PT1137663E

PT1137663E - Purificação de compostos ciclopéptidos equinocandina

Info

Publication number: PT1137663E
Application number: PT99965156T
Authority: PT
Inventors: Martin Friede; Nathalie Marie-Josephe Garcon
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2006-12-29
Also published as: BR9916101A; ZA200104621B; CN1337968A; EP1137663B1; JP2003511345A; DE69933046T2; IL143563A0; ATE338059T1; CA2353930A1; EP1137663A2; US6506726B1; WO2000034315A8; WO2000034315A3; RU2001118849A; DE69933046D1; AU3113200A; KR20010101151A; AU766091B2; WO2000034315A2; ES2272096T3

Description

ΡΕ1137663 1 DESCRIÇÃO "PURIFICAÇÃO DE COMPOSTOS CICLOPÉPTIDOS EQUINOCANDINA"

ÁREA TÉCNICA A presente invenção relaciona-se com um processo para purificação de compostos Equinocandina que contêm pelo menos um grupo amino protonável, em particular, o processo relaciona-se com a purificação de um composto do tipo Equinocandina por adsorção num meio cromatográfico de fase inversa hidrófobo e eluindo com um gradiente linear quase continuo de cada vez mais ácido acético. Proporciona-se também um processo de purificação para remover selectiva-mente um produto secundário tripéptido-aldeido do processo de fermentação de Equinocandina para dar um composto Equinocandina com pureza mais elevada.

TÉCNICA ANTERIOR

Os ciclopéptidos Equinocandina são produtos naturais que demonstraram ter actividades antifúngicas. Na família de ciclopéptidos Equinocandina estão incluídos produtos naturais como Equinocandina B (ECB), Equinocandina C, Aculeacina Ay, Mulundocandina, Esporiofungina A, Pneumocandina A0, WF11899A, e Pneumocandina B0. Os produtos 2 ΡΕ1137663 naturais são tipicamente produzidos através da cultura de vários microrganismos. Por exemplo, a Equinocandina B é produzida a partir da fermentação do fungo Aspergillus nidulans.

Na procura de materiais mais activos, os produtos naturais foram modificados de vários modos. Uma das modificações mais comuns foi a substituição da cadeia lateral N-acilo do produto natural para produzir um derivado semi-sintético. Por exemplos, as patentes US n°s 4 293 489; 4 320 052; 5 166 135; e 5 541 160; e EP 359529; 448353; 447186; 462531; e 561639 descrevem vários compostos Equinocandina derivados de N-acilo que proporcionam vários graus de actividade antifúngica.

Os derivados N-acilo são produzidos por desacilação do produto natural seguida por reacilação com um grupo acilo diferente. A desacilação é tipicamente conseguida por meio de uma enzima (e.g. enzima desacilase). A enzima desacilase pode ser obtida a partir do microrganismo Actinoplanes utahensis ou espécie Pseudomonas. Ver i.e., patentes US n°s 4 293 482; e 4 304 716; e EP 460 882. Boek et al., Japanese Journal ou Antibiotics, 1989, XLII (3) : 382-288 também descreve a desacilação de Equinocandina B por Actinoplanes utahensis. O composto desacilado é tipicamente referido como o núcleo do produto natural correspondente (i.e., o produto desacilado de Equinocandina B é referido como o núcleo Equinocandina B (ECBN)). Infelizmente, tanto o 3 ΡΕ1137663 processo de fermentação como o processo de desacilação produzem vários produtos secundários que são difíceis de remover e reduzem a pureza do núcleo péptido cíclico desacilado. A patente US n° 4 874 843 descreve um processo cromatográfico utilizando resinas não funcionais num modo inverso para purificar produtos do tipo Equinocandina. Apesar do processo ter melhorado a pureza dos produtos derivados de um processo de fermentação, continuam a ser necessários mais melhoramentos para remover os conta-minantes que são difíceis de separar tanto do núcleo desacilado intermédio como dos compostos activos farmaceuti-camente acilados. Uma vez que a potência do produto farmacêutico final depende da pureza dos intermediários utilizados para preparar o produto final, são altamente desejados melhoramentos em termos de pureza em qualquer passo do processo de fabrico. Idealmente, os contaminantes são removidos num passo o mais precoce possível no processo de fabrico.

Discussões gerais de resinas não funcionais e as suas aplicações em separações cromatográficas líquidas podem ser encontradas em J. Chromatography, 201, 287-292 (1980) e Grieser, M.D. et al, Analytical Chemistry, 45, 1348-1353 (1973). A utilização de gradientes por passos ou contínuos é discutida; porém, os eluentes contêm quantidades significativas de solventes orgânicos. Num processo 4 ΡΕ1137663 de produção, a utilização de solventes orgânicos levanta várias preocupações como regulamentações ambientais (e.g., padrões de emissão relacionados com a qualidade do ar), requisitos de manuseamento especiais (e.g., padrões de flamabilidade) e limitações de eliminação (e.g., regulamentações de resíduos tóxicos). Assim, existe necessidade de um sistema de eluente que minimize a utilização de solventes orgânicos e que ao mesmo tempo separe eficazmente as misturas nos seus componentes puros.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método para separação e purificação de uma grande variedade de compostos do tipo Equinocandina desacilados que contém pelo menos um grupo amino protonável da sua fermentação ou caldos mistos e fluxo de processo parcialmente purificados por adsorção da mistura num meio cromatográfico de fase inversa hidrófobo e eluição com um gradiente de ácido acético aproximadamente linear contínuo na gama desde 0,1% até 10,0% em volume de ácido acético em água, preferencialmente desde 0,5% (pH = 5,5) até 4,0% (pH = 2,5) de ácido acético.

Em particular, a invenção proporciona um método para separação e purificação de compostos Equinocandina desacilados que compreende os passos de: (i) proporcionar uma mistura que compreende um composto Equinocandina desa-cilado que tem a ele ligado pelo menos um grupo amina protonável; (ii) adsorver a referida mistura num meio 5 ΡΕ1137663 cromatográfico de fase inversa hidrófobo; (iii) eluir o composto Equinocandina desacilado com um gradiente acético aproximadamente linear na gama desde 0,1% até 10,0% em volume de ácido acético em água; e (iv) recuperar o referido composto Equinocandina desacilado.

Noutra forma de realização a invenção proporciona um processo para purificar compostos Equinocandina desacilados de uma mistura que contém um produto secundário tripéptido-aldeido que compreende os passos de: (i) proporcionar uma mistura de um composto Equinocandina desacilado e um produto secundário tripéptido-aldeído, (ii) adicionar um agente de derivatização à referida mistura para produzir um produto tripéptido-aldeído derivatizado; e (iii) separar o referido composto Equinocandina desacilado do referido produto tripéptido-aldeído derivatizado utilizando cromatografia de fase inversa hidrófoba e eluir com um gradiente ácido acético aproximadamente linear contínuo.

Tal como aqui utilizado, o termo "agente de derivatização" refere-se a um reagente com aptidão para reagir com a funcionalidade aldeído do produto secundário tripéptido para produzir um intermediário que é suficientemente diferente em hidrofobidade para permitir a separação do intermediário tripéptido do composto do tipo Equinocandina desejado. O termo "grupo amino protonável" refere-se a um 6 ΡΕ1137663 grupo amino que sofre protonação quando é submetido às condições de eluição da presente invenção (i.e., 0,1% até 10% em volume de ácido acético em água. O termo "compostos do tipo Equinocandina" refere-se a compostos que têm a estrutura geral seguinte incluindo quaisquer dos seus derivados simples:

em que RI é -H ou OH; R2 é -H ou CH3; R3 é -H, -CH3, CH2CONH2, ou -CH2CH2NH2; R4 é -H ou -OH; R5 é -OH, -0P03H2, ou -OSO3H; R6 é -H ou -OSO3H; e R7 é CH3. "Núcleo Equinocandina" refere-se ao composto Equinocandina desa-cilado em que R é um hidrogénio. "ECBN" refere-se ao núcleo Equinocandina B em que Rl, R4 e R5 são grupos hidroxilo, R2, R3 e R7 são grupos metilo; e Rl e R6 são hidrogénios. 0 termo "alquilo" refere-se a um radical hidrocarboneto de fórmula geral ΟηΗ2η+ι que contém desde 1 até 30 átomos de carbono a menos que contrariamente 7 ΡΕ1137663 indicado. 0 radical alcano pode ser linear (e.g. metilo, etilo, propilo, butilo, etc.), ramificado (e.g., isopro-pilo, isobutilo, butilo terciário, neopentilo, etc.), cíclico (e.g. ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, metilciclopentilo, ciclohexilo, etc.) ou multicíclico (e.g. biciclo[2.2.1]heptano, spiro[2.2]pentano, etc). 0 radical alcano pode estar substituído ou não substituído. Do mesmo modo, a porção alquilo de um grupo alcoxi ou alcanoato tem a mesma definição como acima. 0 termo "alcenilo" refere-se a um hidrocarboneto acíclico que contém pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. 0 radical alceno pode ser linear, ramificado, cíclico ou multi-cíclico. 0 radical alceno pode estar substituído ou não substituído. 0 termo "alcinilo" refere-se a um hidrocarboneto acíclico que contém pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. 0 radical alcino pode ser linear ou ramificado. 0 radical alcino pode estar substituído ou não substituído. 0 termo "arilo" refere-se a unidades aromáticas que têm um sistema de anel simples (e.g. fenilo) ou fundido (e.g. naftaleno, antraceno, fenantreno, etc.). Os grupos arilo podem estar substituídos ou não substituídos. 0 termo "heteroarilo" refere-se a unidades aromáticas que contêm pelo menos um heteroátomo dentro do sistema de anel aromático (e.g. pirrole, piridina, indole, ΡΕ1137663 tiofeno, furano, benzofurano, imidazol, pirimidina, purina, benzimidazol, quinolina, etc.). A unidade aromática pode consistir num sistema de anel simples ou fundido. Os grupos heteroarilo podem estar substituídos ou não substituídos.

Dentro do campo da química orgânica e particularmente dentro do campo da bioquímica orgânica, é amplamente compreendido que uma substituição significativa dos compostos é tolerada ou mesmo útil. Na presente invenção, por exemplo, o termo grupo alquilo permite substituintes que sejam um alquilo clássico, como metilo, etilo, propilo, hexilo, isooctilo, dodecilo, esteralilo, etc. 0 termo "grupo" contempla especificamente e permite substituições em alquilos que são comuns na técnica, como hidroxilo, halogéneo, alcoxi, carbonilo, ceto, ester, carbamato, etc., incluindo também a unidade alquilo não substituída. No entanto, é geralmente compreendido pelos especialistas na técnica que os substituintes devem ser seleccionados de forma a não afectar de forma adversa as características farmacológicas do composto ou interferir adversamente com a utilização do medicamento. Substituintes adequados para qualquer dos grupos acima definidos incluem alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, halogeno, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, mercapto, alquiltio, ariltio, mono- e di-alquil amino, sais de amónio quaternários, aminoalcoxi, hidroxialquilamino, aminoalquiltio, carbamilo, carbonilo, carboxilo, glicolilo, glicilo, hidrazino, guanilo e as suas combinações. ΡΕ1137663 9

MELHOR FORMA DE REALIZAR A INVENÇÃO

Os caldos de fermentação e mistos contêm vários produtos secundários que são muito difíceis de separar do produto ciclopéptido desejado. "Caldo misto" refere-se a uma mistura de conversão em que o caldo de fermentação é tratado directamente com uma enzima desacilante sem purificação para produzir o produto desacilado (e.g. ECBN). Utilizou-se cromatografia líquida de fase inversa no passado com um sucesso razoável; porém, a necessidade de compostos com pureza mais elevada requer métodos de purificação melhorados. Os requerentes verificaram que a separação dos produtos de fermentação secundários do produto de fermentação desejado que contém um grupo amino protonável pode ser melhorada com a utilização de um meio cromatográfico de fase inversa em combinação com um esquema de eluição de ácido acético aproximadamente linear contínuo.

Os meios cromatográficos hidrófobos adequados incluem sílicas de fase inversa e polímeros orgânicos como copolímeros de estireno e divinilbenzeno, polímero de metacrilato. Várias sílicas de fase inversa estão comercialmente disponíveis de fabricantes como BTR, E. Merck, Eka Nobel, Millipore, Phenomenex, Whatman, ou YMC. As sílicas são derivatizadas com alquil hidrocarbonetos de cadeia linear de comprimento variável desde Ci a Cis (sendo Ci, C4, Os e Cis os mais comuns) ou outros ligandos 10 ΡΕ1137663 hidrófobos como (e.g. fenilo ou ciano) . Várias resinas de estireno/divinilbenzeno para cromatografia liquida de fase inversa estão também disponíveis comercialmente como resinas HP e SP Diaion™ (disponíveis de Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tóquio, Japão), e Amberlite XAD-2,4, e resinas 16 (disponíveis de Rohm and Haas Chemical Co., Filadélfia, PA), e resinas CG-161, 300, e 1000 Amberchrom de Toso Haas (Montgomeryville, PA) . As resinas não funcionais são geralmente caracterizadas pelo seu volume de poro (0,5-4,5 mL/g), área de superfície específica (200— 800m2/g), diâmetro de poro (40-1300 A), distribuição do tamanho de poro e/ou distribuição do tamanho de esfera. As resinas não funcionais preferidas incluem Diaion HP-20 com uma área de superfície de 500 m2/g, um tamanho de poro de 200-300 A e tamanho de partícula de 200-800 pm; tendo SP-825 uma área de superfície de 1000 m2/g, tamanho de poro de 50-60 A e tamanho de partícula de 250-600 pm; tendo SP-207 (versão bromada de HP-20) uma área de superfície de 630 m2/g, tamanho de poro de 100-200 A e tamanho de partícula de 200-800 pm; e tendo CG-161CD uma área de superfície de 900 m2/g, tamanho de poro de 110-175 A, e tamanho de partícula de 80-160 pm. São mais preferidas as resinas HP-20 e SP-825.

Inicialmente, proporciona-se uma solução em bruto ou parcialmente purificada que contém o composto péptido cíclico desejado que tem pelo menos um grupo amino protonável. Geralmente, o grupo amino pode ser protonado 11 ΡΕ1137663 durante o curso do gradiente ácido acético com pH na gama desde 5,5 a 2,5. Preferencialmente o grupo amino é uma amina primária; contudo, o grupo amino pode ser uma amina secundária ou terciária desde que os substituintes adicionais no átomo de azoto não sejam suficientemente hidrófobos para ultrapassar a polaridade da amina com carga positiva. A solução pode originar de um processo de fermentação ou de um processo sintético. Por exemplo, os compostos péptidos cíclicos podem ser preparados pelos métodos sintéticos descritos na patente US n° 5 696 084; J.

Am. Chem. Soc., 108, 6041 (1986) ; Evans, D. A., et al ., J. Am. Chem. Soc., 109, 5151 (1987); J. Med. Chem., 35, 2843 (1992); e Kurokawa, N., et al. , Tetrahedron, 49, 6195 (1993) . A solução em bruto é geralmente um caldo misto. Alternativamente, o processo pode ser utilizado para purificar mais (ou polir) material parcialmente purificado.

Dependendo do processo de fermentação especifico utilizado, pode ser desejável pré-filtrar a solução para remover partículas que podem interferir com o processo cromatográfico. A filtração pode ser conseguida por qualquer forma conhecida pelos especialistas na técnica incluindo filtração por gravidade, filtração por vácuo através de um filtro cerâmico que pode ou não incluir um auxiliar de filtração Celite™, etc. Os sólidos no caldo de fermentação podem também ser removidos por centrifugação seguida por decantação do líquido dos sólidos. 12 ΡΕ1137663 A solução de fermentação pode ser concentrada se desejado utilizando vários meios que são também bem conhecidos pelos especialistas na técnica como concentração por evaporação, liofilização, etc. 0 concentrado pode ser filtrado uma segunda vez para remover qualquer precipitado que se possa ter formado durante o processo de concentração . A solução em bruto ou parcialmente purificada é carregada numa coluna de cromatografia empacotada com um dos meios cromatográficos hidrófobos acima descritos. 0 produto péptido cíclico desejado é então eluído do meio cromatográfico utilizando um gradiente aproximadamente linear contínuo na gama desde 0,1% até 10% de ácido acético, preferencialmente desde cerca de 0,5% (pH = 5,5) até cerca de 4% ácido acético (pH = 2,5) . A extremidade superior da gama de concentração de ácido acético é baseada na estabilidade do meio cromatográfico utilizado e na estabilidade do composto a ser purificado nesse pH. A extremidade inferior da gama é seleccionada com base no pH a que o grupo amino é protonado e na concentração de ácido acético requerida para eluir o produto da superfície hidrófoba. Os especialistas na técnica compreenderão que o gradiente não tem de ser perfeitamente linear. Dentro do significado de "aproximadamente linear" está incluído um gradiente plano convexo ou côncavo.

No final do passo do processo de eluição do gradiente, um volume adicional da solução de ácido acético 13 ΡΕ1137663 com concentração mais elevada é tipicamente utilizado para completar a eluição. No final do processo, a coluna pode ser regenerada de forma a que a coluna possa ser reutilizada para ciclos de purificação adicionais. 0 passo de regeneração envolve tipicamente lavar a coluna com misturas de um solvente orgânico e água a um pH neutro e alcalino para remover quaisquer materiais residuais deixados na matriz da coluna. Solventes adequados incluem acetonitrilo, metanol, isopropanol e acetona. 0 esquema de eluição de ácido acético linear proporciona não só boa selectividade (ver, i.e., Exemplo 1 abaixo), mas também limita a utilização de solventes orgânicos ao passo de regeneração do funcionamento da coluna. Assim, tanto a quantidade absoluta do solvente orgânico utilizado e o volume de efluente da coluna que tem de ser tratado antes da eliminação são minimizados. 0 produto de fermentação pode ser recuperado do eluato utilizando vários métodos. Os métodos de recuperação adequados incluem cristalização, concentração por evaporação e liofilização. 0 caldo de fermentação para Equinocandina B contém diferentes níveis de um produto secundário tri-péptido-aldeído (Asn-Gln-Leu-H) com a estrutura química seguinte (Ia). 0 produto secundário tripéptido-aldeído sofre desacilação bem como Equinocandina B durante o processo de desacilação enzimática para formar o tripéptido-aldeído desacilado correspondente (Ib). 14 - ΡΕ1137663

em que R é C (0) CH2CH (OH) C9H19 fermentação) ou um hidrogénio desacilação de um caldo misto) (Ia- produto secundário de (Ib- produto secundário de

Surpreendentemente, 0 tempo de retenção do tri-péptido-aldeido desacilado é muito semelhante a ECBN em cromatografia liquida de fase inversa, mesmo em condições de eluição óptimas, tornado assim muito difícil separar o tripéptido-aldeído desacilado (Ib) do ECBN desejado. Se o tripéptido não for removido, então o grupo amino livre do tripéptido compete com o grupo amino livre do composto ECBN durante o processo de reacilação. Como resultado, tem de se adicionar um excesso de composto acilante para assegurar a acilação completa do composto ECBN. 0 contaminado tripéptido não só consome materiais de partida necessários com também produz um produto secundário acilado que é difícil de remover na purificação subsequente do composto ECB acilado. Preferencialmente, o produto secundário tripéptido é removido antes da reacilação do composto ECBN. 15 ΡΕ1137663 0 produto secundário tripéptido-aldeído pode ser removido da mistura de fermentação ou do caldo misto (i.e., mistura de desacilação) fazendo reagir o aldeído com um agente de derivatização antes da purificação cromato-gráfica. 0 agente de derivatização pode se adicionado à funcionalidade aldeído para alterar o tempo de retenção cromatográfico do tripéptido-aldeído em relação ao composto ECB desejado. Os agentes de derivatização adequados incluem bissulfito de sódio, hidroxilamina e cloridrato de semi-carbazida. Algumas vantagens de utilizar agentes de derivatização em relação a outros meios para modificar o tempo de retenção cromatográfico são a selectividade dos agentes de derivatização para a funcionalidade aldeído e as condições suaves em que a reacção ocorre. Se a reacção entre o agente de derivatização e o tripéptido-aldeído é reversível, então o aldeído pode ser facilmente recuperado pela remoção do agente de derivatização. 0 tripéptido recuperado pode ser então utilizado para outros fins.

EXEMPLOS

As abreviaturas seguintes são utilizadas nos exemplos para representar os respectivos materiais enumerados : ACN - acetonitrilo

TFA ácido trifluoroacético 16 ΡΕ1137663 ΗΡ-20 - resina de estireno/divinilbenzeno com uma área de superfície de 500 m2/g, tamanho de poro de 200-300 Á e tamanho de partícula de 200-800 pm. SP-825 - resina de estireno/divinilbenzeno com uma área de superfície de 1, 000 m2/g, tamanho de poro de 50-60 Â e tamanho de partícula de 250-600 pm. SP-207- resina de estireno/divinilbenzeno bromada com uma área de superfície de 630 m2/g, tamanho de poro de 100-200 Â e tamanho de partícula de 200-800 pm. CG-161CD - resina de estireno/divinilbenzeno com uma área de superfície de 900 m2/g, tamanho de poro de 110-175 Ã, e tamanho de partícula de 80-160 pm.

Preparação cromatográfica e procedimentos de purificação de ECBN:

Utilizou-se colunas de vidro na gama de tamanho desde 0,2 até 5 litros. As matrizes cromatográficas estudadas incluíram HP-20, SP-825 e SP-207 (todas disponíveis de Mitsubishi) e CG-161cd (disponível de Toso Haas). As matrizes foram lavadas em lotes com 50/50 água/ACN, hidróxido de sódio 0,1 M, e por fim acetonitrilo puro (ACN) antes do empacotamento da coluna. A matriz de escolha foi empacotada na coluna de tamanho apropriado utilizando técnicas simples de assentamento de suspensão. Os ensaios 17 ΡΕ1137663 com colunas de tamanho inferior a um litro foram conduzidos utilizando instrumentação FPLC convencional (disponível de Pharmacia). Os ensaios com colunas de cinco litros foram conduzidos utilizando um sistema controlador Walters Delta Prep 3000.

As misturas ECBN foram clarificadas por filtração utilizando filtros Cuno 30S antes de serem carregadas nas respectivas colunas. As colunas HP-20 e SP-825 foram pré-equilibradas em 0,5% de ácido acético (HOAc), ajustado para um pH de 5,5 com hidróxido de sódio (NaOH) , e carregadas com a solução ECBN clarificada. As colunas HP-20 foram carregadas a aproximadamente 5 a 5,5 g de ECBN/litro de resina empacotada enquanto as colunas SP-825 foram carregadas a aproximadamente 11 a 12 g/litro. Após o carregamento, as colunas foram lavadas com 5 volumes de coluna (CV) de tampão de equilíbrio. O produto foi eluído utilizando 5 CV de um gradiente linear contínuo na gama desde 0,5 (pH = 5,5) até 4% (pH = 2,5) de HOAc. No final do gradiente, utilizou-se mais 2 CV da solução de 4% de HOAc para completar a eluição. Durante a eluição do produto, foram recolhidas fracções de 0,2 CV. As fracções foram caracterizadas por vários métodos de HPLC de fase inversa (RP-HPLC) e as fracções apropriadas foram combinadas para dar a reserva principal. As colunas foram regeneradas por lavagem com 3 CV de uma mistura 60/40 de ACN e água, seguida por 3 CV de uma mistura 60/40 de ACN e NaOH 0,1 M. Os caudais utilizados durante a operação foram 2 CV/hora 18 ΡΕ1137663 (150 cm/hora) por carregamento, lavagem, regeneração e reequilíbrio e 1 CV/hora (75 cm/hora) para eluição. As reservas principais foram concentradas.

Para comparação, as condições de fase móvel seguintes (modificador orgânico e pH) e perfis de eluição de gradiente foram estudadas para além do tipo da matriz.

Modificador ACN: Os Exemplos 1-3, utilizaram 5 CV de gradiente ACN linear (pH 5,5 com tampão de acetato).

Eluição com ácido acético: Além das condições anteriormente descritas, a concentração do ácido acético foi aumentada para 5% (Exemplo 10). Um gradiente por passos e gradiente convexo foram também comparados com o gradiente linear continuo acima descrito nas colunas HP-20 e SP-825 (Exemplos 13-19).

Caracterização analítica das amostras: A qualidade e quantidade das amostras cromatográ-ficas ECBN foram avaliadas utilizando os métodos analíticos seguintes.

Sistema fosfato: Uma coluna Zorbox SB C-18, partículas 3,5 micron (0,46 cm ID x 15 cm), foi eluída com uma fase móvel de 0,2% de ácido fosfório/ACN a uma caudal de 1,0 mL/min. A coluna foi operada a 40°C e o efluente foi 19 ΡΕ1137663 monitorizado a 210 nm. A coluna é equilibrada em 1% de ACN e após a injecção da amostra, utilizou-se um gradiente na gama de 1 a 18,5% de ACN durante 9 minutos para eluir ECBN. Após a eluição, a coluna foi lavada com 50% de ACN para eluir quaisquer componentes altamente retidos.

Sistema fosfato/ácido octanossulfónico (OSA): Este sistema é semelhante ao sistema fosfato acima descrito, com a excepção de que a fase móvel contém 30 mM de OSA. A coluna é equilibrada com 9% de ACN. Após a amostra ser injectada, a eluição de ECBN é conseguida com um gradiente na gama desde 9 a 24% de ACN durante 9 minutos. A coluna foi então lavada com 50% de ACN para eluir componentes altamente retidos. O caudal da coluna e detector de comprimento de onda foram como acima, enquanto que a temperatura da coluna foi de 50°C. Este sistema é particularmente útil para quantificar o componente Asn-Gln-Leu-H tripéptido-aldeido.

Sistema TFA: Utilizou-se uma coluna Vydac C-18, 3,5 micron (0, 46 x 25 cm) para o ensaio. A fase móvel continha 0,1% de TFA e eluição foi conseguida utilizando um gradiente ACN linear de 0 a 10% durante 20 minutos, seguido por uma lavagem de coluna de 50%. O caudal, temperatura e detector de comprimento de onda foram iguais ao sistema fosfato acima descrito. A análise de aminoácido (AAA) foi também conduzida em amostras como método alternativo para determinar o 20 ΡΕ1137663 conteúdo de tripéptidos. As amostras foram hidrolisadas com ácido, e as moles de Asn, Gin, e Thr no hidrolisado foram determinadas por cromatografia de troca iónica e derivatização com ninidrina. Utilizou-se a recuperação de Thr para determinar as moles de ECBN na amostra, enquanto o conteúdo de Gin representou os níveis de tripéptidos. A % molar (%M) do Asn-Gln-Leu-H tripéptido versus ECBN foi calculada utilizando a equação seguinte: %M Asn-Gln-Leu-H = 2x[Gin]/[Thr]

As medições de densidade óptica (OD) foram realizadas em amostras seleccionadas no comprimento de onda especificado para estimar a turbidez relativa das amostras (OD @550nm) ou conteúdo total de proteína (OD @280 nm).

Proporciona-se os exemplos seguintes para ilustrar mas não limitar a invenção reivindicada.

Exemplo 1 O Exemplo 1 compara os processos cromatográficos RP-HPLC utilizando um esquema de eluição de acetonitrilo com um esquema de eluição de ácido acético em combinação com diferentes resinas não-funcionais. A tabela 1 sumaria os resultados observados utilizando os esquemas de eluição e meios de coluna designados. ΡΕ1137663 21

Tabela 1

Ex. na Tipo de matriz Carga da coluna* Esquema de eluição Rendimento ECBN Pureza RP-HPLC % impureza desmetilob Volume da reserva 1* HP-2 0 3, 8 0-10% de ACN pH 5,5 84% 77, 5% 2,09% 2, 7 2* HP-2 0 7, 7 0-10% de ACH pH 5,5 66% 76% 1,2% 4,2 3* HP-2 0 10, 0 0-10% de ACN pH 5,5 48% 52,3% 1,2% 4,2 4* HP-2 0 6, 0 0 , 5%-4% de HOAc gradiente por passos 82% 70,5% 11, 4% 1,8 5 HP-2 0 6, 0 0,5-4% de HOAc gradiente linear 7 69% 89% 1, 8% 3,5 6 SP-207 12, 0 0,5-4% de HOAc gradiente linear 7 77% 83% 6,35% 3,9 7 CG-161 6, 0 0,5-4% de HOAc gradiente linear 7 59% 90,2% 1,3% 3,01 8 CG-161 10, 0 0,5-4% de HOAc gradiente linear 7 75,2% 83% 2,5% 4, 7 9* CG-161 8, 0 100 mM de H3P04 51% 83% 3,3% 4, 4 10 SP-825 12, 0 0,5-5% de HOAc gradiente linear 7 72% 78,5% 5,5% 2,8 11 SP-825 14, 0 0,5-4% de HOAc gradiente linear 5 70% 82% 3,57% 3,0 12 SP-825 18, 0 0,5-4% de HOAc gradiente linear 5 83% 85% 4, 0% 4, 8% 13 HP-2 0 6,0 0,5-4% de HOAc gradiente linear 5 70,5% 85% 2,68% 2,5 14* HP-20 6,0 0,5—4% de HOAc convexo 1 CV 65% 81,6% 3, 11% 1,44 15* HP-20 6,0 0,5-4 de HOAc gradiente por passos 38,5% 80,4% 2,93% 0, 77 16 SP-825 9, 1 0,5-4% de HOAc gradiente linear 5 77% 92% 2,6% 2,9 17* SP-825 9, 1 0,5-4% de HOAc gradiente convexo 58% 91% 2,5% 2, 7% 18* SP-825 9, 1 0,4-4% de HOAc gradiente por passos 56,6% 89% 3,4% 2,3 19 SP-825 11,8 0,5-4% de HOAc gradiente linear 5 59% 87% 2,8% 2,6 20 HP-20 5,0 0,5-4% de HOAc gradiente linear 5 81% 88% 2,2% 2,6% 21 HP-20 6,3 0,5-4% de HOAc gradiente linear 5 81% 86% 3,3% 3,0

Na Tabela 1, *Exemplos comparativos; aMedido em gramas de ECBN por litro de resina, bImpureza de desmetilo refere-se a uma mistura dos dois compostos ECBN em que falta o grupo metilo nas unidades péptidas treonina e metil prolina, respectivamente. 22 ΡΕ1137663 0 esquema modificador (ACN) proporcionou bom rendimento, pureza global e resolução dos componentes desmetilo; no entanto, acetonitrilo é um solvente orgânico. A Tabela 1 mostra claramente que o ácido acético proporciona uma alternativa aos esquemas de eluição com solvente orgânico tradicionais. Os dados mostram também que um gradiente continuo de ácido acético aumenta significativamente a resolução em comparação a um gradiente por passos ou gradiente convexo de ácido acético. Apesar do rendimento do produto para o Exemplo 5 (gradiente linear) ser ligeiramente mais baixo e o volume de reserva maior em comparação com o Exemplo 4 (gradiente por passos), a pureza global de ECBN é mais elevada (83% vs. 71%) e o conteúdo de desmetilo é mais baixo (2% vs. 11%).

Acredita-se que a eluição de ECBN da matriz hi-drófoba utilizando o processo de eluição com ácido acético é conseguida de duas formas: (1) o ácido acético actua como um modificador orgânico, aumentando assim a força de eluição da fase móvel, e (2) o pH mais baixo do solvente B (solvente de eluição forte, pH = 2,5) serve para protonar a funcionalidade amina de ECBN tornando-a mais polar e assim menos retida pela fase estacionária hidrófoba. Tanto o modificador orgânico e o pH que afecta a solução de 4% de ácido acético são evidentes na comparação dos Exemplos 8 e 9. No exemplo 9, 100 mM de ácido fosfórico (pH = 2,5) foi substituído por 4% de HOAc (pH = 2,5) como o solvente B. Se a eluição de ECBN estivesse apenas dependente do pH da fase 23 ΡΕ1137663 móvel, a posição de eluição e recuperação de ECBN deveriam ser semelhantes às observadas no Exemplo 8. Na realidade, a eluição com fosfato resultou em apenas 50% de recuperação de ECBN e o pico do produto mostrou um grau significativo de arrastamento. Assim 4% de HOAc pode provocar a eluição ao baixar o pH da fase móvel e aumentar a força de eluição da fase móvel ao actuar como um modificador orgânico. 0 ácido acético proporciona maior selectividade do que acetonitrilo. Quando se compara os cromatogramas RP-HPLC para as reservas recolhidas das colunas HP-20 eluidas com ACN versus HOAc (Exemplos 1 e 5, respectivamente) , observou-se uma ausência de impurezas de fundo na reserva eluída utilizando HOAc. No esquema de eluição HOAc, estes componentes não são eluídos até a coluna ser regenerada.

Exemplo 2 O Exemplo 2 compara processos cromatográficos utilizando um esquema de eluição de coluna simples/ácido acético linear (acima descrito) com um esquema de eluição coluna dupla/acetonitrilo convexo. Além disso, uma comparação entre lotes não tratados de ECBN (Exemplos 2-8 e 2-10) com lotes de ECBN tratados com metabissulf ito de sódio antes da purificação na coluna (Exemplos 2-7 e 2-9) é descrita. O pré-tratamento com metabissulfito de sódio foi conseguido pela simples adição de 10 mM de metabissulfito de sódio à carga da coluna e permitir a agitação da solução durante um período de 6-18 horas. O processo de coluna 24 ΡΕ1137663 simples é o mesmo como descrito acima utilizando um esquema de eluição de gradiente ácido acético linear. 0 processo de coluna dupla comparativo utiliza duas colunas HP-20 que operam numa configuração "lead-trail". Um caldo de fermentação é carregado em duas colunas HP-20 ligadas em série. Qualquer ECBN que não seja retido na primeira coluna é concentrado na segunda coluna. Acredita-se que ECBN é distribuído em proporções aproxima-damente iguais entre as duas colunas. Após o carregamento, a coluna "lead" é desligada e lavada com 3,8 volumes de coluna (CV) de água. A eluição da coluna "lead" é conseguida por lavagem com 3,3 CV de 5% de HOAc. A reserva da primeira coluna é ajustada para um pH de 5,0 e carregada na segunda coluna ("trail") parcialmente carregada. A coluna é lavada com 6,3 CV de água antes da eluição. Utiliza-se um gradiente acetonitrilo convexo (0-9,4% em cerca de 5 CV contendo 5% de HOAc) para eluir a coluna. O efluente da coluna é fraccionado e as fracções com a pureza desejada (superior a 75% da pureza do pico principal deHPLC fase inversa e inferior a 10% de componente desmetilo) são combinadas como reserva. A solução combinada é então concentrada. A Tabela 2 compara os resultados observados para o processo da coluna simples versus o processo cromatográfico de coluna dupla, e os caldos de fermentação de ECBN tratado versus ECBN nao tratado. ΡΕ1137663 25

Tabela 2

Pureza ECBN após purificação da coluna Pureza Cristal ECBNe Ex. Na Tipo de coluna e configuração Carga Coluna (g/L) %MPb %Des° % tripéptido Purezad ECBN/OD RO Potência 2-1 HP-2 0 5,0 88,4 1,8 7, 0 0, 71 74, 9 2-2 SP-825 12,0 88,2 1,9 6,2 0,59 73, 1 2-3 HP-20/HP-20 84/7 2,2 7,1 0,53 60,5 2-4 HP-20 5,3 83,0 2,0 11,8 0,69 76,4 2-5 SP-825 12,0 79,4 2,3 12, 7 0,68 63, le 2-6 HP—20/HP-20 81,9 1, 7 12,8 0,67 76,8 2-7 HP-20 4,8 87, 7 1,8 1,5 0,65 74,3 2-8 HP—20/HP-20 84,6 1,9 7, 9 0,62 2-9 SP-825 10,5 88,2 3,2 3,3 0,56 2-10 HP-20/HP-20 79,6 2,8 13,6 0,68

Na Tabela 2, os aValores descritos representam a média de duas cristalizações independentes e determinações analíticas; b%Pico principal versus área de pico RP-HPLC total; c%impurezas de desmetilo; dECBN/OD = gramas de ECBN (RP-HPLC)/Total gramas OD; em que gramas OD OD@280 nm e assumindo Eo,i% de 1,0; eUm dos dois lotes tinha elevado conteúdo de água; por isso a potência média foi reduzida.

Os resultados analíticos descritos acima para pureza de ECBN foram obtidos após as reservas terem sido concentradas. Tanto a pureza de pico principal HPLC de fase inversa como os níveis de desmetilo são semelhantes para os ensaios com coluna HP-20 simples e coluna SP-825. No entanto a operação HP-20 simples rendeu de forma consistente uma redução ligeiramente maior no componente desmetilo. Em geral, a pureza HPLC fase inversa de ECBN do processo de coluna simples é equivalente ou melhor do que a 26 ΡΕ1137663 pureza de ECBN do processo de duas colunas proporcionando assim um meio mais económico de purificação.

Nenhum dos esquemas de purificação em coluna foram capazes de reduzir significativamente o nivel de tripéptidos; no entanto, pré-tratamento com bissulfito de sódio reduziu significativamente a quantidade de impurezas tripéptidas. A pureza ECBN/OD do produto dos estudos das colunas simples foi equivalente ou maior do que a obtida nos estudos com duas colunas. Apesar do valor ECBN/OD não representar uma medida de pureza absoluta, proporciona uma boa comparação relativa da pureza de ECBN resultando de várias operações de coluna. Todas as operações de coluna deram um aumento de 10-15 vezes da pureza de ECBN/OD quando os valores para as soluções de carga das colunas (dados não mostrados) são comparados aos doas reservas concentradas.

Lisboa, 16 de Outubro de 2006

Claims

ΡΕ1137663 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para separar e purificar compostos Equinocandina desacilados que compreende os métodos de: (i) proporcionar uma mistura que compreende um composto Equinocandina desacilado que tem a si ligado pelo menos um grupo amino protonável; (ii) adsorver a referida mistura num meio cromatográfico de fase inversa hidrófobo; (iii) eluir o composto Equinocandina desacilado com um gradiente de ácido acético aproximadamente linear na gama desde 0,1% até 10% em volume de ácido acético em água; e (iv) reconverter o referido composto Equinocandina desacilado .
2. Método da reivindicação 1, em que o referido gradiente de ácido acético está na gama desde 0,5% até 4,0% em volume de ácido acético em água.
3. Método da reivindicação 1, em que o referido composto Equinocandina desacilado é representado pela estrutura seguinte: 2 ΡΕ1137663

em que RI é -H ou -OH; R2 é -H ou CH3; R3 é -H, -CH3, -CH2CONH2 ou -CH2CH2NH2; R4 é -H ou -OH; R5 é -OH, -OPO3H2, ou -OSO3H; R6 é -H ou -0S03H; e R7 é CH3.
4. Método de qualquer das reivindicações 1-3, em que o referido meio de fase inversa hidrófobo é um polímero orgânico.
5. Método da reivindicação 4, em que o referido polímero orgânico é um copolímero de estireno e divinil-benzeno ou ou polímero de metacrilato.
6. Método da reivindicação 4 ou 5, em que o referido polímero orgânico é uma resina de estireno/divi-nilbenzeno com uma área de superfície de 500 m2/g, tamanho de poro de 200-300 A e tamanho de partícula 200-800 pm; ou uma resina de estireno/divinilbenzeno com uma área de superfície de 1 000 m2/g, tamanho de poro de 50-60 A e tamanho de partícula de 250-600 pm. 3 ΡΕ1137663
7. Método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida mistura é um produto de um caldo misto.
8. Processo para purificar compostos Equinocan-dina desacilados a partir de uma mistura que contém um produto secundário tripéptido-aldeído que compreende os passos de: (i) proporcionar uma mistura de um composto Equinocandina desacilado e um produto secundário tripéptido-aldeido; (ii) adicionar um agente de derivatização à referida mistura para produzir um produto tripéptido-aldeido deriva-tizado; e (iii) separar o referido composto Equinocandina desacilado do referido produto tripéptido-aldeido derivatizado utilizando cromatografia de fase inversa hidrófoba e eluir com um gradiente continuo de ácido acético aproximadamente linear.
9. Processo da reivindicação 8, em que o gradiente de ácido acético aproximadamente linear é um gradiente na gama desde 0,1% até 10,0% em volume de ácido acético em água.
10. Processo da reivindicação 8 ou 9, em que o referido passo de separação (iii) compreende: 4 ΡΕ1137663 (a) adsorver a referida mistura de produto tripéptido-aldeido derivatizado e composto Equinocandina desacilado num meio cromatográfico de fase inversa hidrófobo; e (b) eluir o composto Equinocandina desacilado com um gradiente de ácido acético aproximadamente linear na gama desde 0,1% até 10% em volume de ácido acético em água.
11. Processo de qualquer das reivindicações 8-10 em que o referido composto Equinocandina desacilado é representado pela estrutura seguinte:

em que RI é -H ou -OH; R2 é -H ou CH3; R3 é -H, -CH3, -CH2CONH2 ou -CH2CH2NH2; R4 é -H ou -OH; R5 é -OH, -0P03H2, ou OSO3H; R6 é -H ou -OSO3H; e R7 é CH3.
12. Processo de qualquer das reivindicações 8-13, em que o referido produto secundário aldeído é representado pela estrutura seguinte: 5 ΡΕ1137663

em que R é - (C (0) CH2CH (OH) C9H19 ou um hidrogénio.
13. Processo de qualquer das reivindicações 8- 12, em que a referida mistura é um produto de um caldo de fermentação.
14. Processo de qualquer das reivindicações 8- 13, em que a referida mistura é um produto de um caldo de fermentação misto.
15. Processo de qualquer das reivindicações 8- 14, em que o referido agente de derivatização é selec- cionado do grupo que consiste em bissulfito de sódio, hidroxil amina e cloridrato de semicarbazida.
16. Processo da reivindicação 15, em que o referido agente de derivatização é bissulfito de sódio. Lisboa, 16 de Outubro de 2006