DK173802B1 - Præparat til behandling af Pneumocystis carinii infeksioner og anvendelse af et cyclohexapeptid til fremstilling af et lægemiddel mod Pneumocystis carinii infektioner - Google Patents

Description

DK 173802 B1

Opfindelsen angår et præparat til behandling af Pneumocystis carinii infektioner hos pattedyr.

Opfindelsens baggrund 5

Pneumocystis carinii er en opportunistisk organisme, som er meget udbredt, men generelt hvilende, indtil kroppens forsvar hos værten svækkes, hvorefter den formerer sig i værten og forårsager sygdom. Den er generelt til stede i lungerne, skønt ekstrapulmonære infektioner er beskrevet. Lungeinfektioner 10 med denne organisme hos immunsvækkede individer fører generelt til pneumonia og er sædvanligvis fatale, hvis de ikke behandles. Det har været foreslået, at patient til patient transmission også kan optræde hos immunsvækkede individer. Den immunsvækkede tilstand hos en individer er sædvanligvis forbundet med genetiske defekter, lymphoproliferative sygdomme 15 eller med tilstande, der resulterer af cancerterapi eller behandling med immunsuppressive lægemidler eller som en konsekvens af AIDS. De fleste AlDS-patienter pådrager sig med tiden Pneumocystis carinii pneumonia (PCP) og har stået for størstedelen af de nyere tilfælde af denne sygdom. Ubehandlet er PCP næsten altid fatal.

20

Den nuværende metode til behandling af P. carinii pneumonia er tri-methoprim/sulfamethoxazol eller pentamidin. Behandling med tri-methoprim/sulfamethoxazol (TMP/SMZ) er forbundet med et højt niveau af toxiske bivirkninger herunder udslæt, forøget leverfunktion, svimmelhed og 25 opkastning, anæmi, kreatinforøgelse, og i ekstreme tilfælde Stevens-Johnson-syndrom. Bivirkninger fra TMP/SMZ er meget mere udbredte hos patienter med AIDS. Behandling med pentamidin er også forbundet med et højt niveau af toxiske bivirkninger herunder nyresvigt, hepatotoxicitet, hy-poglycæmi, hematologiske abnormaliteter og smerte eller absces på injekti-3 0 onsstedet. Mortaliteten som følge af behandling kan nå 20-30%. Der er stort behov for en forbedret metode til behandling af Pneumocystis carinii pneumonia hos immunsvækkede patienter.

DK 173802 B1

Beskrivelse af opfindelsen

Opfindelsen angår et præparat til behandling eller forebyggelse af Pneumocystis carinii infektioner hos pattedyr. Opfindelsen angår også anvendelse af 5 et cyclohexapeptid til fremstilling af et lægemiddel mod Pneumocystis carinii infektioner. Det omhandlede præparat eller lægemiddel anvendes ved administrering til individer, en person eller et dyr, som er inficeret med eller modtagelig for at blive inficeret med Pneumocystis carinii, af en anti-infektion eller infektionskontrollerende mængde af en cyclohexapeptidforbindelse. De om-10 handlede forbindelser omfatter en ny fungal metabolit, som i det følgende beskrives detaljeret. Kendte antibiotika af echinocandintypen er lipofile cyclo-hexapeptider med en fedtsyresidekæde, simple derivater af antibiotika af echinocandintypen, såsom sidekædedihydro- og tetrahydro-reduktions-produkter, ringformede ether- og esterderivater og semi-syntetiske produkter, 15 hvori cyclohexapeptidringen er tilbageholdt, men hvori fedtsyresidekæden er erstattet. De fleste af de i litteraturen beskrevne forbindelser beskrives som antifungale midler.

De for udførelse af opfindelsen egnede forbindelser omfatter ikke kun naturli-20 ge antibiotiske forbindelser men også simple derivater af naturlige antibiotiske forbindelser og semi-syntetiske forbindelser, som fuldstændig beskrevet i det følgende, og som repræsenteres af formlen (I).

DK 173802 B1

O ?' ^ /NH -R

°Hh . CI*»-\ Jf *' o\h Λ" V^r °Vki) * r^H ^°h 10 i

J CD

i? 15

For denne og efterfølgende formler gælder følgende: R' er H eller OH; 20 R" er H eller OH; R"’ er H, OH, -O-alkyl(Ci-Ce), -O-benzyl, eller R1 / 25 -OCH2CH2(CH2)mN; \ R2 hvori R1 er H, Ci-Ci2 alkyl, C3-C7 cycloalkyl, hydroxyethyl, alkoxyethyl med 1-« 30 6 carbonatomer i alkoxygruppen, furylmethyl, tetrahydrofurylmethyl, phenyl, phenylalkyl, hvori phenyl kan være substitueret med halo, hydroxy, lavere alkyl og lavere alkoxy; R2 er hydrogen eller alkyl med 1-6 carbonatomer; eller R1 og R2 sammen danner -(CH2)2Q(CH2)2-, hvori Q er en forbindende grup pe, såsom -CH2-, -NH- eller -N-alkyl- med 1-6 carbonatomer; og m er fra 0 til 4; DK 173802 B1 5 R"" er H eller OH; R.....er H. CH3 eller CH2CONH2; og R......er H eller CH3 R er (A) -CO-alkyl, 6 til 24 carbonatomer, eller 10 (B) -CO-alkenyl, 6 til 24 carbonatomer, (C) når R\ R", R"' og R"" er OH, og R.....og R......er CH3 da 15 (i) -C-CVOnrCA’On—(A)P-R1·

X

20 X1 (il) -c-CVOnrCA’Jn—-Ca>p"r’ eller

XI

25 O

(lii) -C-(V0m-H" \ CA)p-R' 30 hvori DK 173802 B1 A er divalent oxygen, svovl, sulfinyl eller sulfonyl; A1 er divalent oxygen, svovl, sulfinyl. sulfonyl eller -NH-; X er hydrogen, chlor, brom, iod, nitro, C1-C3 alkyl, hydroxy. C1-C3 alkoxy, mercapto, C1-C3 alkylthio, carbamyl eller C1-C3 alkylcarbamyl; 5 X’ er chlor. brom eller iod; R, er hydrogen, Ci-C18 alkyl eller C2-Ciealkenyl; W er Ci-Cioalkylen eller C2-Cioalkenylen; m, n og p er 0 eller 1, men hvis m er 0 skal n være 0; forudsat at summen af carbonatomerne i Rt- og W-grupperne skal være stør-10 re end 4, men ikke overstige 21; at når X er mercapto, kan A og A1 ikke være sulfinyl eller sulfonyl; og at når A og A1 er sulfinyl eller sulfonyl, skal de være i samme oxidationstilstand; (D) når R' er OH, R", R"’ og R"" er H, da 15 -Y-CO-R2 hvori Y er et divalent aminoacylradikal med formlen 20 a) -CO-Z-NH- hvori Z er Ci-Cioalkylen eller C5-C6cycloalkylen b) -CO-CH-CH- 25 hvori R3 er hydroxymethyl, hydroxyethyl, mercaptomethyl, mercaptoethyl, methylthioethyl, 2-thienyl, 3-indolomethyl, phenyl, benzyl, halophenyl, halo-benzyl, C1-C3 alkylphenyl, C1-C3 alkylbenzyl, C1-C3 alkyl-thiophenyl, C1-C3 alkylthiobenzyl, carbamylphenyl, carbamylbenzyl, C1-C3 alkylcarbamylphenyl 3 0 eller C1-C3 alkylcarbamylbenzyl; DK 173802 B1 (c) ° 5 C (---NH- hvori X2 er hydrogen eller halo.

10

Ved udtrykket "alkyl” skal forstås et univalent mættet ligekædet eller forgrenet carbonhydridradikal. Udtrykket "alkenyl" betyder et univalent, umættet, ligekædet eller forgrenet carbonhydridradikal indeholdende ikke mere end tre dobbeltbindinger. Ved "lavere" forstås op til 6 carbonatomer. Udtrykket "halo" 15 betyder chlor, brom, fluor og iod.

De nyttige forbindelser til anvendelse ved fremgangsmåden til behandling for eller forebyggelse af Pneumocystis carinii infektioner hos pattedyr ifølge opfindelsen er generelt hvide krystallinske eller pulverformet stoffer. De har ge-20 nerelt god opløselighed i alkoholer, såsom methanol og ethanol, dårlig opløselighed i vand og i carbonhydrider, såsom hexan og nogen opløselighed i mange almindelige opløsningsmidler. Opløselighedsegenskaberne såvel som andre egenskaber af mange af de naturligt optrædende cyclohexapepti-der er opsummeret i CRC Handbook of Antibiotic Compouds, Vol IV, Part I, 25 pp 355-367, CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, 1980.

En særlig foretrukket forbindelse er en ny fungal metabolit, hvori R', R", R'" og R"" er OH, R.....er -CH2CONH2, 30 R......erCH3og R er DK 173802 B1 ch3 ch3

I I

-CO-(CH2)8CH-CH2CH-CH2CH3 repræsenteret af formlen IA

5 o C* CH, OH ° 5" -C-CCH^.-CH-CH.CIlCHjCH, uvyt °H o\h ΓΟΗ » (IA)

OH

20

Forbindelsen kan betegnes 1 -[4,5-dihydroxy-N2-(10,12-dimethyl-1 -oxotetra-decyl)-L-omithin-5-(threo-3-hydroxy-1-glutamin)echinocandin-B, men der vil i det følgende for nemheds skyld blive refereret til den som forbindelse IA· Særlig foretrukket er isomeren kaldt 1-[(4R,5R)-4l5-dihydroxy-N2-(10,12-2 5 dimethyl-1 -oxo-tetradecyl)-L-ornithin-5-(threo-3-hydroxy-1 -glutamin)echno- candin-B. Fremstillingen og egenskaberne af forbindelse IA beskrives i det følgende og er også genstand for US patent nr. 4.968.608 og er mere fuldstændigt beskrevet deri.

30 Forbindelse IA, den foretrukne forbindelse, er et hvidt fast stof. som kan karakteriseres ved de følgende fysiske egenskaber: DK 173802 B1 dekomponeringstemperatur 206-214 °C; den empiriske formelCsiHtaNsOi? bestemt ved højopløsnings-FAB (Fast Atom Bombardment mass spectrometric measurement, beregnet for C5iH82Ne017 + Li = 1085,5958, fundet = 1085,6146); 5 en aminosyresammensætning bestemt ved gaskromatografi/massespektre for trimethylsiiylderivatet af de totale syrehydrolysater af en ækvivalent af hver af threonin, hydroxyprolin, methylhydroxyprolin, og hydroxyglutaminsy-re.

10 ’H NMR Spektra i CD3OD ved 400 MHz som vist i fig. 1; og 13C NMR kemisk skift opnået i CD3OD ved 100 MHz som følger: 11,20, 11,64, 19,75, 20,25. 20,78, 27,00, 28,07, 30,33, 30,37, 30,61, 30,76, 31,19, 15 31,29, 32,94, 34,83, 36,69, 38,10, 38,54, 39,07, 39,53, 45,93, 51,39, 53,01, 55,59, 56,31, 57,11, 58,35, 62,43, 68,18, 70,08, 70,55, 70,61, 71,26, 73,94, 75,72, 75,84, 76,86, 116,06(x2), 129,43(x2), 132,86, 158,22, 168,80, 172,16, 172,35, 172,40, 173,12, 174,24, 175,47, 176,88 ppm.

20 Forbindelsen er opløselig i flere forskellige organiske opløsningsmidler, såsom methanol, ethanol, dimethylformamid, dimethylsulfoxid og lignende.

Fremstillingen af forbindelse IA, en hidtil ukendt forbindelse, beskrives detaljeret i det følgende. De andre forbindelser, der er nyttige ifølge opfindelsen, 2 5 kan fremstilles på lignende måde ved erstatning med en egnet mikroorganisme eller ved andre fremgangsmåder som beskrives herefter.

Forbindelse IA kan fremstilles ved dyrkning af en mikroorganismestamme betegnet MF 5171 i stammesamlingen hos Merck & Co., Rahway, N.J. og er 30 identificeret som Zalerion arboricola og udvinding af denne faktor fra kulturmediet. En prøve af kulturen, der er i stand til at producere forbindelsen IA er deponeret under Budapest-aftalen i stammesamlingen hos the American Ty- DK 173802 B1 pe Culture Collection at 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. Prøven har accessionsnummeret ATCC 20868.

Beskrivelsen af koloni og morphologi for ATCC 20868 er angivet herunder: 5 A. Morpholoaisk beskrivelse.

Globose, ca. 6,0 mikron i diameter, tykvægget, mørkfarvede strukturer, der ligner chlamydosporer udvikler sig langs myceliet og synes ofte at være ind-10 skudt. Disse strukturer synes at dele sig under dannelse af flercellede grupper af 4-8 celler, som ikke let opbrydes. På nogle medier sammenslynges myceliestrenge under dannelse af reblignende strukturer, og de flercellede grupper danner store klynger, som om de sammenholdes af slimagtigt materiale.

15 B. Kolonibeskrivelse.

1. Czapek-Dox agar.

Kolonier vokser langsomt, væksten er ikke udstrakt, flad med irregulære kan-20 ter. Myceliet er sort, skinnende; overfladen bliver mat, kornet udseende, sort til grønlig-brun efterhånden som kolonien ældes.

2. Majsagar.

Kolonier er langsomt voksende. Vækst er ikke udstrakt. Myceliet er sort, 25 skinnende overflade bliver pulveragtig, matsort efterhånden som kolonien ældes.

3. Kartoffel-dextrose agar, Sabouraud-maltrose-agar og gærekstrakt-, malt-ekstrakt-dextrose agar.

30

Kolonier er langtsomtvoksende. Væksten ikke udstrakt, er svagt hævet i centret, udstrålende furede, irregulære kanter bortset fra på Sabouraud- maltose-agar, hvor kanterne er glatklare og regulære. Mycelium er sort, skin nende; bliver mat pulver, sort efterhånden som kolonien ældes.

DK 173802 B1

Skønt opfindelsen nedenfor er diskuteret principielt med hensyn til den speci-5 fikke stamme, er det velkendt i teknikken, at egenskaberne af mikroorganismer kan varieres naturligt og kunstigt. Således er alle stammer af slægten ATCC 20868 inklusive varianter og mutanter, hvorvidt de er opnået ved naturlig selektion, produceret ved indvirkning af muterende midler, såsom ioniserende stråling eller ultraviolet bestråling, eller ved indvirkning af kemiske i o mutagener, såsom nitroseguanidin, betragtes som omfattet af denne opfindelse.

Forbindelse IA kan fremstilles i en form, der kan tilpasses lægemiddelanvendelse, ved dyrkning af stammen ATCC 20868 af Zalerion arboricola i et næ-15 ringsmedium indtil en væsentlig mængde af antibiotisk aktivitet er påvist i kulturmediet, generelt i myceliedelen deraf, og derefter udvinding af den aktive komponent fra fermentationsmyceliet i et egnet opløsningsmiddel, koncentrering af opløsningen af aktiv komponent, hvorefter det koncentrerede materiale underkastes kromatografisk separation.

20

Fermentationen udføres i et medium indeholdende carbon- og nitrogenkilder, der er assimilerbare af mikroorganismerne og generelt lave niveauer af uorganiske salte. Desuden kan mediet supplementeres med sporemetaller, skønt hvis komplekse carbon- og nitrogenkilder anvendes, er de sædvanlig-25 vis tilstede i de komplekse kilder.

Carbonkilderne omfatter glycerol, sukkerarter, stivelsesarter og andre kulhydrater eller kulhydratderivater, såsom dextran, cerelose, såvel som komplekse næringsstoffer, såsom havremel, kornmel, hirse, majs og lignende. Den 30 nøjagtige mængde af carbonkilden, der anvendes i mediet vil til dels afhænge af de andre ingredienser i mediet, men det viser sig sædvanligvis at en mængde af kulhydrat på mellem 0,5 og 5 vægt-% er mediet er tilfredsstillen- DK 173802 B1 de. Disse carbonkilder kan anvendes individuelt, eller adskillige sådanne car-bonkilder kan kombineres i det samme medium.

Nitrogenkilder omfatter aminosyrer, såsom glycin, arginin, threonin, methio-5 nin og lignende, såvel som komplekse kilder, såsom gærhydrolysater, gæ-rautolysater, gærceller, tomatpasta, soyabønnemel, caseinhydrolysater, gærekstrakter, majsstøbevand, opløselige destillationsrester, bomuldsfrømel, kødekstrakt, og lignende. De forskellige nitrogenkilder kan anvendes alene eller i kombination i mængder der strækker sig fra 0,2 til 90 vægt-% af medi-10 et.

Blandt de uorganiske næringssalte, som kan inkorporeres i dyrkningsmediet, er de sædvanlige salte, der er i stand til at tilføre natrium, kalium, magnesium, ammonium, calcium, phosphat, sulfat, chlorid, carbonat, og lignende ιοί 5 ner. Også inkluderet er spormetaller, såsom cobolt, mangan, jern, molybdæn, zink, cadmium, og lignende.

De egnede medier til udførelse af fermentationen kan være faste eller flydende.

20

Faste medier kan have en hirse-, majs-, havre-, soyabønne- eller hvedebasis. Et medium, der har en hirsebasis, er medium 2 i eksempel A. Andre repræsentative fase medier omfatter følgende: 25 DK 173802 B1 Vægt eller volumen pr.

Medier 250 ml kolbe

Medium A

5 Majs (knust) 10,0 g Gærekstrakt 0,5 g

Natriumtartrat 0,1 g

Mononatriumglutamat 0,1 g

Majsolie 0,1 ml 10 Ferrosulfat7H20 0,1 g

Vand 15-20 ml

Medium B

Hirse 15 g 15 Gærekstrakt 0,5 g

Natriumtartrat 0,1 g

Ferrisulfat7H20 0,01 g

Sukrose 0,5 g

Alfalfa 0,5 g 20 Majsolie 0,1 ml

Vand 15 ml

Medium C

Hirse 15 g 25 Gærekstrakt 0,5 g

Natriumtartrat 0,1 g

Ferrisulfat7H20 0,01 g

Silicagel 0,5 g

Alfalfa 0,5 g 30 Mononagtriumglutamat 0,1 g

Majsolie 0,1 ml

Vand 15 ml DK 173802 B1

Medium D

Hirse 15 g Gærekstrakt 0,5 g 5 Natriumtartrat 0,1 g

Ferrisulfat7H20 0,01 g

Desuden kan medier fremstilles ved at anvende hvede, byg, havre eller soyabønner istedet for det ovenfor anvendte hirse eller majs.

10

Flydende medier kan også anvendes. Fermentation i større skala er generelt mere hensigtsmæssigt udført under anvendelse af et flydende medium. Det har vist sig, at skønt konventionelle flydende medier kan anvendes til opnåelse af forbindelse IA, har sådanne medier ikke vist sig at være egnede til op-15 nåelse af gode udbytter af det ønskede antibiotikum. Ved at inkorporere fra ca. 6 til 9 vægt-% glycerol har det imidlertid vist sig, at gode udbytter af den ønskede antibiotiske forbindelse kan opnås. Egnede flydende medier omfatter:

20 Medium E

Glycerol 85 g

Pektin 10 g

Jordnøddemel 4 g

Peptoni seret mælk 4 g 25 Tomatpasta 4 g

Udblødt majs 4 g "Lard Water" 4 g

Glycin 2 g KH2PO4 2 g 30 Destilleret vand til 1000ml pH 7,0 DK 173802 B1

Medium F

Dextrose 10 g

Glycerol 10 ml

Soyamel 4 g 5 Peptoniseret mælk 4 g

Tomatpasta 4 g "Lard Water" 4 g

Kalium dihydrogenphosphat 2 g

Cobaltchloridhexahydrat 0,01 g 10 Destilleret vand til 1000ml pH 7,0

Til fremstilling af forbindelse IA, fremstilles et fermentationsmedium indeholdende ATCC 20868 ved inokulering af spore eller mycelium fra den antibioti-15 kumproducerende organisme i et egnet medium og derefter under aerobe betingelser.

Fremgangsmåden er generelt først at inokulere en opbevaret kilde af kultur fra skråagar indeholdende næringsmedium til et næringspodningsproduce-2 0 rende medium og at opnå, fortrinsvis gennem en to-trins fremgangsmåde, vækst af organismerne, der tjener som podningsorganismer ved fremstillingen af antipneumocystis-midlet.

Med denne fremgangsmåde inokuleres en opbevaret skråagar-kultur af 2 5 ATCC 20868 i et passende flydende næringspodningsmedium med et pH i området fra 5 til 8,1, optimalt 6 til 7,5, og kolberne inkuberes med eller uden omrystning ved temperatur i området fra ca. 15 °C til ca. 30 °C, fortrinsvis 20 “C til 28 eC. Ved anvendelse af omrystning kan dette ske ved op til 400 rpm, fortrinsvis ca. 200 til 220 rpm. Inkuberingen udføres over en periode fra 2 til 30 30 dage, fortrinsvis 2 til 14 dage. Når væksten er udbredt, sædvanligvis mel lem 2 og 5 dage kan kulturvæksten anvendes til inokulering af produktionsmediet til produktion af det antipneumocystiske middel. Der udføres imidlertid DK 173802 B1 fortrinsvis et andet fermentationstrin inokulering med en del af kulturvæksten og derefter anvende lignende betingelser, men generelt med en forkortet inkubationsperiode på ca. 1 til 3 dage. Væksten anvendes derefter til inokulering af produktionsmediet.

5

Fermentationsproduktionsmediet, der er inokuleret med kulturvæksten inkuberes i 3 til 30 dage, sædvanligvis 7 til 14 dage med eller uden omrystning. Fermentationen kan gennemføres aerobt ved temperaturer, der strækker sig fra ca. 20 °C til ca. 40 °C. For optimale resultater er det mest hensigtsmæs-10 sigt at gennemføre disse fermentationer ved en temperatur i området fra ca.

24 °C til ca. 30 °C. Temperaturer på ca. 24 til 28 eC er særligt foretrukne. PH af næringsmediet, der er egnet til produktion af de omhandlede forbindelser, kan variere fra ca. 5.0 til 8,5 med et foretrukket område på fra ca. 6,0 til 7,5 efter en passende periode til produktion af den ønskede forbindelse eller for-15 bindeiser udvindes sidstnævnte fra fermentationsmediet som nærmere beskrevet i det følgende.

Det aktive materiale kan udvindes fra fermentationsmediet ved følgende trin: (1) tilsætning af alkohol til det nævnte medium, omrøring og filtrering til ud-2 0 vinding af den aktive komponent i den resulterende vandige alkoholiske opløsning; (2) koncentrering af den vandige alkoholiske opløsning til et lille volumen af primært vandig opløsning; 25 (3) intim kontakt af den resulterende koncentrerede alkoholiske vandige opløsning med et med vand ikke blandbart organisk opløsningsmiddel til ekstraktion eller fordeling af den aktive komponent deri og koncentrering, eller underkastelse af den koncentrerede opløsning for HP-20-adsorbtion og elue- 30 ring; derefter DK 173802 B1 (4) underkaste materialet, der er udvundet i eksempel (3) for mindst en kromatografisk separation, hvori der ved hver kromatografiske separation sker en kombination og koncentration af den aktive komponent fra eluaterne, som udviser aktivitet mod Candida albicans, til udvinding af forbindelse IA.

5

Det nøjagtige trin kan variere noget afhængig af, hvorvidt fermentation er blevet udført i flydende eller fast medium, hvilket opløsningsmiddel der anvendes, og hvilken adsorbent eller kombination af adsorbenter der anvendes.

i o Når fermentationen udføres på fast medium, kan det første trin udføres ved tilsætning af et alkoholisk opløsningsmiddel til fermentationsmediet, grundig blanding, efterfølgende filtrering, udvinding og koncentrering af det vandige alkoholiske filtrat. Fortrinsvis bliver det koncentrerede filtrat først tilbageeks-traheret eller vasket med et lavere alfatisk carbonhydrid-opløsningsmiddel, 15 såsom hexan eller en anden alkan, til fjernelse af alkanopløselige urenheder.

Det alkanvaskede filtrat kan ekstraheres eller fordeles med et vand ikke blandbart oxygeneret organisk opløsningsmiddel, og den resulterende opløsning koncentreres og placeres derefter på en søjle for mindst en, generelt adskillige kromotografiske separationstrin. Egnede søjler er silicagel, modfa-20 se og SEPHADEX LH-20.

Når fermentationen udføres i et flydende medium, sker der ifølge en metode en frafiltrering og udvinding fra fermentationsmediet af de mycelielle faste stoffer. Alkohol sættes til myceliekagen, og de mycelielle faste stoffer blan-25 des grundigt med alkoholen, filtreres, og filtratet opsamles og koncentreres.

Ved en alternativ fremgangsmåde kan hele næringsvæsken ekstraheres ved tilsætning af et volumen alkanol, fortrinsvis methanol, og filtrering til fjernelse af faste urenheder. Alkanolekstrakten adsorberes derefter på DIAION SP-207 eller en anden kommerciel tilgængelig styren-devinylbenzen-copolymer.

30 En anden fortynding/HP-20-adsorbtion-elueringstrin udnyttes til koncentrering af prøven til forberedelse for kromatografiske separationer. Nogle gange kan et tredie fortyndings/HP-20-adsorbtion/elueringstrin være ønskeligt for volu menreduktion.

DK 173802 B1

Det alkoholiske opløsningsmiddel, der skal anvendes ved den indledende 5 ekstraktion af det aktive stof fra det faste næringsmedium eller fra mycelie-kagen, kan være enhver af de lavere alkoholer, såsom methanol, ethanol, 2-propanol, og lignende. Methanol er foretrukket.

Det med vand ikke blandbare ikke-polære organiske opløsningsmiddel, der 10 er nyttigt til ekstraktion eller fordeling af det aktive stof fra alkanol- eller methanolopløsningen af estere, såsom ethylacetat, isopropylacetat, butylace-tat, eller ketoner, såsom methylethylketon. Lavere alifatiske estere er foretrukne.

15 Den kromatografiske separation kan udføres under anvendelse af konventionel søjlekromatografi med ikke-ionisk harpiks eller ved HPLC (high performance Liguid Cromatography) under anvendelse af modfaseharpiks. Fraktionerne indeholdende den antibiotiske forbindelse IA kan påvises ved bioau-tografi under anvendelse af Candida albicans. Der anvendes generelt mere 20 end et kromatografisk separationstrin. Ved en særlig foretrukket fremgangsmåde udføres en eller flere separationer under anvendelse af søjlekromatografi, og en endelig separation udføres under anvendelse af HPLC med Cis modfaseharpiks.

25 Når konventionel søjlekromatografi anvendes til kromatografiske separationer, er silicagel det foretrukne adsorbens. Der kræves sædvanligvis mere end en kromatografisk separation. Silicagel kan anvendes i alle separationerne, idet der anvendes forskellige elueringsmidler. Imidlertid kan det med fordel kombineres med anvendelsen af et andet adsorbens, såsom dextran-30 gel, solgt under varebetegnelsen SEPHADEX LH-20 (Pharmacia). Andre ad-sorbenser, såsom alumina, styren-divinylbenzen-copolymere, der er kommercielt tilgængelige som DIAION HP-20, HP-30, HP-40, SP-207 (Mitsubshi

Chemical Industries, Ltd.) og AMBERLITE XAD-2, XAD-4, XAD-16 (Rohm and Haas Co.) kan også anvendes.

DK 173802 B1

Ved fraktionering og udvinding af den aktive komponent ved kromatografi på 5 silicagel giver ester/alkohol-blandinger med forøgende koncentration af alkohol gode separationer. En blanding af ethylacetat og methanol har vist sig at være særlig nyttig. Disse kan anvendes i isokratisk , tringradient eller kontinuer gradient systemer. Ved anvendelse af et dextran adsorbens, såsom SEPHADEX LH-20, kan et chlorcarbonhydrid/carbonhydrid/alkohol-10 opløsningsmiddelsystem anvendes. En blanding af methylenchlo-rid/hexan/methanol har vist sig at være særlig nyttig.

Ved udførelse af HPLC-separationen koncentreres alkoholopløsningen, som indeholder materialet, der er udvundet fra den konventionelle kromatografi, 15 og remanensen opløses i methanol og placeres på en søjle pakket med kommerciel modfaseharpiks eller på en søjle fyldt med silicagel/Ci8-modfaseharpiks fremstillet som beskrevet flere steder i litteraturen. Alternativt kan alkoholopløsningen fortyndes til 50% med vand og pumpes på søjlen.

Søjlen opereres under anvendelse af methan/vand (1:1 eller eventuelt andre 2 o forhold) ved 800-2000 psi, hvilket frembringer en strømningshastighed på ca.

20 ml/minut. Separationen følges ved 210 nm.

Fraktionerne prøves for aktivitet med Candida albicans. Produktet udvindes efter kromatografering ved kombination af de aktive fraktioner og koncentre-25 ring under reduceret tryk. Produktet kan da renses ved konventionel kromatografi eller præparativ HPLC.

Andre naturprodukter, som er omfattet af den foreliggende opfindelse, omfatter sådanne, der er beskrevet i litteraturen som echinocandiner, aculeaciner, 30 mulundocandiner, athlestain (også refereret til som et echinocandin T), spo-riofungin eller ved nummerbetegnelser. Strukturerne er i nogle tilfælde ikke fuldstændig identificerede, men forbindelserne vides at være neutrale cyclo- hexapeptider med fedtsyrekæde.

DK 173802 B1

Echinocandinerne omfatter echinocandin-A (også kendt som A-32204-A) 5 produceret af Aspergillus nidulans-echinulatus (CH patent 568 386); echino-candin-B (også kendt som A-32204-B og SF-7810-F) produceret af Asp. ni-dulans (CH patent 568 386) og Asp. rugulosus (Helv. Chim. Acta 62 11252 (1979); DE 2 549 127; BE 834 289); echinocandin-C (også kendt som SL-7810-FII) produceret af Asp. rugulosus (DE 2 549 127; BE 834 289).

10

Echinocandin B, C og D kan fremstilles sammen ved fermentation af en stamme af Aspergillus rugulosus. Den væsentlige metabolit ved fermentationen af Aspergillus rugulosus er echinocandin B, som har molekylformlen Cs2HeiN70i6. Echinocandin C og D, som er de mindre væsentlige metabolit-15 ter, adskiller sig med hensyn til visse af de aminosyrer, der udgør den cycliske peptidring. Således indeholder echinocandin C, som har molekylformlen C52HeiN70i5l 3-hydroxyhomoty rosin i stedet for 3,4-dihydroxyhomotyrosin, som findes i Echinocandin B. Echinocandin D med molekylformlen C52H61N7O13, indeholder 3-hydroxyhomotyrosin og ornithin i 20 stedet for 3,4-dihydroxyhomotyrosin og 4,5-dihydroxyornithin.

Echinocandin B kan også produceres ved dyrkning af Emericella nidulans som beskrevet i arbejdseksemplet.

25 Aculeacinerne omfatter aculeacin-A, aculeacin-B, aculeacin-C, aculeacin-D, aculeacin-E, aculeacin-F, aculeacin-G, aculeacin-A A". aculeacin-D A", aculeacin-A G", aculeacin-Aa og Αγ, og aculeacin Da og Dy. Aculeacinerne kan fremstilles ved fermentation af Aspergillus aculeatus (enten flydende eller fast kultur) (fortrinsvis M4214 FERM-P 2324), hvorefter myceliet ekstraheres 30 med et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, og der koncentreres og renses ved kromatografi som beskrevet i US Patent nr. 3 978 210 og 4 212 858, DE Patent nr. 2 509 820 og BE Patent nr. 826 393.

DK 173802 B1

Et andet cyclohexapeptid-antibiotikum, som findes i litteraturen er mulundo-candin (R\ RM, R"', R'm er OH, R'"" er H, R er -CO(CH2)10-CH3CH-CH2CH3) produceret af Asp. sydowic nr. Y-30462 (J. Antibiotics 40, 275 og 40, 281 5 (2987)). Antibiotiket, som er til stede både i kulturfiltratet og myceliet kan iso leres fra ethylacetatekstrakten af et kulturfiltrat ved silicagel-søjlekromatografi og dråbemodstrømskromatografi som nærmere beskrevet af Roy et al, J. Antibiotics 40, 275-280 (1987).

10 Endnu et cyclopeptid af echinocandintypen, som er beskrevet i litteraturen er sporiofungin (R\ R"" og R"" er OH, RM er H, R"H er CH2CONH2, R""" er H og R er et Cie-fedtsyreradikal med forgrenet kæde), som kan fremstilles ved dyrkning af Cryptosporiopsis (WIPO publikation, WO 82/00587) stamme ATCC 20594 eller NRRL 12192, på forskellige konventionelle næringsmedier 15 som aerob overfladekultur eller immersionskultur, og myceliet separeret fra dyrkningsvæsken og udvindes på konventionel måde, såsom med homogenisering af myceliet med methanol, ekstraktion fra methanol med et med vand ikke blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom ethylacetat, fjernelse af opløsningsmidlet og rensning ved kromatografi som nærmere beskrevet i 20 WO 82/00587.

Andre cyclohexapeptider er echinocandintypen omfatter X-73 produceret af Aspergillus rugulosus, Ind. J.B. Biochem. 7, 81 (1970), athlestaln produceret af Aspergillus niger, (Jap. J. Ant., 17 168 (1964) JP 66/12688; CA65 19274;

25 70, 27607), S-31794-F-1 produceret af Acrophialophora limonispora (US

4 173 629; DE 2 628 965), A-30912-A eller A-22082 produceret af Asp. nidu-lans og Asp. rugulosus (US 4 074 246; 4 074 245; 4 288 549; DE 2 643 485; CA 87, 20612) A-30912-B, A-30912-C og A-30912-D, produceret af Asp. rugulosus (US 4 024 245).

30

Forbindelser, som er modifikationer af naturprodukter, omfatter sådanne, hvori sidekæden, dvs. R, når det er en umættet fedtsyre, er blevet modifice- DK 173802 B1 ret ved reduktion. Denne kan udføres katalytisk, ved anvendelse af Pd på-carbon ved atmosfærisk tryk.

Forbindelser hvori R'" er -O-alkyl (C)-Ce) eller -O-benzyl kan fremstilles ved 5 omrøring af den tilsvarende forbindelse, hvori R'" er OH, med en egnet alka-nol under sure betingelser ved stuetemperatur i adskillige timer eller natten over til opnåelse af etheren i blandingen og derefter fortrinsvis afbrydelse af reaktionen med fortyndet hydrogencarbonat og udvinding af dette ved konventionelle fremgangsmåder. Udover præparationen i arbejdseksemplet er 10 præparationen af et antal af disse forbindelser mere fuldstændigt beskrevet i GB 2 050 385A.

Forbindelser, hvori R"' er 15 R1 / -0-CH2-CH2-(CH2)m-N hvori R1 er hydrogen, \ R2 20 alkyl eller substitueret alkyl som tidligere defineret, R2 er hydrogen eller C1-C4 alkyl, eller R1 og R2 sammen danner -(CH2)2-Q-(CH2)2-, hvori Q er en forbindelsesgruppe, såsom -CH2-, -NH- eller -N(lavere alkyl)- kan fremstilles ved omsætning af en forbindelse, hvori R‘" er OH, med en forbindelse med form-25 len R1 /

HO-CH2-CH2-(CH2)m-N

30 ' R2 under tilstedeværelse af en organisk syre, såsom paratoluensulfonsyre, methansulfonsyre eller mineralsyre i et aprotisk opløsningsmiddel, såsom dimethylformamid, som mere fuldstændigt beskrevet i BE 851.310.

DK 173802 B1 5 Semi-syntetiske forbindelser, hvori acylsyrekæden, d.v.s. R i den ovenstående formel, er blevet modificeret fra naturligt optrædende fedtsyrer til strukturelt særskilte acylgrupper, kan fremstilles ved først at fjerne fedtsyresidekæden og derefter indføre særskilt acylgruppe. Fedtsyresidekæden fjernes fortrinsvis enzymatisk. Enzymet, der er nyttigt til deacylering af cyclohexapepti-1 o derne til opnåelse af en cyclopeptid nucleus, er det enzym, der produceres af visse mikroorganismer af familien Actinoplanaceae, især mikroorganismen Actinoplanes utahensis NRRL 12052, der er tilgængelig fra the Northern Regional Research Center, USDA, Agricultural Research Service, Peoria 111 61604, eller som A. Utahensis ATCC 14539, der kan opnås fra the American 15 Type culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852.

Enzymet kan fremstilles ved dyrkning af Actinoplanaceae ved temperaturer på mellem 25 °C og 30 °C og et pH påmellem ca. 5,0 og 8,0, fortrinsvis mellem 6,0 og 7,0, under omrystning og ved luftning i fra ca. 40 til ca. 60 timer i 20 et dyrkningsmedium indeholdende (a) en assimilerbar carbonkilde, såsom sucrose, glucose eller glycerol, (b) en nitrogenkilde, såsom pepton, urinstof eller ammoniumsulfat, (c) en phosphatkilde, såsom et opløseligt phosphatsalt og (d) vækstpromoterende uorganiske salte.

25 Ved deacyleringen sættes cycfohexapeptid-forbindelsen eller substratet indeholdende cyclohexapeptidet til kulturen af Actinoplanaceae, efter at kulturen har været inkuberet i mindst 48 timer. Efter tilsætning af substratet fortsættes inkubering af kulturen i ca. 24 timer eller længere over temperaturer i området fra ca. 25 °C til ca. 30 °C.

30

Reaktionsforløbet kan følges ved Candida albicans-assay.

DK 173802 B1

Cyclohexapeptid-udgangsforbindelsen er aktiv mod C. albicans, men den deacylerede nucleusforbindelse er biologisk inaktiv.

Den deacylerede nucleusforbindelse kan derefter anvendes ved fremstillin-5 gen af semi-syntetiske forbindelser. Konventionelle acyleringsmetoder kan anvendes. Ved en foretrukken fremgangsmåde omsættes en 2,4,5-trichlorphenylester af den ønskede syre med den deacylerede nucleusforbindelse i et inert opløsningsmiddel, såsom dimethylformamid, ved stuetemperatur i ca. 15 til 18 timer. Dette kan illustreres ved et specifikt 10 eksempel som følger:

En deacyleret kerne af en forbindelse med formlen (IB), hvor i E er H (forbindelse IBi) «V~\^Jt ο ΙΊΗ

rOH

(IB)

25 OH

kan fremstilles ved først at fremstille et deacylerende enzym ved fermentation af Actinoplanes utahensis NRRL 12052 ved først at inokulere en skråagar med organismen, inkubering af skråagaren ved 30 °C i ca. 8 til 10 dage og derefter anvende væksten på skråagaren til inokulering af 50 ml vegetativt 30 medium, som inkuberes ved 30 *0 i ca. 72 timer under omrystning. Det inkuberede vegetative medium kan anvendes til inokulering af 400 ml af et andet trins vegetativt medium, som har samme sammensætning som det første DK 173802 B1 trins vegetative medium, og inkuberes ved 30 °C i ca. 48 timer under omrystning. Derefter kan 800 ml af dette medium anvendes til inokulering af 100 liter produktionsmedium, som man lader fermentere ved ca. 30 °C i 42 timer under omrøring og ved luftning til opretholdelse af et niveau af opløst oxygen 5 på over 30% af luftmætningen ved atmosfærisk tryk og derved opnå det ønskede deacylerende enzym.

Mediet til fremstilling af skråagaren kan have følgende sammensætning "Baby" havremel 60,0 g; gær 2,5 g; K2HP041,0 g; Czepek's mineralblanding 5,0 10 ml; agar 25,0 g; deioniseret vand q.s. til 1 liter. Czepek's mineralblanding af den følgende sammensætning: FeS047H20 (i 2 ml kone. HCI) 2 g; KCI 100 g; MgS04 7H20 100 g; deioniseret vand til 1 liter indstillet til slut-pH 6,7.

Mediet, som er egnet til både første trin og andet trin vegetativt medium kan 15 have følgende sammensætning: "Baby" havremel 20,0 g; sucrose 20,0 g; gær 2,5; tørret korn 5,0 g; K2HP041,0 g; Czepek's mineralblanding 5,0 ml og deioniseret vand til 1 liter, slut-pH 6,8.

Produktionsmediet kan have den følgende sammensætning: Jordnøddemel 20 10,0 g. opløselig kødpepton 5,0 g; sucrose 20,0 g; KH2P04 0,5 g; K2HP04 1,2 g; MgS047H20 0,25 g; ledningsvand q.s. til 1 liter.

En alkoholisk opløsning er cyclohexapeptid (IB), hvor E er stearoyl (tetra-hydroechinocandin B) eller palmitoyl (aculeacin A) sættes til produktionsfer-25 mentationsmediet, som er beskrevet ovenfor, og deacyteringen følges ved assay mod Candida albicans.

Efter fuldførelse af deacyleringen filtreres fermentationsvæsken indeholdende nucleusforbindelsen og sendes gennem HP-20-harpiks til anbringelse af 30 nucleusforbindelsen på søjlen, og forbindelsen udvindes ved eluering med vand/methanol (7/3) ved en strømningshastighed på 200-300 ml/minut. Elua-tet følges for nucleusforbindelsen ved behandling med syrechlorid og assay DK 173802 B1 for aktivitet mod Candida albicans. Eluatfraktioneme, som viser aktivitet, koncentreres til opnåelse af nucleusforbindelsen (IBi).

Den således opnåede deacylerede cyclopeptid-forbindelse renses ved op-5 løsning i vand/acetonitril/eddikesyre/pyridin (96/2/1/1) og renses ved modfa-sevæskekromatografi (LICHROPREP RP-18) med en strømningshastighed på ca. 60 ml/minut, idet separationen følges ved 280 nm under anvendelse af en UV-monitor. På basis af absorptionen ved 280 nm kombineres fraktionerne, som indeholder den ønskede forbindelse, og de koncentreres under re-10 duceret tryk og anvendes til acylering eller lyophiliseres for senere brug.

Fremstillingen af den deacylerede cyclohexapeptid-forbindelse, der har den samme nucleus, udfra naturprodukter af echinocandintypen beskrives mere fuldstændigt i US 4 293 482. Lignende præparationer af andre deacylerede 15 cyclohexapeptid-forbindelser med lignende nuclei kan findes beskrevet i US patentnr. 4 173 629; 4 293 490; 4 299 763; 4 299 762 og 4 304 716.

De deacylerede forbindelser kan derefter anvendes til fremstilling af nye og/eller usædvanligt acylerede forbindelser.

20

Acyleringen af forbindelsen med den deacylerede nucleus til fremstilling af et unikt acylderivat kan illustreres ved en præparation af en forbindelse, hvori E i formel (IB) er _C0<3 -0-C8H17-n (forbindelse IBii).

En sådan forbindelse ville også være illustrativ for en forbindelse med form-30 len (I), hvori R et er radikal som defineret under (C)(i).

DK 173802 B1

Ved acyleringen indføres acylgruppen fortrinsvis ved hjælp af en trichlorphe-nylester. Således kan trichlorphenylesteren først fremstilles ved behandling af sidekædesyren med 2,4,5-trichlorphenol under tilstedeværelse af et koblingsmiddel, såsom N.N'-dicyclohexyicarbodiimid i et inert opløsningsmiddel, 5 såsom methylenchlorid. Ca. 1,1 mol af 2,4,5-trichlorphenol og 1,0 mol afkoblingsmidlet anvendes for hvert mol af alkoxybenzoesyren. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 15 til 18 timer til opnåelse af esteren, som kan udvindes ved frafiltrering af det faste stof og inddampning af filtratet under reduceret tryk, hvorefter remanensen omkrystalliseres.

10

Den således fremstillede ester sættes til en opløsning af nucleusforbindelsen i dimethylformamid og omrøres i ca. 18 timer, hvorefter opløsningsmidlet af-dampes. Remanensen vaskes og kromatograferes derefter på silicagel under anvendelse af ethylacetat-methanol (3/2) som eluent til opnåelse af det øn-15 skede octyloxybenzoylderivat, som kan repræsenteres ved formlen IB med octyloxybenzoylgruppen som E. En sådan forbindelse kan betegnes 1-[(4R,5R)-4,5-dihydroxy-N2-[4-(octyloxy)benzoyl]-L-ornithin]echinocandin-B (forbindelse IBii).

2 0 Udover forbindelse IA omfatter andre foretrukne forbindelser forbindelse IBii; echinocandin B (R\ R", R"\ R"" er OH; Rm"' og er Ch3; R er -CO-(CH2)4CH=CH(CH2)7CH3; tetrahydroechinocandin B (R\ R", R"', R"" er OH; R'"" og R...... er CH3; R er 25 -CO-(CH2)i6CH3); O-methyltetrahydroechinocandin B (R’, R", og R"" er OH;

Rm er k-OCH3; R"M' og R......er CH3; R er -CO-(CH2)i6CH3); og O-benzyltetrahydroechinocandin B (R\ R" og 30 R"" er OH, R"'er -OCHaCeHs, RM,M og R...... er CH3; R er -CO-(CH2)i6CH3) DK 173802 B1

Den omhandlede fremgangsmåde til behandling af eller forebyggelse af Pneumocystis carinii infektioner hos pattedyr omfatter administrering til individer, der er inficeret med eller immunsvækkede individer, der er modtagelige 5 for infektion med Pneumocystis carinii, af en terapeutisk effektiv eller anti-infektiv mængde af en cyclohexapeptid-forbindelse med formlen I.

Effektiviteten af cyclohexapeptid-forbindelseme for terapeutisk og anti-infektive formål hos immunsvækkede patienter kan først bestemmes ved i o studier på immunsvækkede rotter og immunsvækkede mus.

I en repræsentativ undersøgelse under anvendelse af forbindelse IA hos rotter blev ni han Sprague-Dawley-rotter med en vægt på hver ca. 200 g im-mumsvækkede ved tilsætning af dexamethason til drikkevandet (2,0 mg/liter) 15 i seks uger til induktion af udvikling af P carinii infektioner. For at fremme infektionen blev rotterne også holdt på en diæt med lavt proteinindhold. I begyndelsen af den syvende uge blev rotterne delt i tre grupper på hver tre rotter. Alle tre grupper fortsatte med at modtage dexamethanson i drikkevandet og en diæt med lavt proteinindhold gennem den resterende del af undersø-20 gelsen. Rotterne i gruppe I blev holdt som ubehandlede inficerede kontroller, dem i gruppe II blev injiceret intraperitonealt to gange dagligt i to uger med 0,5 ml sterilt dhfeO indeholdende 2 mg af forbindelse IA, og dem i gruppe III blev behandlet med trimethoprim-sulfamethoxazol (TMP-SMZ) i drikkevandet (208 mg TMP og 1,040 g SMZ/liter) i to uger, en kendt behandling for P. cari-25 nii infektioner. To rotter døde tidligt under forsøget. Den ene var fra gruppe II (rotte 72A) og den anden fra gruppe III (rotte 75A). Det blev ikke fastslået hvorvidt de døde af Pneumocystis pneumonia.

Ved afslutningen af de to ugers behandlingsperiode (i alt otte ugers immun-30 suppression) blev dyrene dræbt, og lungevævet fjernet. Lungerne fra hvert dyr blev vejet og derefter forarbejdet til bestemmelse af antallet af cyster og parasitnuclei for hvert dyr. Resultatet af dette forsøg er vist i tabel I.

DK 173802 B1 a: co lu i— w - ^ ί ί O O T-·^ >* 9 O CL ~ CT> = c z c — to

DC j_ S

< (O CL

O ft O

(L 5 — CO CM CO O Q CO O

^ o) r- [O J) CO Μ·_ '«-, CM_ ^ S ^r) ' ' ro co co' cm" t-· Π cm" o> 2 2 c

J d IB

Η —i i=.

LU S

t > Φ] ° — σ σι σ> σ> co co °o co t- H C O O O O O O O x V _ 3 T— T— -c— T-T- T-T- SF lu — χ x * x x χ χ cn

**· J □ (O N Ol 't -c- 00 O -O

DC O . · ^ M" CO h- h- T- Is» C

O D S ® IL Z g N _i ~0 5 ^ ,ζ tn i_ Φ cn ° 2 σισι <o cn c o g ° O O OO OO t -I i« s <s ? at a « - - ~ - <5 (5 H m O)] .-

ri Q co co eo <0(0 JK

CO C O O O O O ®

-J O' T T- T- T- r-i r— r- C

UJ ft — xxx HH x X σ>

q σ o_ in x-_ z Z P C

Z CO c_ - M- <N COCN «

g o ^ I

2 i §| eo “o °o .. O O 4 5 P § x x ^ dq Φ O ^ co" Π r·'-" co in “ z “ o z ^ > LU ·~ § ft M- < CD CQ CD corn ·!~ OH Η τ- Tt -ί x-cM pin

0» O c— r— r— h~ h- c» S

* 01 >

< <D

O -Q

> ^ U.

C < Φ ^ to — cn δ

_ uj = S

— — Q — N O

uj uj z uj 2 £

D- Q D_ Q- co II

CL 2 Q. 99 CL ' " o c 3 £ 2 % o o: O OL 9 K ^ o 5 O t- o t .z DK 173802 B1

Disse resultater demonstrerer, at forbindelse IA har effektivitet mod P. carinii infektioner. Ingen cyster kunne findes i lungerne hos rotter behandlet med forbindelse IA i sammenligning med niveauer fra 3,2 x 108 - 1,5 x 109hos 5 kontroldyrene. Der var også en reduktion i antallet af parasitnuclei (1,0 - 2,1 x 109) hos disse dyr til sammenligning med kontroller (5,8 x 109 - 1,4 x 1010).

Disse resultater er bedre end de der ses hos dyr behandlet med TMP-SMZ, en kendt behandling mod P. carinii infektioner, idet TMP-SMZ-rotter havde påviselige niveauer af P. carinii cyster.

10

En lignende rotteundersøgelse blev gennemført til bestemmelse af antip-neumocystis aktiviteten af 1-[(4R,5R)-4,5-dihydroxy-N2-[4-(octyloxy)benzoyl]-L-ii-ornithin]echinocandin-B (forbindelse IBM). Efter 6 ugers immunsuppression blev rotterne injiceret to gange dagligt i 7 dage med bæreren alene, for- 15 bindelse IBii (2 mg/kg) eller forbindelse IA (2 mg/kg) hvorunder immunsuppressionen blev fortsat. Ved afslutningen af behandlingsperioden blev dyrene dræbt, og antallet af cyster pr. lunge blev bestemt. Forbindelse IA reducerede antallet af cyster med >99%, mens forbindelse IBii reducerede cysteantallet med ca. 84% (sammenlignet med bærekontrollen, 10% DMSO).

20

Det blev også gennemført undersøgelser med mus og andre forbindelser med formlen I. Repræsentativt for fremgangsmåden, der blev anvendt ved undersøgelsen udført med mus og med andre forbindelser er som følger: 25 Han C3H/HeN-mus med en vægt på hver 22-24 g blev immunsvækket ved tilsætning af dexamethason til drikkevandet i 6 uger til induktion af udvikling af P. carinii infektioner. Til fremme af infektionerne blev musene ogsåholdt på en diæt med lavt proteinindhold. I begyndelsen af den syvende uge blev musene tilfældigt delt i gruppe af 6. Alle grupper fortsatte med at modtage de- 30 xamethason i drikkevandet og en diæt med lavt proteinindhold i den resterende del af undersøgelsen. Mus i hver gruppe blev injiceret intraperitonealt to gange dagligt med 0,5 ml af en 10% DMSO-opløsning som en bærekontrol DK 173802 B1 eller den samme cocktail indeholdende lægemiddel til opnåelse af en dosis på 2 mg/kg. Denne fremgangsmåde blev fortsat i en uge.

Ved afslutningen af behandlingsperioden (i alt 7 ugers immunsuppression) 5 blev dyrene dræbt og lungevævet fjernet. Vævet blev derefter forarbejdet til bestemmelse af antallet af cyster hos hvert dyr.

Resultaterne for de forskellige forbindelser ses i tabel II:

10 TABEL II

Forbindelse Dosis % Reduktion af cyster

Tetrahydroechinocandin B (TEB) 2 mg/kg 99% O-Methyl-TEB 2 mg/kg >99% O-Benzyl-TEB 2 mg/kg 99%

Echinocandin B 2 mg/kg >99%

Forbindelse IA 2 mg/kg >99%

Udfra de foregående forsøgsresultater og udfra kendte dosisområder for TMP-SMZ ved anvendelse på mennesket kan det fastslås at generelt fra ca.

15 0,5 til ca. 20,0 mg/kg legemsvægt af cyclohexapeptid-anti-pneumo- cystismidlet (forbindelse I) kan anvendes under hensyntagen til patientens helbred, vægt, alder og andre faktorer, som påvirker reaktionen på lægemidlet, såvel som hvorvidt det skal anvendes til en human patient eller til et dyr.

Disse mængder er, når de udtrykkes som doser, der er egnede til menne-20 sker, i området fra ca. 35 mg til ca. 1500 mg dagligt fortrinsvis ved parenteral administrering.

De enestående egenskaber udnyttes mest effektivt, når forbindelsen formuleres i nye farmaceutiske præparater med en farmaceutisk acceptabel bærer 25 ifølge konventionel farmaceutisk compounderingsteknikker.

DK 173802 B1

De nye præparater indeholder mindst 1 vægt-% af den aktive forbindelse.

Ved fremstilling af præparaterne blandes forbindelse I intimt med enhver af de sædvanlige farmaceutisk acceptable bærere.

5 Præparaterne omfatter præparater, der er egnede til oral, rektal, topisk, parenteral (herunder subcutan, intramuskulær og intravenøs), pulmonær (nasal eller buccal inhalering), nasal administrering eller insufflation.

Cyclohexapeptid-anti-pneumocystismidlet, forbindelse I, formuleres fortrins-10 vis i præparater til injektion og kan præsenteres i dosisenhedsform i ampuller eller i multidosisbeholdere, om nødvendigt med et tilsat konserveringsmiddel. Præparaterne kan også have form af suspensioner, opløsninger eller emulsioner i olie eller i bærere, såsom 20/80 ethanol/propylenglycol eller 20-35% polyethylenglycol 300 og kan indeholde formuleringsmidler, såsom suspensi-15 ons-, stabiliserings- og/eller dispergeringsmidler. Alternativt kan de aktive bestanddele være i pulverform til blanding med en egnet bærer forud for administrering eller til anvendelse i insufflation.

Udtrykket "enhedsdosisform" refererer i beskrivelse og krav til fysisk diskrete 20 enheder, idet hver enhed indeholder en forudbestemt mængde af aktiv bestanddel beregnet på at frembringe den ønskede terapeutiske virkning i forbindelse med den farmaceutiske bærer. Eksempler på sådanne enhedsdosisformer er udmålte enheder i ampuller eller i multidosisbeholdere og lignende. En enhedsdosis ifølge opfindelsen vil generelt indeholde fra 100 til 25 1000 mg af cyclohexapeptid-anti-pneumocystismidlet.

Enhver egnet administreringsvej kan anvendes til at forsyne en patient med en effektiv dosis af en forbindelse med formlen I. F.eks. oral, rektal, topisk, parenteralt, ocular, pulmonær, nasal indgivelse og lignende kan anvendes.

30 Dosisformer omfatter tabletter, pastiller, dispersioner, suspensioner, opløsninger. kapsler, cremer, salver, aerosoler, pulvere til insufflationer og lignende.

DK 173802 B1

Præparaterne omfatter præparater, der er egnede til oral, rektal, topisk, parenteral (herunder subcutan, intramuskulær og intravenøs), pulmonær (nasal eller buccal inhalation), nasal administrering eller insufflation.

5

Til administrering ved inhalering leveres de omhandlede forbindelser hensigtsmæssigt i form af en aerosolspray frembragt af trykbeholdere eller forstøvere. Forbindelserne kan også leveres som pulvere, som kan formuleres, og pulverpræparatet kan inhaleres ved hjælp af en insufflationspulverinhala-10 tor. Det foretrukne leveringssystem til inhalering er en inhaleringsaerosol med afmålte doser (MDI), der kan formuleres som en suspension eller opløsning af forbindelse I i egnede drivmidler, såsom fluorerede carbonhydrider eller carbonhydrider.

15 På grund af tungtopløseligheden af forbindelsen i farmaceutisk acceptable flydende bærere og på grund af ønskeligheden i at behandle lunger og bron-kier direkte, er aerosoladministrering en foretrukket metode til administrering. Insufflation er også en ønskelig metode, især hvor infektionen kan have spredt sig til ørerne og andre legemshulrum.

20

Alternativt kan parenteral administrering anvendes under anvendelse af intravenøs administrering via drop. Ved en sådan fremgangsmåden kan lægemidlet solubiliseres i alkohol/propolyenglycol eller polyethylenglycolpræpa-rater.

25

Intraperitoneal injektion kan også anvendes.

De følgende eksempler belyser fremstillingen af forbindelse IA og andre li-pophile cyclohexapeptidforbindelser med formlen I og præparater, som er 30 nyttige ifølge opfindelsen til kontrol af Pneumocystis carinii; eksemplerne skal dog ikke betragtes som begrænsende.

DK 173802 B1

Fremstilling af forbindelse IA Eksempel A 5 Fermentation

En frossen kultur i glycerol af isolat 2 af kultur 8525-307P. som oprindeligt blev isoleret fra vand, og som kan identificeres som Zalerion Arboricola, ATCC 20868, og som opbevares i Merck kultursamling, blev anvendt i fer-1 o mentationen.

En 2 ml portion af den frosne kultur blev optøet og aseptisk overført til en 250 ml Erlenmeyer kolbe uden ledeplader indeholdende 54 ml medium 1. Medium 1 blev efter inokulering inkuberet ved 28 °C under roterende omrystning 15 (220 rpm, 2" "throw shaker") i 3 dage. Ved afslutningen af denne periode blev 2,0 ml af vækstmediet aseptisk overført til hver af et antal 250 ml Erlenmeyer kolber uden ledeplader indeholdende medium 1. De inokulerede kolber blev inkuberet ved 28 eC i 2 dage.

20 12,5 ml af den modne udpodningsvæske blev inokuleret i 5 produktionskol ber indeholdende medium 2, og inkuberet ved 25 eC i 7 dage under statiske betingelser til opnåelse af en antibiotisk forbindelse i fermentationsmediet.

De i en foregående fermentation anvendte medier var: 25 h DK 173802 B1

Medium 1 (KF podningsmedium)

Majsstøbevand 5 g

Tomatpasta 40 g 5 Havremel 10 g

Glucose 10 g

Sporelementblanding 10 ml

Destilleret vand til 1000 g pH 6,8 10

Sporelementblanding:

FeSO-w^O 1 g

MnSO^^O 1 g CUCI22H2O 25 mg 15 CaCb 100 mg H3BO3 56 mg (NH4)6Mo024H20 19 mg

ZnS04 7H20 200 mg

Destilleret vand til 1000 ml 20

Medium 2 (F204 Fast medium) Mængde/kolbe

Hirsebasis 15 g 25 Gaerekstrakt 0,5 g

Natriumtartrat 0,1 g

Ferrosulfatkrystaller 0,01 g

Mononatriumglutaminsyre 0,1 g

Majsolie 1 ml 30 DK 173802 B1

Isolering 500 ml methanol blev sat til enhver af de frem 2 liters kolber med fastfase-fermentation. Indholdet fra kolberne blev derefter samlet og omrørt til 5 ekstraktion af methanolopløseligt materiale, hvorefter blandingen filtreredes. Filterkagen blev omrørt med yderligere 2500 ml methanol til yderligere eks-traktkion af methanolopløseligt materiale, og blandingen filtreredes derefter.

Filtratet og vaskevæsken blev kombineret og koncentreret til 500 ml.

10

Det vandige methanoliske koncentrat, der således opnåedes, blev derefter ekstraheret med to 500 ml portioner af ethylacetat. Den brugte vandige opløsning blev anbragt på en DIAION HP-20-søjle til adsorption af det aktive materiale på denne, hvorefter det elueredes fra denne med methanol. Elua-15 terne samledes med de tidligere opnåede ethylacetatekstrakter, og de kombinerede ethylacetatopløsninger blev koncentreret til tørhed. Remanensen kromatograferedes på 200 ml SEPHADEX LH-20 under anvendelse af 5:5:2 methylenchlorid/hexan/methanol som eluent.

20 Fraktionerne, der var aktive ifølge bestemmelse med Candida albicans, blev kombineret og kromatograferet på200 ml silicagel (EM Science, KIESELGEL 60, 230-400 mesh) under anvendelse af en tringradient eluering med ethyla-cetat/methanol. De aktive fraktioner fra denne kromatografering blev kombineret, koncentreret og kromatograferet på silicagel under anvendelse af et 25 75:25 ethylacetat/methanol isokratisk system.

De aktive portioner fra denne kromatografering blev derefter kombineret og anbragt på 100 ml SEPHADEX LH-20 under anvendelsen af methanol som elueringsmiddel. Eluatet gav efter afdampning af opløsningsmidlet 95 mg af 30 en renset forbindelse. Forbindelsen var et hvidt fast stof med et ’H NMR-spektrum som vist i fig. 1.

DK 173802 B1

Eksempel B Fermentation 5 På lignende måde som beskrevet i eksempel A blev indholdet af en frossen vial af ATCC 20868 fra Merck kultursamling optøet og aseptisk overført til en 250 ml kolbe uden ledeplader indeholdende 54 ml KF-medium (medium 1) indeholdende 0,4% agar. Det modificerede medium 1 blev efter inokulering inkuberet ved 28 °C med 220 rpm omrystning i 48 timer. Ved afslutningen af lo denne periode blev 10 ml af vækstmediet overført til en 2 liters kolbe uden ledeplader indeholdende 500 ml KF-medium indeholdende 0,4% agar. Efter inokulering blev det resulterende medium inkuberet i 24 timer ved 28 ®C med 220 rpm omrystning.

15 Tyve 2 liters kolber hver indeholdende 120 g medium 2 og 120 ml afen standardopløsning bestående af Gærekstrakt 5 vægtdele

Natriumtartrat 1 vægtdel 20 Ferrosulfatkrystaller 0,1 vægtdel Mononatriumglutaminsyre 1 vægtdel Majsolie 1 vægtdel blev autoklaveret i 20 minutter ved 122 ®C og derefter genautoklaveret med 25 80 ml vand i yderligere 20 minutter ved 122 °C. Man lod kolberne afkøle og inokulerede derefter med 20 ml podningsmedium fremstillet som beskrevet ovenfor, og de inokulerede kolber blev inkuberet ved 25 °C under statiske betingelser i 14 dage.

DK 173802 B1

Isolering

Til hver af nitten 2 liters fast fermentationskolber blev sat 1 liter methanol, og indholdet blev kombineret, omrørt og filtreret. Filterkagen blev ekstraheret to 5 gange med 6 liter methanol. De vandige methanolfiltrater blev derefter koncentreret, og koncentratet blev ekstraheret to gange med 3 liter ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne blev kombineret, tørret og koncentreret til ca. 100 ml.

Koncentratet blev derefter fordelt på silicagel ved tilsætning af 100 ml metha-10 nol og 100 ml silicagel, intim sammenblanding af komponenterne og efterfølgende fjernelse af opløsningsmidlet på en rotationsfordamper. Det tørrede silicagel blev derefter anbragt i en søjle af 500 ml silicagel, hvorefter søjlen blev vasket med ethylacetat til fjernelse af urenheder og elueret med 9:1 ethylacetat/methanol. Eluaterne, som indeholdt antibiotisk materiale, der gav 15 positiv test mod Candida albicans, blev opsamlet og kombineret.

Den antibiotikarige fraktion fra silicagelkromatograferingen blev opløst i 200 ml 10:10:1 methylenchlorid/hexan/methanol, og den resulterende opløsning blev kombineret med 40 ml SEPHADEX LH-20 (som var fremstillet forinden 20 ved opblødning i methanol natten over efterfulgt af vask to gange med 200 ml methylenchlorid/hexan/methanol). Efter nogle få minutter fjernedes super-natanten ved filtrering, som SEPHADEX LH-20 blev vasket med 200 ml methylenchlorid/hexan/methanol og derefter filtreret. Filtraterne fandtes ikke at indeholde den aktive bestanddel og kasseredes. Den aktive bestanddel, 25 som var fordelt ind i dextran SEPHADEX LH-20-perlerne blev ekstraheret fra disse ved vask to gange med 200 ml methanol, og disse methanolvaske-væsker blev kombineret og koncentreret.

Methanolkoncentratet blev derefter anbragt på 200 ml silicagel og elueret 30 med 75:25 ethylacetat/methanol, og eluaterne kombineredes og opløsningsmidlet fordampedes til opnåelse af forbindelse IA. Forbindelse IA er et hvidt pulver med en dekomponeringstemperatur på 206-214 eC.

DK 173802 B1

Fremstilling af echinocandin B derivater

Eksempel C

5

Fremstilling af echinocandin B A. Fermentation 10 Kultur MF 5100 Emericella nidulans ATCC 20956 fra Mercks kultursamling blev anvendt til podningskædeudvikling som følger: En frossen vial (ca. 2,5 ml) af MF 5100 blev anvendt til inokulering af 54 ml KF-medium og dyrkedes i 250 ml Erlenmeyer kolber uden ledeplader veed 28 eC og 220 rpm i 72 timer til opnåelse af "B"-trinkultur. 5 ml "B"-trinkultur blev anvendt til inokule-15 ring af 500 ml KF-medium i en 2 liters Erlenmeyer kolbe uden ledeplader og inkuberet ved 28 eC og 220 rpm i 48 timer til opnåelse af "C"-trinkulturer. 4 "C'-trinkolber blev anvendt til inokulering af 160 liter KF-medium med sporelementblanding #2 i en "D"-trin (300 liter omrørt fermenter).

20 De tre trin af podningskæden blev anvendt til "E"-skala fermentation i en 800 liters fermenter. Fermentationen blev udført i 23 timer ved 28 °C, modtryk 0,7 kg/cm2, beluftning med 0,300 m (53 liter/minut) og omrystning ved 100 rpm.

Produktions-"E"-trinnet blev inokuleret med 5% podning fra "D"-trinnet i 5700 25 liter af et produktionsmedium med den følgende sammensætning: DK 173802 B1

Glycerol 85 g/l

Pectin 10 g/l

Jordnøddemel 4 g/l

Peptoniseret mel 4 g/l 5 Peptoniseret mælk 4 g/l

Tomatpasta 4 g/l

Majsstøbevand 4 g/l "Lard”-vand 4 g/l

Glycin 2 g/l io Kaliumphosphat (monobasisk) 2 g/l Polyglycol P-2000 1 ml/l

Mediet blev steriliseret i 25 minutter ved 123 °C, og fermentationen blev derefter udført ved en temperatur på28 °C, et positivt tryk på ca. 0,8 kg/cm2, be-15 luftning 600 liter/minut, omrøringshastighed 120 rpm; pH i området 5,5-6,5 med opløst oxygen opretholdt ved over 30% i ca. 36 timer.

B. Isolering 20 Hele dyrknings væsken fra den ovenstående fermentation indeholdende 355 g echinocandin B ifølge HPLC-assay (overfor referencestandard echinocan-din B) blev ekstraheret natten over med samme volumen methanol. Den fortyndede dyrkningsvæske blev centrifugeret til fjernelse af næringsfaststoffer, og centrifugatet blev adsorberet på en 450 liter SP 207 søjle, som var blevet 25 ækvilibreret med 50:50 methanol/vand. Efter vask med 1000 liter vand og 1000 liter 50:50 methanol/vand blev søjlen elueret med methanol, og eluatet blev koncentreret til 189 liter og fordelt mod methylenchlorid. Det vandige methanollag blev indstillet til 50:50 methanol/vand ved tilsætning af vand og absorberet på en 100 liters HP-20-søjle, der forinden var vasket med metha-30 nol og præ-ækvilibreret med 50:50 methanol/vand. Efter vask med 50:50 methanol/vand blev søjlen elueret med 80:20 methanol/vand. 80:20 eluatet blev indstillet til 50:50 med vand og blev derefter adsorberet på en 27 liters SP 207-søjle, der var præ-ækvilibreret som før. Søjlen blev derefter elueret med methanol.

DK 173802 B1 5 En 19 g portion af SP 207 eluat blev fortyndet til 50:50 methanol/vand med vand og adsorberet på en 3,9 liters Amicon præparativ C-18-søjle. En gradient af acetonitril/vand (25:75) til 100% acetonitril over en 75 minuts periode blev anvendt til eluering af forbindelsen. Den udvalgte fraktion gav efter koncentrering og lyophilisering fra acetonitril/vand 16 g echinocandin B med en 10 renhed på 87/91 %.

Identiteten og renheden af det ovennævnte echinocandin B blev bestemt med HPLC og spektral sammenligning med en prøve af echinocandin B med de nedenfor angivne egenskaber, som tidligere var fremstillet og renset, og 15 dets identitet blev fastslået ved sammenligning med en publiceret struktur for echinocandin B.

Eksempel D

20 Fremstilling af tetrahvdroechinocandin B

5,0 g echinocandin B (EB) med en renhed på ca. 87% (HPLC) blev opløst i 150 ml absolut ethanol og blev sat til 10% Pd-C i 80 ml ethanol, som var blevet præreduceret under 1 atmosfæres hydrogen i 20 minutter. Efter tilsæt-25 ningen blev blandingen omrørt hurtigt under 1 atmosfære hydrogen i 4 timer.

Analyse ved HPLC under anvendelse af CH3CN/H2O (81/19) på en C8 ZORBAX-søjle ved en strømningshastighed på 1 ml/minut ved 30 “C viste, at reaktionen var praktisk taget fuldført på dette tidspunkt.

30 Reduktionsblandingen blev filtreret gennem en Celite-pude, puden blev vasket med ethanol, og blandingen blev koncentreret in vakuo til opnåelse af et fast stof. Det faste stof blev renset i ti 0,5 g portioner opløst i 5 ml DK 173802 B1 CH3CH/H2O {81/19). HPLC biøv udført på C8 ZORBAX 1 tomme søjle og elueret med 80% methanol/20% vand med en strømningshastighed på 15 ml/minut. Et totalt udbytte på3,15 g (79%) tetrahydroechinocandin B blev opnået.

5

Eksempel E

Fremstilling af O-methvItetrahvdroechinocandin B

10 55 mg tetrahydroechinocandin B blev opløst i 4 ml methanol. Til opløsningen blev sat 4,0 mg p-toluensulfonsyre, og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 3 timer. HPLC-analyse indikerede, at reaktionen var fuldført på dette tidspunkt.

15 Reaktionsblandingen blev fortyndet med 1 normal natriumhydrogencarbona-topløsning og vasket 2 gangen med mættet natriumchloridopløsning og derefter fortyndet med 200 ml 2-propanol/chloroform (2/7).

De organiske lag blev tørret over natriumsulfat, filtreret, og opløsningsmidlet 20 blev afdampet til opnåelse af et næsten hvidt fast stof som remanens. Sidstnævnte blev renset først med methanol og derefter med H2O/CH3CN (2:3) og kromatografering med MPLC i H2O/CH3CN (2:3) på en C8 LOBAR størrelse A søjle i 4 ml fraktioner. Forbindelsen blev opnået i et udbytte på 42,4 mg (76%).

25

Eksempel F

Fremstilling af O-benzvltetrahvdroechinocandin B

30 50 mg tetrahydroechinocandin B blev suspenderet i 1 ml tetrahydrofuran. Der blev tilsat 97 ml vandfrit benzylalkohol, og den resulterende blanding blev omrørt, indti! alt var fuldstændigt opløst. Til den resulterende opløsning blev DK 173802 B1 sat 1 mg p-toluensulfonsyre-monohydrat, og blandingen blev derefter omrørt ved stuetemperatur i 3 timer, hvorefter en HPLC-analyse viste, at reaktionen var fuldført. Reaktionsblandingen blev fortyndet med 1 normal natriumhydro-gencarbonatopløsning og derefter med 2-propanol/chloroform (3:7). Det or-5 ganiske opløsning blev vasket to gange med vand, tørret og inddampet til udvinding af produktet som remanens.

De følgende eksempler illustrerer nye præparater, som er nyttige til gennemførelses af den foreliggende opfindelse men ikke skal betragtes som be- 1 o grænsende for denne.

Aerosolpræparater kan fremstilles med de følgende formuleringer:

Eksempel I 15

Pr. beholder

Forbindelse la 24 mg

Lecithin, NF Flydende Koncentrat 1,2 mg 20 Trichlorfluormethan 4,025 g

Dichlordifluormethan 12,15 g

Eksempel II

2 5 Pr. beholder

Echinocandin B 24 mg

Oleinsyre 1,2 mg

Trichlorfluormethan 4,025 g 30 Dichlordifluormethan 12,15 g DK 173802 B1

Eksempel III

Pr. beholder 5 O-methyltetrahydroechinocandin B 24 mg Sorbitantrioleat 1,2 mg

Trichlorfluormethan 4,025 g

Dichlordifluormethan 12,15 g 10 En injicerbar suspension (1M) kan fremstilles som følger:

Eksempel IV

mg/ml 15

Forbindelse la 10

Methylcellulose 5,0

Tween 80 0,5

Benzylalkohol 9,0 20 Benzalkoniumchlorid 1,0

Vand til 1 ml

Generel information for echinocandin B

25 Emericella nidulans (et senere væksttrin af Aspergillus nidulans, etableret som produktionsorganisme for echinocandin B) og opbevaret som MF 5100 i Mercks kultursamling blev anvendt i fermentationen. En kultur blev deponeret hos the American Type Culture Collection under Budapestaftalen under ac-cessionsnr. ATCC nr. 20956.

Echinocandin B, fremstillet som beskrevet i eksempel C. blev sammenlignet for procentvis renhed i forhold til tidligere fremstillet echinocandin B med de 30 DK 173802 B1 følgende MS- og NMR-spektre og identificeret ved sammenligning med publiceret struktur for echinocandin B.

Massespektrale data: FAB-massespektre blev optegnet på et VG 20-250 5 massespektrometer. En matrix af dithiothreitol-dithriocrythritol-Lil blev anvendt og M+Li blev observeret ved m/z 1066 svarende til molekylvægten 1059.

1H NMR-spektrum: Spektret, fig. 2, blev optegnet i CD3OD på et Varian XL-10 300 NMR-spektrometer ved 300 MHz. Kemiske skift er vist i ppm i forhold til tetramethylsilan (TMS) ved 0 ppm under anvendelse af opløsningsmiddel-spidsen ved 3,30 ppm som intern reference.

,3C NMR Data: Spektret blev optegnet i CD3OD ved 24 °C pået Varian XL-15 400 NMR-spektrometer ved 100 MHz. Kemiske skift er angivet i ppm i forhold til tetramethylsilan ved 0 ppm under anvendelse af opløsningsmiddelspidsen ved 49,0 ppm som intern reference.

13C Kemiske skift (CD3OD, 100 MHz): 11,28, 14,43, 19,66, 20,04, 23,62, 20 26,54, 27,05, 28,15, 28,20, 30,27(x2), 30,42, 30,46. 30,78, 32,65, 35,08, 36,82, 38,60, 39,06, 51,67, 52,94, 56,32, 56,84, 57,19, 58,61, 62,46, 68,33, 69,59, 69,70, 70,87, 71,29, 74,60, 75,52, 75,77, 76,94, 116,21(x2), 129,06{x2), 129,60(x2), 130,94, 130,96, 133, k09, 158,46, 169,97, 172,48, 172,51, 172,79, 173,53, 174,35, 176,19.

25

Claims (10)

1. Præparat til behandling af Pneumocystis carinii infektioner hos pattedyr, kendetegnet ved, at det indeholder en farmaceutisk acceptabel bærer 5 og en cyclohexapeptidforbindelse med formlen X °H o ' °H T Cl) R· 20 R· er H eller OH; R" er H eller OH;

25 R"' er H, OH, -O-alkyl^-Ce), -O-benzyl, eller R1 · / -OCH2CH2(CH2)mN; 30 v R2 DK 173802 B1 hvori R1 er H, Ci-C12 alkyl, C3-C7 cycloalkyl, hydroxyethyl, alkoxyethyl med 1-6 carbonatomer i alkoxygruppen, furylmethyl, tetrahydrofurylmethyl, phenyl, phenylalkyl, hvori phenyl kan være substitueret med halo, hydroxy, alkyl med 1-6 carbonatomer og alkoxy med 1-6 carbonatomer; R2 er hydrogen eller al-5 kyl med 1-6 carbonatomer; eller R* og R2 sammen danner -(CH2)2Q(CH2)2-, hvori Q er en forbindende gruppe, såsom -CH2-, -NH- eller -N-alkyl- med 1-6 carbonatomer; og m er fra 0 til 4; RM" er H eller OH;

10 R.....er H, CH3 eller CH2CONH2; og R......er H eller CH3 R er (A) -CO-alkyl med fra 6 til 24 carbonatomer, eller 15 (B) -CO-alkenyl med fra 6 til 24 carbonatomer, (C) når R', R", R’" og R"" er OH, og R.....og R......er CH3 da 20 Cl) —(Α),-κ,. X 25 o /v/ Cii) -c-CV0BrCA,)n-'ji^ (A)p-Ri eller x’ 30 ?. Ι'^'Ί (111) -c-c VOm-[f H-CA)p-Ri DK 173802 B1 hvori A er divalent oxygen, svovl, sulfinyl eller sulfonyl; A1 er divalent oxygen, svovl, sulfinyl, sulfonyl eller -NH-; 5. er hydrogen, chlor, brom, iod, nitro, C1-C3 alkyl, hydroxy, C1-C3 alkoxy, mercapto, C1-C3 alkyl thio, carbamyl eller C1-C3 alkylcarbamyl; X1 er chlor, brom eller iod; Ri er hydrogen, C1-C18 alkyl eller C^Ciealkenyl; W er Ci-Cioalkylen; 10 m, n og p er 0 eller 1, men hvis m er 0 skal n være 0; forudsat at summen af carbonatomerne i Rj- og W-grupperne skal være større end 4, men ikke overstige 21; at når X er mercapto kan A og A1 ikke være sulfinyl eller sulfonyl; og at når A og A1 er sulfinyl eller sulfonyl, skal de være i samme oxidationstilstand; 15 (D) når R' er OH, R", R"' og R"" er H, da -Y-CO-R2 2. hvori Y er et divalent aminoacylradikal med formlen a) -CO-Z-NH- hvori Z er Ci-Cioalkylen eller Cs-Cecycloalkylen 25 R3 b) -CO-CH-CH- 30 hvori R3 er hydroxymethyl, hydroxyethyl, mercaptomethyl, mercaptoethyl, methylthioethyl, 2-thienyl, 3-indolomethyl, phenyl, benzyl, halophenyl, halo-benzyl, C1-C3 alkylphenyl, C1-C3 alkylbenzyl, C1-C3 alkylthiophenyl, C1-C3 al- kylthiobenzyl, carbamylphenyl, carbamylbenzyl, C1-C3 alkylcarbamylphenyl eller C1-C3 alkylcarbamylbenzyl; DK 173802 B1 (c) 5 10 hvori X2 er hydrogen eller halo.

2. Præparat ifølge krav 1,kendetegnet ved, at er egnet til administre-15 ring ved inhalering.

3. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er egnet til parenteral administrering.

4. Præparat ifølge krav l.kendetegnet ved, at det foreligger i enheds dosisform.

5 Ri er hydrogen, Ci-Cte alkyl eller C2-Ciealkenyl; W er Ci-Ci0alkylen; m, n og p er 0 eller 1, men hvis m er 0 skal n være 0; forudsat at summen af carbonatomerne i Rt- og W-grupperne skal være større end 4, men ikke overstige 21; at når X er mercapto kan A og A1 ikke være sulfinyl eller sulfo-10 nyl; og at når A og A1 er sulfinyl eller sulfonyl, skal de være i samme oxidationstilstand; (D) når R' er OH, R", Rm og R"" er H, da 15 -Y-CO-R2 hvori Y er et divalent aminoacylradikal med formlen a) -CO-Z-NH- 20 hvori Z er Ci-Cioalkylen eller C5-C6cycloalkylen Ra

25 I b) -CO-CH-CH- hvori R3 er hydroxymethyl, hydroxyethyl, mercaptomethyl, mercaptoethyl, methylthioethyl, 2-thienyl, 3-indolomethyl, phenyl, benzyl, halophenyl, halo-30 benzyl, C1-C3 alkylphenyl, CrC3 alkylbenzyl, Ct-C3 alkylthiophenyl, C1-C3 al-kylthiobenzyl. carbamylphenyl, carbamylbenzyl. C1-C3 alkylcarbamylphenyl eller C1-C3 alkylcarbamylbenzyl; DK 173802 B1 (c) X2 l o hvori X2 er hydrogen eller halo.

5 R"'·' er H, CH3 eller CH2CONH2; og R""" er H eller CH3 R er (A) -CO-alkyl, fortrinsvis fra 6 til 24 carbonatomer, eller 10 (B) -CO-alkenyl, fortrinsvis fra 6 til 24 carbonatomer, (C) når R\ R", R"’ og R,m er OH, og R'"” og R’.....er CH3 da 15 (1) -C-CVOrrCA'ln—CA)p-R,. X X1 O (11) -c-CvOnT-cx’jo—Η- CA)p-Ri eller x’ 25 (111) -c-(w)m— 30 hvori A er divalent oxygen, svovl, sulfinyl eller sulfonyl; DK 173802 B1 A1 er divalent oxygen, svovl, sulfinyl, sulfonyl eller -NH-; X er hydrogen, chlor, brom, iod, nitro, C1-C3 alkyl, hydroxy, C1-C3 alkoxy, mercapto, C1-C3 alkylthio, carbamyl eller C1-C3 alkylcarbamyl; XI er chlor, brom eller iod;

5. NH X ff „ I ff 0'>v'p-NH—^ ' °H 1° 7 CIA) OH 15 og fortrinsvis er 1-[(4R,5R)-4,5-dihyclroxy-N2-(10l12-climethyl-1-oxotetra-decyl)-L-ornithin-5-(threo-3-hydroxy-1-glutamin)echinocandin B.

5. Præparat ifølge krav l.kendetegnet ved, at forbindelsen har formlen 25 DK 173802 B1 Ti ^ O OH -C-CCH2)e-CH-CH2CHCH2CHj fnAf/Yl ,/j OH Λ

6. Præparat ifølge krav 1,kendetegnet ved, at forbindelsen er 1- [(4R,5R)-4,5-dihydroxy-N2-[4-(octyloxy)benzoyl]-L-ornithin]echinocandin B.

7. Anvendelse af et cyclohexapeptid til fremstilling af et lægemiddel til behandling af eller forebyggelse af Pneumocystis carinii infektioner hos patte-2 5 dyr, kendetegnet ved, at cyclohexapeptidet har formlen DK 173802 B1 ΟΗ^ιιΧγ^- -c».-\ J. Vr' «Λγ yV" J OH o I OH ΥΎ) 1 o ?j\h ' °H T (i) K 15 R’ er H eller OH; R" er H eller OH;

20 R"’ er H, OH, -0-alkyl(CrC6). -O-benzyl, eller R1 / -OCH2CH2(CH2)mN; 25 \ R2 hvori R1 er H, Ci-Ci2 alkyl, C3-C7 cycloalkyl, hydroxyethyl, alkoxyethyl med 1-6 carbonatomer i alkoxygruppen, furylmethyl, tetrahydrofurylmethyl, phenyl, 30 phenylalkyl, hvori phenyl kan være substitueret med halo, hydroxy, alkyl med 1-6 carbonatomer og alkoxy med 1-6 carbonatomer; R2 er hydrogen eller alkyl med 1-6 carbonatomer; eller R1 og R2 sammen danner -(CH2)2Q(CH2)2-, DK 173802 B1 hvori Q er en forbindende gruppe, såsom -CH2-, -NH- eller -N-alkyl- med 1-6 carbonatomer; og m er fra 0 til 4; R"” er Heller OH;

8. Anvendelse ifølge krav 7, kendetegnet ved, at cyclohexapeptid-forbindelsen administreres i en dosis på fra 0,5 til 20,0 mg/kg pattedyrs legemsvægt. 15

9. Anvendelse ifølge krav 7,kendetegnet ved, at cyclohexapeptid-forbindelsen administreres til en patient med et svækket immunsystem, som er inficeret med Pneumocystis carinii.

10. Anvendelse ifølge krav 7, kendetegnet ved, at cyclohexapeptid- forbindelsen administreres til en patient, som er inficeret med Pneumocystis carinii og udviser AIDS.