CN103483427A

CN103483427A - 一种棘白菌素类化合物的纯化方法

Info

Publication number: CN103483427A
Application number: CN201210199073.9A
Authority: CN
Inventors: 杨华剑; 梁陈宏; 周永健; 陈�峰; 王玲萍; 郑玲辉; 白骅
Original assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-06-09
Filing date: 2012-06-09
Publication date: 2014-01-01

Abstract

本发明涉及一种棘白菌素类化合物的纯化方法，尤其是指WF11899A的纯化方法。该方法包括预纯化溶液的制备、树脂层析分离、结晶等过程。本发明的方法具有简单、不使用混合溶剂、样品纯度高等优点。

Description

一种棘白菌素类化合物的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种棘白菌素类化合物的纯化方法，尤其是指WF11899A的纯化方法。

背景技术

棘白菌素类化合物具有抗真菌作用，包括棘白菌素B、WF11899A、棘白菌素C、肺粘菌素A0、肺粘菌素B0等。这类化合物可以进一步制备得到半合成化合物，如卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净等。棘白菌素类化合物有微生物发酵得到，含有大量的副产物。这些副产物在后续的分离纯化中往往很难除去。

US5021403公开了一种棘白菌素化合物的色谱纯化方法，该方法包括反复的树脂吸附，以及硅胶层析，过程繁杂。W02008048627公开了一种棘白菌素类化学物的纯化方法，包括萃取、洗涤、沉淀等。沉淀过程中需要加混合溶剂，而且沉淀需要加硅藻土等载体，否则沉淀物成油状很难过滤，且提纯效果也不明显。US20100249371公开了一种棘白菌素化合物盐吸附剂纯化方法，包括反复的吸附、洗涤、洗脱等步骤。盐吸附剂稳定性不好，实际操作比较困难。这些专利提到棘白菌素类化合物的方法，特别涉及的是棘白菌素B的纯化方法，并不针对WF11899A的纯化。

发明专利US6506726、EP1137663、CN99815515公开了分离和纯化环肽类产品的方法，其包括：含有环肽化合物的混合物吸附到疏水的反相层析介质上，用连续地近乎线性的0.1-10％的乙酸水溶液进行梯度洗脱。该方法可以用来分离棘白菌素母核，但是在进行分离WF11899A时，0.1-10％乙酸梯度都无法洗脱化合物，且化合物在酸性条件下容易降解破坏。

发明专利CN201010606370.1公开了一种卡泊芬净大孔吸附树脂分离纯化的方法。该方法洗脱剂的浓度为10-45％。在溶剂浓度低于35％时，基本洗不出WF11899A。溶剂浓度40-45％时只能洗出少量化合物，导致洗脱时间和洗脱体积增加，且洗脱不完全。

所以，寻找一种简单而且能够制备高纯度的WF11899A的纯化方法显得十分重要。因此本发明公开一种高纯度WF11899A的制备方法。该方法得到的样品纯度高，方法简单，不使用混合溶剂等优点。尚没有任何报道公开过使用该方法分离WF11899A。

发明内容

本发明提供一种棘白菌素类化合物的纯化方法，包括预纯化的棘白菌素类化合物溶液的制备、树脂层析分离和结晶三个步骤。

在优选的实施方案中，预纯化的棘白菌素类化合物溶液的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌丝体收集：通过离心或压滤等常规过滤方式收集菌丝体；

(2)浸泡：用适量的有机溶剂浸泡菌丝体，提取有效成分，得浸泡液；

(3)浓缩：减压浓缩浸泡液，除去有机溶剂，得到预纯化的棘白菌素类化合物溶液。

在优选的实施方案中，预纯化的棘白菌素类化合物溶液还可以采用常规的方法制备得到。

在优选的实施方案中，其中所述的树脂层析分离步骤包括吸附、洗涤、洗脱三个过程。

在优选的实施方案中，其中所述树脂优选聚苯乙烯类树脂，更优选HP20、HP20SS、HZ20SS、SP825、CG161、XAD1600、XAD-4。最优选HP20SS、HZ20SS、CG161。

在优选的实施方案中，其中所述洗涤过程采用一定浓度的有机溶剂水溶液进行。所述有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮等。优选乙醇、异丙醇。

在优选的实施方案中，其中所述洗涤过程的溶剂浓度以基本不洗出有效成分为准，比较合适的浓度为0-40％(V/V)，不同溶剂略有差异。

在优选的实施方案中，其中所述的洗涤过程先使水洗涤，然后再用有机溶剂的水溶液洗涤。

在优选的实施方案中，其中所述的洗脱过程使用有机溶剂的水溶液为洗脱溶剂，洗脱溶剂浓度为50-70％(V/V)，不同溶剂略有差异。其中所述的有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮等。

在优选的实施方案中，其中所述的结晶过程优选为将洗脱过程中收集到的洗脱液浓缩至浓度为100-500mg/ml，向浓缩液中加入一定量的溶剂，结晶。其中所述溶剂包括乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈、丙酮，优选异丙醇。所述溶剂的添加量为浓缩液体积的3-10倍，优选4-6倍。所述结晶在＜40℃下进行，优选-5-10℃。所述结晶过程可以在搅拌下进行，也可以静止条件下进行。所述结晶时间为4-48小时，优选6-12小时。

在优选的实施方案中，其中棘白菌素类化合物优选为WF11899A或其盐，

WF11899A具有如下化学结构：

其中R为H。

WF11899A的优选盐为常规应用的单盐或二盐，金属盐(如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等)，铵盐，有机碱盐(如三甲胺盐、三乙胺盐、甲基吡啶盐等)，氨基酸(如精氨酸，天冬氨酸、谷氨酸)等。

WF11899A发酵液可以参考文献Hiroyuki Honda等Improvement of FR901379 production by mutant selection andmedium optimization，Journal of Bioscience Bioengineering107，530-534(2009)的发酵技术获得。

相对于现有技术，本发明的优点在于：

现有技术发明专利US6506726、EP1137663、CN99815515公开了分离和纯化环肽类产品的方法，其包括：含有环肽化合物的混合物吸附到疏水的反相层析介质上，用连续地近乎线性的0.1-10％的乙酸水溶液进行梯度洗脱。该方法可以用来分离棘白菌素母核，但是在进行分离WF11899A时，0.1-10％乙酸梯度都无法洗脱化合物，且化合物在酸性条件下容易降解破坏。

现有技术发明专利CN201010606370.1公开了一种卡泊芬净大孔吸附树脂分离纯化的方法。该方法洗脱剂的浓度为10-45％。在溶剂浓度低于35％时，基本洗不出WF11899A。溶剂浓度40-45％时只能洗出少量化合物，导致洗脱时间和洗脱体积增加，且洗脱不完全。

因此相对于现有技术，本发明公布的WF11899A纯化方法具有方法简单，不使用混合溶剂，样品纯度高等优点。结晶前后图谱见附图1和2。

附图说明

图1：WF11899A结晶前色谱图

图2：WF11899A结晶后色谱图

具体实施方式

本发明采用HPLC方法对溶液进行定量检测，分析方法如下：

流速：1.0ml/min

检测波长：210nm

流动相：A：0.5％(w/v)NaH₂PO₄溶液；B：乙腈；A与B以体积比1∶1混合

色谱柱：大连依立特C18 4.6*250mm

实施例1

WF11899A发酵液30升，加硅藻土过滤得到菌丝体。菌丝体用40升乙醇浸泡，过滤得到35升浸泡液，减压浓缩得到浓缩液10升，浓缩液中含WF11899A约30克。浓缩液经过0.45um微孔滤膜过滤，得澄清的预纯化溶液。预纯化溶液用2.5升HP20SS树脂吸附。吸附完毕用5升水冲洗树脂，再用8升30-40％(V/V)乙醇洗涤。最后用9升55％(V/V)乙醇洗脱，收集合格洗脱液。所得洗脱液中含WF11899A约23.3克，色谱纯度为75％。

实施例2

按实施例1的方法处理得到的含27.3克WF11899A澄清液11升，用0.5mol/l氢氧化钠溶液调节pH至7.5形成WF11899A钠盐的预纯化溶液。预纯化溶液用2升HP20树脂吸附，吸附完毕用4升水冲洗树脂，再用6升30％(V/V)乙醇洗涤。最后用6.5升60％(V/V)乙醇洗脱，收集2.4升洗脱液，所得洗脱液中约含WF11899A19.3克。所得洗脱液色谱纯度为70％。

实施例3

按实施例1的方法处理得到的含28克WF11899A澄清液9升，用5％(w/w)氨水溶液调节pH至7.5形成WF11899A铵盐的预纯化溶液。预纯化溶液用2.5升SP825树脂吸附，吸附完毕用5升水冲洗树脂，再用7升30％(V/V)甲醇洗涤。最后用10升50％(V/V)甲醇洗脱，收集3.6升洗脱液，所得洗脱液中约含WF11899A22.7克。所得洗脱液色谱纯度为72％。

实施例4

按实施例1的方法处理得到的31克WF11899A澄清液12升，用5％(V/V)三乙胺溶液调节pH至7.5形成WF11899A三乙胺盐的预纯化溶液。预纯化溶液用2.5升HZ20SS树脂吸附，完毕用5升水冲洗树脂，再用10升25％(V/V)乙腈洗涤。最后用8升50％(V/V)乙腈洗脱，收集3.6升洗脱液，所得洗脱液中约含WF11899A23.8克。所得洗脱液色谱纯度为76％。

实施例5

按实施例1的方法处理得到的25.6克WF11899A澄清液9升，用0.2mol/l精氨酸溶液调节pH至6.9形成WF11899A氨基酸盐的预纯化溶液。预纯化溶液用2.5升XAD1600树脂吸附，吸附完毕用5升水冲洗树脂，再用10升15％丙酮洗涤。最后用8升50％(V/V)丙酮洗脱，收集3.7升洗脱液，所得洗脱液中约含WF11899A17.3克。所得洗脱液色谱纯度为70％。

实施例6

按实施例1的方法处理得到的26.8克WF11899A澄清的预纯化溶液10.5升，预纯化溶液用2升XAD-4树脂吸附，吸附完毕用4升水冲洗树脂，再用8升25％乙腈洗涤。最后用8升50％(V/V)乙腈洗脱，收集4.1升洗脱液，所得洗脱液中约含WF11899A18.9克。所得洗脱液色谱纯度为65％。

实施例7

按实施例1的方法处理得到的29.7g克WF11899A澄清的预纯化溶液12升，预纯化溶液用2.5升CG161树脂吸附，吸附完毕用5升水冲洗树脂，再用5L升40％乙醇洗涤。最后用8升60％(V/V)乙醇洗脱，收集3.2升洗脱液，约含WF11899A19.1克。所得洗脱液色谱纯度为76％。

实施例8

按实施例1处理得到的23克WF11899A澄清的预纯化溶液8升，预纯化溶液用2.5升HP20SS树脂吸附，吸附完毕用5升水冲洗树脂，再用8升30％(V/V)异丙醇洗涤。最后用8升55％(V/V)异丙醇洗脱，收集洗脱液3.2升，所得洗脱液中约含WF11899A17.9克。所得洗脱液色谱纯度为78％。

实施例9

按实施例2方法得到的洗脱液3.2升，洗脱液中约含WF11899A钠盐17.9克。减压浓缩洗脱液得到60毫升浓缩液，向浓缩液中加入240毫升异丙醇溶液，放置在0℃条件下结晶12小时。过滤得到白色晶体，纯度为94％。

实施例10

按实施例3方法得到的洗脱液3.7升，洗脱液中约含WF11899A铵盐23.8克。减压浓缩洗脱液得到59.5毫升浓缩液，向浓缩液中加入417毫升乙醇溶液，放置在-5℃条件下结晶6小时。过滤得到白色晶体，纯度为95％。

实施例11

按实施例4方法得到的洗脱液3.4升，洗脱液中约含WF11899A三乙胺盐20.5克。减压浓缩洗脱液得到51毫升浓缩液，向浓缩液中加入307毫升正丙醇溶液，放置在10℃条件下结晶12小时。过滤得到白色晶体，纯度为96％。

实施例12

按实施例5方法得到的洗脱液3.4升，洗脱液中约含WF11899A氨基酸盐22克。减压浓缩洗脱液得到63毫升浓缩液，向浓缩液中加入441毫升乙腈溶液，放置在0℃条件下结晶12小时。过滤得到白色晶体，纯度为93％。

实施例13

按实施例8方法得到的洗脱液3.2升，洗脱液中约含WF11899A21克。减压浓缩洗脱液得到52.5毫升浓缩液，向浓缩液中加入315毫升丙酮溶液，放置在10℃条件下结晶10小时。过滤得到白色晶体，纯度为95％。

本实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明。

Claims

1.一种棘白菌素类化合物的纯化方法，包括预纯化的棘白菌素类化合物溶液的制备、树脂层析分离和结晶三个步骤。

2.根据权利要求1的方法，其中所述的树脂层析分离步骤包括吸附、洗涤、洗脱三个过程。

3.根据权利要求1和2任一项的方法，其中所述的树脂为聚苯乙烯类树脂，优选自HP20、HP20SS、HZ20SS、SP825、CG161、XAD1600、XAD-4。

4.根据权利要求2的方法，其中所述的洗涤过程使用0％-40％(V/V)的有机溶剂的水溶液。

5.根据权利要求5的方法，其中所述的洗涤过程先使水洗涤，然后再用有机溶剂的水溶液洗涤。

6.根据权利要求2的方法，其中所述的洗脱过程使用50％-70％(V/V)的有机溶剂的水溶液。

7.根据权利要求4-6任一项的方法，其中所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮。

8.根据权利要求1的方法，其中所述的结晶过程，其特征在于往100-500mg/ml的棘白菌素类化合物溶液中加入溶剂，结晶。

9.根据权利要求8的方法，其中所述的溶剂选自乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈、丙酮；所述溶剂的用量为棘白菌素类化合物溶液体积的3-10倍，优选4-6倍；所述结晶的温度为＜40℃，优选-5～10℃；所述结晶时间为4-48小时，优选6-12小时。

10.根据权利要求1、8、9任一项的方法，其中所述的棘白菌素类化合物为WF11899A或其盐。