se retiró el disolvente a vacío,
después se añadió THF adicional y se reconcentró la mezcla para
separar por destilación azeotrópica el agua. Este tratamiento
proporcionó un sólido blanco. Este sólido blanco se disolvió en DMF
(5 ml) y se añadió el éster activo de terfenilhidroxibenzotriazol
(58 mg, 0,12 mmol) seguido de trietilamina (60 \mul, 0,4 mmol). Se
agitó la solución resultante a temperatura ambiente durante una
noche, después se retiró el disolvente a vacío. Se purificó el
residuo mediante HPLC-FI preparativa (gradiente de
etapas de 50%-70% de AcN en agua durante 45 min). Se analizó el pico
mayoritario mediante HPLC (columna C-18
u-bondpak, 60% de AcN, 0,1% de TFA en agua) y las
fracciones que contenían el material, que eluyeron a los 4 min, se
combinaron y liofilizaron, proporcionando 65 mg (56% de rendimiento)
de E3-6 en forma de un polvo blanco que tenía una
EM= 1156,6 (m+).
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De forma análoga, se convirtió el isómero menos
polar en E3-7 (material eluído en 7 min en las
condiciones analíticas descritas anteriormente), proporcionando 13
mg (11% de rendimiento) del E3-7 deseado. EM FAB
(M), calculado para C_{58}H_{74}N_{7}O_{6}S 1156,4913;
encontrado= 1156,4924.
El siguiente conjunto de ejemplos ilustra la
escisión adicional del pentapéptido lineal a un tetrapéptido y la
posterior inserción de nuevas unidades en la cadena peptídica lineal
antes del cierre.
\vskip1.000000\baselineskip
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Se añadieron PyBOP® (572 mg, 1,1 mmol),
N-Cbz-L-valina (304
mg, 1,21 mmol), diisopropiletilamina (0,57 ml, 3,3 mmol) y DMF
anhidra (1,0 ml) a una solución del compuesto I-7
(732 mg, 1,1 mmol) en THF anhidro (25 ml) para disolver los sólidos
restantes. Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 2
horas, seguido de la retirada de los disolventes a vacío. Se
disolvió el residuo en THF anhidro (40 ml), seguido de la adición de
cloruro de terc-butildimetilsililo (1,66 g, 11,0 mmol) e
imidazol (750 mg, 11,0 mmol). Se agitó la solución a temperatura
ambiente durante 18 horas. Se concentró la reacción a vacío y se
disolvió el residuo en Et_{2}O, se lavó dos veces con HCl 0,1 N,
se secó sobre MgSO_{4} y se retiró el disolvente a vacío. La
cromatografía ultrarrápida (eluyendo con 35% de AcOEt/hexano)
proporcionó 690 mg de producto, 46% de rendimiento. El espectro de
RMN-^{1}H (300 MHz) fue consistente con la
estructura de E4-1. EM FAB (M^{+})= 1356.
Se añadieron anhídrido de
N-terc-Boc (0,24 ml, 1,03 mmol) y dimetilaminopiridina
(7 mg, 0,05 mmol) a una solución del compuesto E4-1
(700 mg, 0,51 mmol) en THF anhidro (0,6 ml) y acetonitrilo (4 ml).
Se agitó la solución durante 3 horas. Después de la retirada de los
disolventes a vacío, la cromatografía ultrarrápida (eluyendo con 17%
de AcOEt/hexano) proporcionó 307 mg de producto, 38% de rendimiento.
El espectro de RMN-^{1}H (300 MHz) fue consistente
con la estructura de E4-2. EM FAB (M^{+} de base
libre)= 1556.
Se añadió el compuesto E4-2 (307
mg, 0,20 mmol) a una solución de Pd/C al 5% (150 mg) en EtOH (15 ml)
y AcOH (15 ml) en atmósfera de N_{2}. Se purgó/llenó la solución
con H_{2} (x8) y se sometió a presión constante de H_{2} durante
2,0 h, después se filtró a través de Celite para retirar el
catalizador. Se concentró la solución a vacío para retirar los
disolventes, se disolvió el residuo en THF anhidro (30 ml), seguido
de la adición de
\alpha-N-terc-Boc-\gamma-N-Cbz-L-ornitina
(80 mg, 0,22 mmol), PyBOP® (103 mg, 0,20 mmol) y
diisopropiletilamina (0,10 ml, 0,59 mmol). Se agitó la reacción a
temperatura ambiente durante 18 h, seguido de la retirada del
disolvente a vacío. La cromatografía ultrarrápida (eluyendo con 30%
de AcOEt/hexano) proporcionó 284 mg de un sólido blanco, 81% de
rendimiento. El espectro de RMN-^{1}H (300 MHz)
fue consistente con la estructura de E4-3. EM FAB
(M^{+} de base libre)= 1771.
Se añadió Pd/C al 5% (150 mg) a una solución
purgada con N_{2} del compuesto E4-3 (279 mg, 0,16
mmol) en EtOH (13 ml) y AcOH (12 ml). La reacción se purgó/llenó con
H_{2} (x10) y se dejó a presión constante de H_{2} durante 2 h,
seguido de retirada del catalizador mediante filtración a través de
Celite y retirada de los disolventes a vacío. Se disolvió el aceite
resultante en Et_{2}O (75 ml) seguido de la adición de
trietilamina (5 ml, 35,9 mmol). Después de 18 h se concentró la
reacción a vacío, y la cromatografía ultrarrápida (eluyendo con 34%
de AcOEt/hexano) proporcionó 96 mg de producto, 43% de rendimiento.
El espectro de RMN-^{1}H (300 MHz) fue consistente
con la estructura de E4-4. EM FAB (M^{+} de la
base libre)= 1420.
Se dispuso en un congelador a 0ºC durante 2 h una
solución del compuesto E4-4 (93 mg, 0,07 mmol) en
TFA enfriado con hielo (2 ml), seguido de la adición de agua
enfriada con hielo (2 ml), y se agitó después en un baño de hielo
durante 2 h. Se concentró la solución a vacío, proporcionando 66 mg
de sólidos blancos, que se disolvieron en THF (1,5 ml) y HCl (1,5
ml, 1,0 N) y se agitaron a temperatura ambiente durante 16 h. Se
añadió tolueno y se concentró la solución a vacío tres veces para
ayudar a la retirada del TFA, proporcionando 44,5 mg de un sólido
blanquecino, 91% de rendimiento. El espectro de
RMN-^{1}H (300 MHz) fue consistente con la
estructura de E4-5. EM FAB (M^{+} de la base
libre)= 748.
Se añadieron diisopropiletilamina (0,03 ml, 0,18
mmol) y el éster activo de hidroxibenzotriazol de la cadena lateral
terfenilo (34 mg, 0,07 mmol) a una solución del compuesto
E4-5 (44 mg, 0,06 mmol) en DMF anhidra (2 ml). Se
agitó la solución a temperatura ambiente durante 40 h. Se retiró el
disolvente a vacío y se trató el residuo con Et_{2}O (10 ml), se
sometió a sonicación y se aisló un sólido marrón mediante
filtración. La HPLC-FI (eluyendo con
30-70% de ACN/0,1% de TFA/H_{2}O) y liofilización
proporcionó 18,7 mg de un sólido blanco, 29% de rendimiento. El
espectro de RMN-^{1}H (300 MHz) fue consistente
con la estructura de E4-6. EM FAB (M^{+} de base
libre)=
1090.
1090.
El ejemplo 5 ejemplifica adicionalmente la
inserción de nuevas unidades en una cadena tetrapeptídica seguido de
cierre de anillo para producir un nuevo péptido cíclico de
estructura de tipo equinocandina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron PyBOP® (547 mg, 1,05 mmol),
N-Cbz-L-tirosina (364 mg,
1,16 mmol), N,N-diisopropiletilamina (0,55 ml, 3,15 mmol) a
una solución del tetrapéptido I-7 (700 mg, 1,05
mmol) en THF anhidro (20 ml). Se agitó la solución a temperatura
ambiente durante 3 h, seguido de la retirada de los disolventes a
vacío. Se utilizó directamente en la siguiente reacción.
Se disolvió el residuo E5-1
anterior en DMF anhidra (10 ml), seguido de la adición de cloruro de
terc-Bu-dimetilsililo (1,90 g, 12,6 mmol) e
imidazol (860 mg, 12,6 mmol), y se agitó la solución a temperatura
ambiente durante 18 h. Se concentró la reacción a vacío y se
disolvió el residuo en Et_{2}O, se lavó dos veces con HCl 0,1 N
frío, una vez con H_{2}O, bicarbonato de sodio acuoso al 10%,
salmuera y se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se retiró el
disolvente a vacío, proporcionando 2,0 g de aceite bruto. Se
purificó mediante cromatografía radial (eluyendo con 35% de
AcOEt/hexanos), proporcionando 700 mg (43% de rendimiento) de
producto. El espectro de RMN-^{1}H (300 MHz) fue
consistente con la estructura de E5-2. EM FAB
(M^{+})= 1534.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió anhídrido de
N-terc-Boc (0,41 ml, 1,78 mmol) en porciones
y dimetilaminopiridina (7 mg, 0,05 mmol) a una solución del
compuesto E5-2 (700 mg, 0,46 mmol) en THF anhidro
(10 ml), y se agitó la solución durante 3 h a temperatura ambiente.
Después de la retirada de los disolventes a vacío, la purificación
mediante cromatografía radial (eluyendo con 20% de AcOEt/hexanos)
proporcionó 460 mg de producto, 58% de rendimiento. El espectro de
RMN-^{1}H (300 MHz) fue consistente con la
estructura de E5-3. EM FAB (M^{+} de la base
libre)= 1735.
Se añadió el compuesto E5-3 (460
mg, 0,27 mmol) a una solución de Pd/C al 10% (270 mg) en EtOH (10
ml) y AcOH (10 ml) en atmósfera de N_{2}. Se purgó/llenó la
solución con H_{2} (x4) y se sometió a presión constante de
H_{2} durante 2,0 h a temperatura ambiente, después se filtró a
través de Celite para retirar el catalizador. Se concentró la
solución a vacío para retirar los disolventes, se disolvió el
residuo en THF anhidro (30 ml), seguido de la adición de éster de
N-hidroxisuccinimida de
\alpha-N-terc-Boc-\gamma-N-Cbz-L-ornitina
(172 mg, 0,37 mmol) y trietilamina hasta pH 8 (\approx5 ml). Se
agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3 h. Se diluyó la
reacción con éter y se lavó con bicarbonato de sodio saturado, HCl
0,1 N, bicarbonato de sodio saturado y se secó sobre sulfato de
magnesio. Se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía radial
(eluyendo con 30% de AcOEt/hexanos) proporcionó 280 mg de un sólido
blanco, 54% de rendimiento. El espectro de
RMN-^{1}H (300 MHz) fue consistente con la
estructura de E5-4. EM FAB (M^{+} de la base
libre)= 1949.
Se añadió Pd/C al 10% (200 mg) a una solución
purgada con N_{2} del compuesto E5-4 (280 mg, 0,14
mmol) en EtOH (10 ml) y AcOH (5 ml). Se purgó/llenó la reacción con
H_{2} (x4) y se dejó a presión constante de H_{2} durante 2 h,
seguido de la retirada del catalizador mediante filtración a través
de Celite. Se disolvió el aceite resultante en Et_{2}O (10 ml),
seguido de la adición de trietilamina (4 ml, 28,7 mmol). Después de
18 h, se concentró la reacción a vacío y se purificó mediante
cromatografía radial (eluyendo con 40% de AcOEt/hexanos),
proporcionando 130 mg de producto, 57% de rendimiento. El espectro
de RMN-^{1}H (300 MHz) fue consistente con la
estructura de E5-5. EM FAB (M^{+} de la base
libre)= 1597.
Se dispuso en un congelador a 0ºC durante 2 h una
solución del compuesto E5-5 (128 mg, 0,08 mmol) en
TFA enfriado con hielo (2 ml), seguido de la adición de agua
enfriada con hielo (2 ml), y después se agitó en un baño de hielo
durante 2 h. Se concentró la solución a vacío, después se disolvió
en THF (1,5 ml) y HCl 1 N (1,5 ml) y se agitó a temperatura ambiente
durante 16 h. Se añadió tolueno y se concentró la solución a vacío
tres veces, proporcionando 70 mg de un diclorhidrato sólido blanco,
100% de rendimiento. El espectro de RMN-^{1}H (300
MHz) fue consistente con la estructura de E5-6. EM
FAB calculado para M+H, C_{39}H_{54}N_{7}O_{12}; encontrado=
812,3830; encontrado= 812,3837.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron N,N-diisopropiletilamina (2,0
ml, 11,5 mmol) y el éster activo de hidroxibenzotriazol de la cadena
lateral terfenilo (50 mg, 0,11 mmol) a una solución del compuesto
E5-6 (65 mg, 0,08 mmol) en DMF anhidra (5 ml), y la
solución se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. Se retiró el
disolvente a vacío y se trató el residuo con Et_{2}O (10 ml), se
sometió a sonicación y se aisló un sólido beis. Se purificó la
porción soluble en metanol mediante HPLC FI (Water Bondapak
C-18, eluyendo con 58% de AcN/0,1% de TFA/H_{2}O a
un flujo de 20 ml/min) y la liofilización proporcionó 35 mg de un
sólido blanco, 38% de rendimiento. El espectro de
RMN-^{1}H (300 MHz) fue consistente con la
estructura de E5-7. EM FAB calculado para M+H,
C_{63}H_{76}N_{7}O_{14}= 1154,5450; encontrado=
1154,5458.
El ejemplo 6 ilustra la introducción de un grupo
solubilizante en agua en el intermedio tetrapeptídico antes de la
ciclación.
Se combinaron ácido
N-\alpha-Boc-L-\alpha,\beta-diaminopropiónico
(0,5 g, 2,45 mmol) (disponible en Bachem) y
1,3-bis(benciloxicarbonil)-2-metil-2-tioseudourea
(0,88 g, 2,45 mmol) en 15 ml de DMF anhidra. Se añadió trietilamina
(1,0 ml, 7,3 mmol) y se agitó durante 3 días a temperatura ambiente.
Se diluyó la reacción con 100 ml de NaOH 0,1 N y se extrajo con
éter. Se acidificó la fase acuosa después con ácido cítrico saturado
frío y se extrajo con acetato de etilo (3x200 ml). Se secaron los
extractos orgánicos combinados sobre MgSO_{4}, se filtraron y se
concentraron hasta un rendimiento cuantitativo de un aceite incoloro
espeso. El espectro de RMN-^{1}H (300 MHz) fue
consistente con la estructura de E6-1. EM FD
(M^{+} de base libre)= 515.
Se añadieron N-hidroxisuccinimida (69 mg,
0,60 mmol) y DCC (123 mg, 0,60 mmol) al ácido anterior
E6-1 (310 mg, 0,60 mmol) en THF anhidro (10 ml).
Empezó a formarse un precipitado blanco después de aproximadamente 1
hora. Se dejó agitar la reacción durante una noche a temperatura
ambiente. Se filtró la reacción y se utilizó directamente la
solución bruta en el siguiente acoplamiento.
Se añadieron el compuesto E5-3
(920 mg, 0,60 mmol) y trietilamina (3 ml) a una solución del éster
activado anterior E6-2 (366 mg, 0,60 mmol) en THF
anhidro (10 ml) y éter (10 ml). Se dejó agitar durante una noche (18
h) la solución a temperatura ambiente. Se diluyó la reacción con
éter y se lavó con bicarbonato de sodio saturado (1 x 250 ml), HCl
0,1 N (1 x 250 ml), bicarbonato de sodio saturado (1 x 250 ml), se
secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró hasta 1,0 g
de un sólido blanco bruto. Se purificó el residuo mediante
cromatografía radial (eluyendo con acetato de etilo/hexanos 30/70),
proporcionando 550 mg (46% de rendimiento) de un sólido blanco. El
espectro de RMN-^{1}H (300 MHz) fue consistente
con la estructura de E6-3. EM FAB (M^{+} de base
libre)= 2036.
Se añadió el compuesto E6-3 (550
mg, 0,27 mmol) a una solución de Pd/C al 5% (150 mg) en EtOH (15 ml)
y AcOH (15 ml) en atmósfera de N_{2}. Se purgó/llenó la solución
con H_{2} (x4) y se sometió a presión constante de H_{2} durante
2,0 h, después se filtró a través de Celite para retirar el
catalizador. Se concentró la solución a vacío para retirar los
disolventes, se disolvió el residuo en acetonitrilo (10 ml) y éter
(3 ml), seguido de la adición de 2 ml de trietilamina. Se sometió a
sonicación la mezcla durante 4 horas y se dejó alcanzar una
temperatura de 40ºC. Se concentró la mezcla de reacción y se
purificó mediante cromatografía radial (eluyendo con acetato de
etilo/hexanos 40/60), proporcionando 57 mg del compuesto deseado
(14% de rendimiento). El espectro de RMN-^{1}H
(300 MHz) fue consistente con la estructura de E6-4.
EM FAB (M^{+} de la base libre)= 1549.
Se añadieron 3 ml de ácido trifluoroacético puro
al compuesto E6-4 (77 mg, 0,05 mmol) anterior
enfriando a 0ºC. Después de 45 minutos, se añadieron 0,5 ml de agua
manteniendo la reacción a 0ºC. Después de 30 minutos, se concentró
la mezcla a un aceite incoloro. Se añadieron a este aceite 2 ml de
THF y 2 ml de HCl 1 N, y se refrigeró durante una noche. Se separó
por destilación el tolueno de la mezcla, proporcionando un
rendimiento cuantitativo de la amina libre en forma de la sal
triclorhidrato. El espectro de RMN-^{1}H (300 MHz)
fue consistente con la estructura de E6-5. EM FAB
(M^{+} de la base libre)= 764.
Se añadieron N,N-diisopropiletilamina (2
ml) y el éster activo de hidroxibenzotriazol de la cadena lateral
terfenilo (44 mg, 0,09 mmol) a una solución del compuesto
E6-5 (50 mg, 0,06 mmol) en DMF anhidra (5 ml), y se
agitó la solución a temperatura ambiente durante 18 h. Se retiró el
disolvente a vacío y se trituró el residuo con una mezcla de
acetonitrilo y éter. Se secó el sólido hasta 25 mg de un sólido
blanco bruto. Se purificó el producto mediante HPLC FI en una
columna C-18 Waters Bondapak eluyendo con 55% de
AcN/0,1% de TFA/H_{2}O a un flujo de 20 ml/min. Se liofilizaron
las fracciones apropiadas, proporcionando 10,0 mg de un sólido
blanco, 18% de rendimiento. El espectro de
RMN-^{1}H fue consistente con la estructura de
E6-6. EM FAB calculado para (M+H),
C_{57}H_{72}N_{9}O_{14}= 1106,5199; encontrado:
1106,5185.
La Tabla 3 resume los datos de actividad para los
compuestos E3-6, E4-6,
E5-7 y E6-6 en comparación con el
compuesto semisintético comparativo de equinocandina C1. Se
utilizaron los mismos procedimientos de ensayo que se describen en
el ejemplo 1 anterior.
El ejemplo 7 ilustra la formación de un
heptapéptido cíclico a partir del pentapéptido lineal intermedio
(I-6).
Se añadió
N-\alpha-BOC-D-asparagina
(5 g, 21,53 mmol, 1 eq.) a una solución de
[bis(trifluoroacetoxi)yodo]benceno (12,89 g,
32,29 mmol, 1,5 eq.) en dimetilformamida: agua 1:1 (170 ml). Se
agitó esta solución a temperatura ambiente durante 0,5 h antes de
añadir piridina (3,4 g, 43,06 mmol, 2 eq.). Después de 18 h, se
concentró la reacción a vacío y se redisolvió el residuo en agua
antes de lavar con dietiléter (2x, 50 ml). Se concentró a vacío la
fase acuosa y se recristalizó el producto bruto con acetonitrilo
caliente, proporcionando E7-1 (1,10 g, 25% de
rendimiento).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó rápidamente durante 15 minutos hasta su
completa disolución una solución acuosa (12 ml) de ácido
N-\alpha-BOC-D-2,3-diaminopropiónico
E7-1 (1,114 g, 5,45 mmol, 1 eq.) y NaHCO_{3}
(0,458 g, 5,45 mmol, 1 eq.). Se añadió a esto una solución de éster
N-CBZ-O-N-hidroxisuccinimida
de glicina en 1,2-dimetoxietano (22 ml). Después de
agitar a temperatura ambiente durante 18 horas, se concentró la
reacción a vacío. Se redisolvió el residuo en agua, se acidificó a
pH 3 con HCl acuoso 1 N y se repartió entre acetato de etilo y agua.
Se lavó la fase acuosa 3x con agua adicional antes de combinar con
los extractos orgánicos, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. Se
purificó la espuma blanca bruta en columna C-18 en
fase inversa de HPLC preparativa (gradiente para un esquema de
elución AcN/TFA al 0,01% 5:95 a 100% de AcN), proporcionando 1,46 g
(3,69 mmol, 68% de rendimiento) de
E7-2.
E7-2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió diciclohexilcarbodiimida (0,804 g, 3,89
mmol, 1,1 eq) a una solución de E7-2 (1,40 g, 3,54
mmol, 1 eq.) en 1,2-dimetoxietano (40 ml) y
N-hidroxisuccinimida (0,448 g, 3,89 mmol, 1,1 eq.) enfriada a
0ºC. Después de agitar durante 1 h a 0ºC, se dispuso en frigorífico
durante 18 horas. Se filtró después la solución, se destiló el
filtrado hasta sequedad y se dispuso a alto vacío durante 2 horas,
proporcionando aproximadamente 2 g de producto (contenía algo de
subproducto DCU) que se utilizó sin purificación adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió una solución del intermedio peptídico
lineal I-6 (1,0 g, 0,598 mmol) en etanol (5 ml) a
una suspensión de Pd/C al 10% (250 mg) en 5 ml de etanol, seguido de
10 ml de ácido acético glacial. Se puso la mezcla en atmósfera de
bombona de H_{2} y después de 1 h había desaparecido el material
de partida (TLC, 25% de acetato de etilo/hexano). Se retiró el
catalizador mediante filtración a través de una capa de Celite y se
redujo cuidadosamente la solución (pero no hasta sequedad) a alto
vacío, manteniendo la temperatura por debajo de 40ºC. Se disolvió el
aceite resultante en 25 ml de éter y se añadió una solución de éster
activo del dipéptido E7-3 (ácido
O-Suc-N\alpha-BOC-D-2,3-diaminopropiónico-N-CBZ-glicina)
en 10 ml de tetrahidrofurano, seguido de trietilamina en exceso
hasta que la solución se alcalinizó para papel pH. Después de agitar
durante 16 h, se extrajo la solución con una solución saturada de
NaHCO_{3}, seguido de una solución diluida de HCl y después otra
porción de la solución saturada de NaHCO_{3}. Se secó la fase
orgánica sobre MgSO_{4} y se redujo a vacío, proporcionando 1,194
g de producto bruto. La purificación mediante cromatografía
ultrarrápida (30% de acetato de etilo/hexano) proporcionó 0,674 g
(59% de rendimiento) del producto acoplado E7-4. EM
FAB= 1916,5 (M+1).
Se dispuso en atmósfera de bombona de hidrógeno
una solución de E7-4 (0,665 g, 0,34 mmol) en
solución de etanol/ácido acético (10 ml de cada uno) con Pd/C al 10%
(200 mg). Después de 1,5 h, la TLC (30% de acetato de etilo/hexano)
indicó una reacción terminada. Se retiró el catalizador mediante
filtración a través de una capa de Celite y se redujo el disolvente
a vacío (pero no hasta sequedad) a 40ºC hasta que el residuo fue un
aceite espeso. Se disolvió este material en etiléter (150 ml) y se
añadió trietilamina en exceso (\sim8 ml). Después de 18 h, la TLC
(30% de acetato de etilo/hexano) indicó un punto de producto
mayoritario. Se retiró el disolvente a vacío, se redisolvió el
residuo en acetato de etilo y se lavó varias veces con agua. Se
combinaron los extractos orgánicos, se secaron sobre MgSO_{4} y se
retiró el disolvente a vacío, proporcionando 0,800 g de producto
bruto. Se purificó éste en una columna ultrarrápida (gel de sílice
eluído con 30% de acetato de etilo/hexanos), proporcionando 293 mg
(54% de rendimiento) de E7-5 en forma de un sólido
blanco. EM FAB= 1564,9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el compuesto E7-5
(288 mg, 0,181 mmol) en ácido trifluoroacético (3 ml) y se enfrió a
0ºC. Después de 0,5 h, se añadió agua (0,5 ml) y se agitó la mezcla
durante 0,6 h más. Se retiró el disolvente a vacío y se disolvió el
residuo en HCl 1 N (2 ml) y tetrahidrofurano (3 ml). Se agitó esta
solución a temperatura ambiente durante 1,5 h, después de lo cual se
dispuso en frigorífico durante una noche. Se retiró el disolvente a
alto vacío proporcionando un residuo espumoso que se disolvió en
dimetilformamida anhidra (3 ml). Se añadieron el éster activo de
terfenilhidroxibenzotriazol (108 mg, 0,276 mmol) y trietilamina
(0,11 ml, 0,78 mmol) a la solución. Después de agitar durante una
noche a temperatura ambiente, se retiraron los disolventes a alto
vacío y se purificó el material bruto (380 mg) mediante
HPLC-FI preparativa (columna C-18
eluída con solución acuosa de 50% de AcN/0,01% de TFA). La
liofilización de las fracciones puras proporcionó 97 mg (48% de
rendimiento) de E7-6(a) en forma de un sólido
blanco. EM FAB= 1121,5 (M) calc. para
C_{58}H_{72}N_{8}O_{15}= 1121,21.
De manera similar, se convirtió
N-\alpha-BOC-L-asparagina
en E7-6(b).
Los datos de RMN-^{1}H fueron
consistentes con la estructura de E7-6(b). EM
(FAB)= 1121 (M+).
Se preparó el compuesto E7-7 de
manera similar al ácido
N-\alpha-BOC-diaminopropiónico
E7-1. EM FAB (M+1)= 239.
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Se añadió ácido
N-\alpha-CBZ-diaminopropiónico
E7-7 a una solución agitada de hidróxido de sodio
(148 mg, 3,69 mmol, 1,1 eq.) en agua (5 ml). Se agitó la reacción
durante 10 minutos antes de añadir alcohol terc-butílico (4
ml). Se enfrió la reacción a 0ºC y se añadió lentamente dicarbonato
de di-terc-butilo (807 mg, 3,69 mmol, 1,1 eq.) durante 0,5 h.
Después de agitar durante una noche a temperatura ambiente, se
diluyó la reacción con agua (5 ml) y se lavó 3x con 10 ml de
etiléter. Se combinaron después los extractos orgánicos y se lavaron
varias veces con bicarbonato de sodio acuoso saturado. Se combinaron
las fases acuosas, se enfriaron a 0ºC y se acidificaron a pH 3 con
hidrogenosulfato de potasio acuoso (30 g en 200 ml de solución
madre). Se extrajo después esta solución turbia varias veces con
acetato de etilo. Se combinaron los extractos orgánicos, se secaron
sobre MgSO_{4} y se concentraron a vacío, proporcionando después
de alto vacío durante una noche 0,990 g (2,9 mmol, 87% de
rendimiento) de E7-8. El espectro de
RMN-^{1}H fue consistente con la estructura de
E7-8. EM FAB (M+1)= 339.
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Se añadió catalizador carbono sobre paladio al
10% (aproximadamente 200 mg) a una solución de ácido
N-\alpha-CBZ-N-\beta-BOC-D-2,3-diaminopropiónico
E7-8 en alcohol etílico (20 ml). Se dispuso la
mezcla en atmósfera de H_{2} y se agitó vigorosamente. Debido a
formaciones similares a geles, la reacción requirió alcohol etílico
adicional (volumen total de 75 ml) para facilitar una fácil
agitación. Después de varias horas, se filtró la reacción a través
de una capa de Celite y después se concentró a vacío proporcionando
259 mg (1,27 mmol, 32% de rendimiento) de E7-9.
Se preparó el compuesto E7-10 de
manera similar al dipéptido ácido
N-\alpha-BOC-D-2,3-diaminopropiónico-N-CBZ-glicina
E7-2. El RMN-^{1}H fue consistente
con la estructura de E7-10.
Se preparó el compuesto E7-11 de
manera similar al éster O-NHS activo del dipéptido
ácido
N\alpha-BOC-D-2,3-diaminopropiónico-N-CBZ-glicina
E7-3.
Se preparó el compuesto E7-12 de
manera similar al heptapáptido ácido
diBOC-silil-N(\alpha)BOC-D-2,3-diaminopropiónico-glicina-CBZ
E7-4. EM FAB (M+1)= 1917.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto E7-13 de
manera similar al BOC-sililcicloheptapéptido
E7-5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el compuesto E7-14 de
manera similar al cicloheptapéptido E7-6. EM FAB
(M)= 1121,6.
\newpage
Se preparó E7-14(b) de
manera similar a E7-14(a) a partir de ácido
N-\alpha-CBZ-L-2,3-diaminopropiónico.
Los datos de RMN-^{1}H fueron
consistentes con la estructura de E7-14(b).
EM (FAB)= 1121 (M+).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó el procedimiento de Curphey et
al., J. Org. Chem., 44, 2805, (1979) de la manera
siguiente. Se trató una suspensión de ácido
(L)-(\alpha)-N-CBZ-2,3-diaminopropiónico
(2,0 g, 8,39 mmol) y trietilamina (0,84 g, 8,39 mmol) en metanol (10
ml) a temperatura ambiente con trifluoroacetato de etilo (1,49 g,
10,49 mmol), y se agitó la mezcla durante 48 horas. Se diluyó la
solución resultante con metanol (5 ml), se enfrió a 0ºC y se trató
con resina Dowex 50W (3,30 g). Después de agitar durante 10 min, se
filtró la suspensión y se concentró el filtrado a vacío, produciendo
2,74 g de un sólido blanco (98% de rendimiento) que se utilizó sin
purificación adicional. Los datos de RMN-^{1}H
fueron consistentes con la estructura de E8-1. EM
(FD)= 334 (M+).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (0,81 g, 3,95
mmol) a una solución de E8-1 (1,20 g, 3,59 mmol) y
N-hidroxisuccinimida (0,45 g, 3,95 mmol) en
1,2-dimetoxietano (20 ml) a 0ºC. Se agitó la mezcla
a temperatura de baño frío durante 2 h, seguido de almacenamiento
durante una noche en frigorífico. La filtración de la suspensión y
posterior concentración del filtrado proporcionaron un producto
sólido bruto que recristalizó con acetato de etilo/hexanos,
produciendo 0,78 g de un sólido cristalino (50% de rendimiento, una
recogida). Los datos de RMN-^{1}H fueron
consistentes con la estructura de E8-2. EM (FD)= 431
(M+).
Se disolvió ácido
(L)-(\alpha)-N-BOC-2,3-diaminopropiónico
(0,52 g, 2,55 mmol) en una solución acuosa de bicarbonato de sodio
(preparada disolviendo 0,22 g, 2,55 mmol de bicarbonato de sodio en
10 ml de agua). Se añadió esta solución a una solución del éster
activo E8-2 (1,1 g, 2,55 mmol) en
1,2-dimetoxietano (23 ml), y se agitó la mezcla
durante 24 h. Después de concentrar a vacío para retirar el
1,2-dimetoxietano, se ajustó la suspensión residual
a pH 5 con ácido cítrico acuoso 1 N, después se extrajo con acetato
de etilo (2x). Se lavaron sucesivamente los extractos orgánicos
combinados con agua y salmuera, se secaron sobre MgSO_{4} y se
redujeron a vacío, proporcionando 1,4 g de una espuma bruta. La
trituración con cloruro de metileno proporcionó 1,05 g de un sólido
floculante (75% de rendimiento). No se recuperó producto adicional
de las aguas madre.
Los datos de RMN-^{1}H no
fueron consistentes con la estructura de E8-3. EM
(electropulverización de ión negativo)= 519
(M-H).
Se añadió
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (0,28 g, 1,37
mmol) a una solución de E8-3 (0,65 g, 1,24 mmol) y
N-hidroxisuccinimida (0,16 g, 1,37 mmol) en tetrahidrofurano
(5 ml) a 0ºC. Se agitó la mezcla a temperatura de baño frío durante
2 h, seguido de almacenamiento durante una noche en frigorífico. La
filtración de la suspensión y posterior concentración del filtrado
proporcionaron 0,70 g de una espuma bruta (89% de rendimiento). Los
datos de RMN-^{1}H fueron consistentes con la
estructura de E8-4. EM (FD)= 631 (M+).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió una solución del intermedio
pentapeptídico lineal I-6 (2,0 g, 1,19 mmol) en
acetato de etilo (10 ml) a una suspensión de Pd/C al 10% (400 mg) en
acetato de etilo (15 ml), seguido de 20 ml de ácido acético glacial.
Se puso la mezcla en atmósfera de bombona de H_{2}, y después de 1
h había desaparecido el material de partida. Se retiró el
catalizador mediante filtración y se redujo cuidadosamente la
solución a alto vacío, manteniendo la temperatura por debajo de
40ºC. Se disolvió el aceite resultante en THF (15 ml) y se añadió el
éster activo del dipéptido ácido
N-(L)-(\alpha)-CBZ-N-(\beta)-trifluoroacetil-2,3-diaminopropiónico-ácido
N-(L)-(\alpha)-BOC-2,3-diaminopropiónico-Osu
E8-4, seguido de trietilamina en exceso hasta que la
solución se alcalinizó para papel pH. Después de agitar durante 18
h, se redujo la solución a vacío y se repartió el residuo entre
etiléter y agua. Se lavó la fase de éter con una solución saturada
de NaHCO_{3}, seguido de lavados sucesivos con agua, ácido cítrico
acuoso 1 N, agua, NaHCO_{3} saturado y salmuera. Se secó la fase
orgánica sobre MgSO_{4} y se redujo a vacío, proporcionando 2,36 g
del producto bruto. La purificación mediante cromatografía en sílice
ultrarrápida (25% de acetato de etilo/hexano) proporcionó 1,22 g del
producto acoplado E8-5 en forma de una espuma (56%
de rendimiento). Los datos de RMN-^{1}H fueron
consistentes con la estructura de E8-5. EM (FAB)=
2041,5
(M+).
(M+).
Se dispuso una solución de E8-5
(1,20 g, 0,58 mmol) en acetato de etilo/ácido acético (20 ml cada
uno) con Pd/C al 10% (290 mg) en atmósfera de bombona de hidrógeno.
Después de 1,5 h, la TLC indicó que la desprotección era completa.
Se retiró el catalizador mediante filtración y se concentró el
filtrado a vacío hasta una suspensión espesa. Se disolvió este
material en etiléter (120 ml) y se añadió trietilamina en exceso
hasta que la solución se alcalinizó para papel pH (\sim5 ml).
Después de 36 h, la TLC indicó un producto mayoritario. Se lavó
sucesivamente la solución con agua, ácido cítrico acuoso 1 N, agua y
salmuera. Se secó la fase orgánica sobre MgSO_{4} y se redujo a
vacío, proporcionando 1,14 g de producto bruto. La purificación
mediante cromatografía en sílice ultrarrápida (25% de acetato de
etilo/hexano) proporcionó 0,69 g de E8-6 en forma de
una espuma (70% de rendimiento). Los datos de
RMN-^{1}H fueron consistentes con la estructura de
E8-6. EM (FAB)= 1690,0 (M+H).
Se agitó una solución de E8-6
(0,69 g, 0,40 mmol) en ácido trifluoroacético (23 ml) a 0ºC durante
0,5 h, después de dicho tiempo se añadió agua (2 ml) y se continuó
la agitación durante 0,75 h adicionales a 0ºC. Se retiró el
disolvente a vacío, se disolvió el residuo en tetrahidrofurano (9
ml) y se trató con HCl 1 N (4 ml). Se agitó esta solución a
temperatura ambiente durante 1,25 h y después se refrigeró durante
18 h. La HPLC mostró un pico de producto mayoritario. La
concentración a vacío produjo una espuma residual que, después de
disolución en dimetilformamida (12 ml), se trató con éster activo de
terfenilhidroxibenzotriazol (0,25 g, 0,52 mmol) y trietilamina (0,28
ml, 2,0 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 17
h, se retiró el disolvente a alto vacío y se purificó el residuo
bruto mediante HPLC-FI preparativa (gradiente lineal
para un esquema de elución 60-100% de AcN/0,1% de
TFA), produciendo 0,37 g de un sólido blanco (75% de rendimiento).
Los datos de RMN-^{1}H fueron consistentes con la
estructura de E8-7. EM (FAB)= 1246,7 (M+).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió una solución de carbonato de potasio
(138 mg, 1,0 mmol) en agua (6 ml) a una solución de
E8-7 (250 mg, 0,20 mmol) en metanol (12 ml), y se
agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 20 h. La
retirada de disolvente a vacío seguido de purificación mediante
HPLC-FI preparativa (gradiente lineal para un
esquema de elución de 60-100% de AcN/0,1% de TFA)
proporcionó 218 mg de un sólido blanco (94% de rendimiento). Los
datos de RMN-^{1}H fueron consistentes con la
estructura de E8-8. EM (FAB)= 1150,6 (M+).
Se añadieron
1-metil-4-piperidona
(7,85 mg, 0,0694 mmol) y ácido acético glacial (2 \mul, 0,0347
mmol) a una solución de E8-8 (40 mg, 0,0347 mmol) en
metanol (2 ml) a temperatura ambiente. Se trató la solución con
cianoborohidruro de sodio (3,27 mg, 0,0520 mmol) y se agitó la
mezcla durante 16 h. Después de concentrar a vacío, se purificó el
producto bruto mediante HPLC-FI preparativa
(gradiente en etapas para un esquema de elución de
40-100% de AcN/0,1% de TFA), proporcionando 19 mg de
un sólido blanco (45% de rendimiento). Los datos de
RMN-^{1}H fueron consistentes con la estructura de
E8-9. EM (FAB)= 1247,6 (M+).
La Tabla 4 resume los datos de actividad de los
compuestos E7-6(a),
E7-6(b), E7-14(a),
E7-14(b), E8-8 y
E8-9 en comparación con el compuesto comparativo
semisintético de equinocandina C1 y la anfotericina B. Se utilizaron
los mismos procedimientos de ensayo que se describen en el ejemplo 1
anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (13)
1. Un proceso para modificar un núcleo de anillo
peptídico cíclico que comprende las etapas de:
(i) proporcionar un compuesto peptídico cíclico
que comprende una unidad peptídica que tiene un grupo
\delta-hidroxilo y un grupo
\gamma-hidroxilo;
(ii) abrir el anillo de dicho compuesto peptídico
cíclico para proporcionar un primer péptido lineal en el que
la
unidad peptídica que tiene el grupo \gamma-hidroxilo es la unidad peptídica N-terminal de dicho primer péptido
lineal;
unidad peptídica que tiene el grupo \gamma-hidroxilo es la unidad peptídica N-terminal de dicho primer péptido
lineal;
(iii) separar por escisión dicha unidad peptídica
que tiene un grupo \gamma-hidroxilo para
proporcionar un segundo péptido lineal;
(iv) unir al menos un aminoácido, unidad
dipeptídica o unidad sintética a dicho segundo péptido lineal para
producir un tercer péptido lineal;
(v) ciclar dicho tercer péptido lineal para
producir un compuesto peptídico cíclico modificado que tiene un
núcleo de anillo modificado.
2. El proceso de la reivindicación 1, en el que
dicho aminoácido, dicha unidad dipeptídica o dicha unidad sintética
de la etapa (iv) comprende un grupo amino protegido.
3. El proceso de la reivindicación 2, que
comprende adicionalmente:
(vi) desproteger dicho grupo amino protegido para
proporcionar un grupo amino desprotegido;
(vii) acilar dicho grupo amino desprotegido.
4. El proceso de la reivindicación 1 ó la
reivindicación 2, que comprende adicionalmente escindir otra unidad
peptídica de dicho segundo péptido lineal en la etapa (iii) antes de
unir al menos dicho aminoácido, unidad dipeptídica o unidad
sintética en la etapa (iv).
5. El proceso de la reivindicación 1, en el que
la etapa (iii) se realiza añadiendo ácido trifluoroacético o ácido
clorhídrico a dicho primer péptido lineal en un disolvente
orgánico.
6. El proceso de la reivindicación 5, en el que
dicho disolvente orgánico se selecciona del grupo constituido por
cloruro de metileno, tolueno y dioxano.
7. El proceso de la reivindicación 1 ó 2, en el
que se une un segundo aminoácido, dipéptido o unidad sintética a
dicho tercer péptido lineal en la etapa (iv) antes de ciclar en la
etapa (v).
8. El proceso de la reivindicación 4, en el que
se une un segundo aminoácido, dipéptido o unidad sintética a dicho
tercer péptido lineal en la etapa (iv) antes de ciclar en la etapa
(v).
9. El proceso de la reivindicación 1, en el que
dicho compuesto peptídico cíclico es un hexapéptido cíclico.
10. El proceso de la reivindicación 1, en el que
dicho compuesto peptídico cíclico se representa por la siguiente
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R es un grupo alquilo, un
grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo o un grupo
heteroarilo; R_{1} es -OH, R_{2} es -H o -CH_{3}; R_{3} es
-H, -CH_{3}, -CH_{2}CONH_{2} o
-CH_{2}CH_{2}NH_{2};
R_{4} es -H o -OH; R_{5} es -OH,
-OPO_{3}H_{2} o -OSO_{3}H; R_{6} es -H o -OSO_{3}H o
R_{7} es -CH_{3} o -H.
11. El proceso de la reivindicación 1, en el que
dicho compuesto peptídico cíclico modificado es un compuesto de
anillo de 19, 20, 21 ó 22 miembros.
12. Un proceso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el compuesto peptídico cíclico
modificado se representa por la fórmula I o II:
en las
que
R es un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un
grupo alquinilo, un grupo arilo o un grupo heteroarilo;
R_{2} es -H o -CH_{3};
R_{3} es -H, -CH_{3}, -CH_{2}CONH_{2} o
-CH_{2}CH_{2}NH_{2};
R_{4} es -H o -OH;
R_{5} es -OH, -OPO_{3}H_{2} o
-OSO_{3}H;
R_{6} es -H o -OSO_{3}H;
R_{7} es -CH_{3} o -H;
(Y) se representa por la siguiente fórmula
--- A ---
\uelm{C}{\uelm{\para}{NH --- W}}H ---
\delm{C}{\delm{\dpara}{O}} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\para}{B}}H
---en la
que
A es -(CH_{2})_{a}- en la que a= 1, 2
ó 4, -CHR'-CHR''-
(CH_{2})_{b}- en la que R' y R'' son
independientemente -H, -OH, C_{6}H_{5}O-, -SH, -NH_{2},
C_{n}H_{2n+1}NH-, C_{n}H_{2n+1}O-, C_{n}H_{2n+1}S- o
-C_{n}H_{2n+1} en las que n= 1-4 y b= 0;
-(CH_{2})_{c}-C(O)NH(CH_{2})_{d}-
en la que c= 1-2 y d= 1-2,
-N=CH-(CH_{2})_{e}- en la que e= 0-2,
-NR'''(CH_{2})_{f}- en la que R''' es -H;
-C(O)CH_{2}NH_{2},
-C(O)CH(NH_{2})CH_{2}NH_{2} o
-C_{n}H_{2n+1} en las que n= 1-4 y f=
1-3;
-(CH_{2})_{g}-SO_{2}-(CH_{2})_{h}-
en la que g= 1-2 y h= 1-2,
en la que i= 1 ó 2,
o
en la que j es 1 ó 2 y Z es un
grupo amino, un grupo alquilamino o un grupo
piperidilamino;
B es un grupo alquilo C1 a C6 sustituido o no
sustituido;
W es un hidrógeno o C(O)R en la que
R es como se define anteriormente;
y sales, ésteres o hidratos farmacéuticamente
aceptables del mismo.
13. Un proceso según la reivindicación 12, en el
que R es un grupo terfenilo representado por la estructura:
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