CN102443050A - 一种环脂肽化合物或其盐的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种环脂肽化合物或其盐的纯化方法，所述的方法包括步骤：(1)在含有式I化合物或其盐的发酵液中加入有机溶剂进行抽提，过滤或离心后得到抽提液1；(2)将抽提液1进行稀释或真空浓缩，降低有机溶剂含量，得到抽提液2；(3)将抽提液2上样至大孔吸附树脂；(4)将水、有机溶剂、或有机溶剂和水的混合溶液作为洗涤液洗涤大孔吸附树脂；(5)将水、有机溶剂、或有机溶剂和水的混合溶液作为洗脱液，将式I化合物从大孔吸附树脂上洗脱下来。所述的纯化方法与公开技术相比具有有机溶媒用量少，不使用硅胶，对环境危害性小的优点，并且收集到的式I化合物的纯度也有所提高。<tables num="0001">

Description

一种环脂肽化合物或其盐的纯化方法
技术领域
本发明涉及有机化学领域，尤其涉及一种如式I所示的多肽化合物或其盐的纯化方法。
背景技术
真菌感染已经成为免疫缺陷病人发病率和死亡率居高不下的主要原因。在过去的20年里，霉菌感染的发病率显著增加。真菌感染的高危人群包括重症病人，外科病人以及那些患有HIV感染，血癌和其它肿瘤疾病的病人。那些经过器官移植的病人同样是真菌感染的高危人群。
棘球白素作为一类新的抗真菌药物，在治疗由念珠菌或曲霉引起的感染方面效果良好。这类药物又以卡泊芬净和米卡芬净为代表。棘球白素类药物通过抑制1，3-β糖苷键的形成来抑制真菌，从而更好地减小了对人体的伤害，在高效的同时尽可能的降低了副作用，因此它们在使用过程中比传统抗真菌药更安全。
FK463(米卡芬净)是如式III所示的化合物，它是以式I化合物FR901379(M0)为前体通过酶解掉侧链得到式II化合物FR179642(M1)，然后经过化学修饰得到的。可见，要得到高纯度的米卡芬净，高纯度高的式I化合物是关键。
Figure BDA0000094562300000011
Figure BDA0000094562300000021
EP0431350B1公开了一种纯化式I化合物的方法：将发酵液直接用丙酮抽提，过滤浓缩除去丙酮后用乙酸乙酯洗涤，然后用正丁醇萃取的方法得到，然后将异丁醇相浓干后，上硅胶柱后得到式I化合物。该方法需要大量溶剂，同时该方法使用了硅胶这种不降解，对环境污染严重的物质，不利于环保，且严重危害操作人员的健康，不适合工业化大规模生产。
因此，本领域急需找到一种不需要大量溶媒，不使用硅胶的纯化方法，克服上述现有技术中存在的缺陷，同时提高式I化合物的纯度。
发明内容
本发明旨在提供一种纯化式I化合物的方法。
本发明提供了一种如式I化合物或其盐的纯化方法，所述的方法包括步骤：
(1)将含有式I化合物或其盐的发酵液和有机溶剂混合，进行抽提，过滤或离心后得到抽提液1；
(2)将抽提液1进行稀释或真空浓缩，降低有机溶剂含量，得到抽提液2；
(3)将抽提液2上样至大孔吸附树脂；
(4)将水、有机溶剂、或有机溶剂和水的混合溶液作为洗涤液洗涤大孔吸附树脂；和
(5)将水、有机溶剂、或有机溶剂和水的混合溶液作为洗脱液，将式I化合物从大孔吸附树脂上洗脱下来；
Figure BDA0000094562300000031
在本发明提供的纯化方法中，所述步骤(3)是将抽提液2流过装载有大孔吸附树脂的层析柱，或将吸附树脂直接投入含有式I化合物的抽提液中，搅拌5-120分钟，使含有式I化合物的抽提液2上样至大孔吸附树脂；所述的流过速度为每小时0.1-10个柱床体积。
在本发明提供的纯化方法中，步骤(1)中所述的发酵液包括将发酵液过滤或离心后得到的菌体。
在本发明提供的纯化方法中，步骤(2)中，以抽提液2的总体积计，其中有机溶剂的体积百分比为0-40％。
在本发明提供的纯化方法中，步骤(3)中，式I化合物粗品和大孔吸附树脂的重量体积比为0.1-1.0∶100(g/ml)。
在本发明提供的纯化方法中，步骤(4)中，以洗涤液的总体积计，其中有机溶剂的体积百分比为0-40％，优选20％-40％。
在本发明提供的纯化方法中，步骤(5)中，以洗脱液的总体积计，其中有机溶剂的体积百分比为40-90％，优选40-60％。
在本发明提供的纯化方法中，所述的大孔吸附树脂选自：由苯乙烯与二乙烯苯聚合而成的非极性的芳香族吸附树脂；或具有甲基丙烯酸酯单元结构的中等极性的甲基丙烯酸吸附树脂。
在另一优选例中，所述的吸附树脂选自：XAD-1、XAD-2、XAD-3、XAD-4、XAD-5、XAD-16、XAD-16HP、HP-10、HP-20、HP-20ss、HP-21、HP-30、HP-40、HP-50、SP-825、SP-850、SP-70、SP-700、SP-207、SP207ss、XAD-6、XAD-7、XAD-7HP、XAD-8、HP-2MG、或它们的混合物。
在本发明提供的纯化方法中，所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、丁酮、或它们的混合物。
据此，本发明提供了一种不需要大量溶媒，不使用硅胶的纯化方法，克服了现有技术中存在的缺陷，同时提高了式I化合物的纯度。
附图说明
图1为实施例1含式I化合物的抽提液的HPLC图谱。
图2为实施例4纯化后式I化合物的HPLC图谱。
具体实施方式
经过深入的研究和反复的探索，在经历了很多失败后，发明人发现了一种简便的纯化式I化合物的方法，在此基础上完成了本发明。
本发明提供的式I化合物的纯化方法包括步骤：
(1)在含有式I化合物或其盐的发酵液中加入有机溶剂进行抽提，过滤或离心后得到抽提液1。
(2)将抽提液1进行稀释或真空浓缩，降低有机溶剂含量，得到抽提液2。
(3)将抽提液2上样至大孔吸附树脂。
(4)将水、有机溶剂、或有机溶剂和水的混合溶液作为洗涤液洗涤大孔吸附树脂。
(5)将水、有机溶剂、或有机溶剂和水的混合溶液作为洗脱液，将式I化合物从大孔吸附树脂上洗脱下来。
步骤(3)可以通过将含有式I化合物的抽提液与大孔吸附树脂接触实现。所述的接触可以是a.将吸附树脂直接投入含有式I化合物的抽提液中，然后搅拌5-120分钟；或者是b.将吸附树脂装在层析柱等层析装置中，使含有式I化合物的抽提液流过层析柱，流速在每小时0.1-10个柱床体积。
在本发明的一个实施例中，所述的纯化方法包括步骤：
A.在含有式I化合物或其盐的发酵液中加入有机溶剂进行抽提，离心或过滤后得到抽提液1。
B.将抽提液1进行稀释或真空浓缩，降低有机溶剂含量，得到抽提液2
C.将吸附树脂直接投入含有式I化合物的抽提液2中，然后搅拌5-120分钟；
D.使含有式I化合物的抽提液2与所述树脂分离；
E.将水、有机溶剂、或有机溶剂和水的混合溶液作为洗涤液洗涤步骤D中留下的大孔吸附树脂；
F.将水、有机溶剂、或有机溶剂和水的混合溶液作为洗脱液对步骤E中得到的洗涤过的吸附树脂进行洗脱，然后收集含有式I化合物的洗脱液，得到纯化的式I化合物。
步骤D中所述的分离包括过滤、离心等方法使树脂与滤液相分离。
在本发明提供的纯化方法中，步骤(1)所述含有式I化合物或其盐的发酵液可以使用本领域现有的方法得到，例如但不限于，参照EP0431350B1实施例1中描述的方法，通过Coleophoma empetri.F-11899(FERM BP2635)发酵获得。
在本发明提供的纯化方法中，步骤(1)所述的抽提是指，将发酵液直接加入有机溶剂抽提，或者是将发酵液过滤后得到菌体，再加入有机溶剂进行抽提。所述有机溶剂选自：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、丁酮、或它们的混合物；优选甲醇、乙醇、丙酮或它们的混合物。
在本发明提供的纯化方法中，步骤(2)是将步骤(1)得到的抽提液1通过加水稀释或真空浓缩的方式，降低抽提液中有机溶剂的含量，使得抽提液2中的有机溶剂含量≤40％，优选20％-40％(以抽提液2总体积计)。
在本发明提供的纯化方法中，步骤(4)和(5)所述的有机溶剂选自C1-4醇、C1-4酮或它们的混合物，优选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、丁酮或它们的混合物。
在本发明提供的所有纯化方法中，所述的吸附树脂选自：由苯乙烯与二乙烯苯聚合而成的非极性的脂肪族吸附树脂或者具有甲基丙烯酸酯单元结构的中等极性的甲基丙烯酸吸附树脂。优选自：美国罗门哈斯公司(RohmHaas)生产的XAD系列吸附树脂，及日本三菱化学公司生产的Diaion HP系列吸附树脂。更优地，选自XAD-1、XAD-2、XAD-3、XAD-4、XAD-5、XAD-6、XAD-7、XAD-7HP、XAD-8、XAD-16、XAD-16HP、HP-10、HP-20、HP-20ss、HP-21、HP-30、HP-40、HP-50、HP-2MG、SP-825、SP-850、SP-70、SP-700、SP207、SP207ss或它们的混合物。最优地，选自HP20、XAD-16、或XAD-16HP、或SP207。
在本发明提供的纯化方法的步骤(4)中，所述洗涤液中有机溶剂含量≤40％，优选20％-40％。
在本发明提供的纯化方法的步骤(5)中，所述洗脱缓冲液中有机溶剂的含量40-90％，优选40-60％。
如本文所用，“如式I所示化合物”或“式I化合物”可以互换使用，都是指具有以下结构式的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0000094562300000061
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指同选自下述碱形成的盐类：无机碱如钠、钾、镁、钙、铝等；有机碱如甲胺、乙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己醇胺、赖氨酸、鸟氨酸等，或其它药学上可接受的盐有关的碱。
如本文所用，“如式I所示化合物的纯度”、“式I化合物的纯度”或“式I化合物的HPLC纯度”可以互换使用，都是指在本发明提供的高效液相色谱(HPLC)检测条件下，测得的式I化合物的峰面积和所有峰的峰面积之和的百分比。
如本文所用，“上样”是指将含有式I化合物的粗品的抽提液和大孔吸附树脂接触，使式I化合物吸附到大孔吸附树脂上的过程。所述的接触包括将大孔吸附树脂直接投入溶液中，然后搅拌吸附；还有将大孔吸附树脂装入层析装置中，使溶液流过层析柱。
“洗涤”大孔吸附树脂，指使合适的缓冲液在大孔吸附树脂中或上通过。
如本文所用，“洗涤缓冲液”指在洗脱目标式I化合物之前，用来洗涤(主要是有机相)大孔吸附树脂的缓冲液。方便的，洗涤缓冲液和加样缓冲液可以是同一极性，但这不是必须的。
将分子从大孔吸附树脂上“洗脱”下来，指通过改变大孔吸附树脂周围的缓冲液极性从大孔吸附树脂上除下该分子，该极性能使缓冲液与分子竞争大孔吸附树脂上的吸附位点。
如本文所用，“洗脱缓冲液”用来将目标式I化合物从固相上洗脱下来。洗脱缓冲液能使目标式I化合物从大孔吸附树脂上洗脱下来。
从含有目标式I化合物和一种或多种非目标化合物的组合物中“纯化”式I化合物，指通过从组合物中(完全或部分的)除去至少一种非目标化合物来提高组合物中式I化合物的纯度。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供了一种成本低廉的纯化环脂肽化合物，特别是棘白菌素类化合物的新方法。
2、本发明提供的方法所经过的纯化步骤具有路线短、条件温和、纯化收率高、处理简单、对环境污染小等特点，在很大程度上减轻了工艺操作和对设备要求，降低了生产成本。
3、本发明提供的方法能得到较稳定的目标产物，有利于终产品的质量控制，有利于工业化大生产。
4.本发明提供的方法生产的目标产物完全可以满足向化合物II转化的要求。便于进行大规模生产化合物II，乃至最终产物化合物III。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下述实施例中式I化合物HPLC检测所用的方法：
在Waters分析性HPLC体系上进行分析。反相HPLC分析用于测定FR901379、PneumocandinB0及其它类似物。反相分析采用CALESIL ODS色谱柱(粒径5μm，4.6mmi.d×250mm)，并且保持在35℃。以50％乙腈/0.5％磷酸二氢铵水溶液作流动相，流速为1ml/分钟，并在210nm下UV检测。
实施例1
参照EP0431350B1实施例1中描述的方法，获得2200L含式I化合物的发酵液，过滤得到湿菌体650kg，取其中65kg，加入100L乙醇浸泡抽提，用板框过滤，洗涤滤饼，制备得到含有式I化合物的抽提液1160L，其中式I化合物的含量为0.11克/升，HPLC纯度为74.08％，HPLC图谱参见附图1和表1。
取50L含式I化合物的抽提液1，含式I化合物共5.5克，用纯化水将其乙醇浓度稀释至33％，得100L的含式I化合物的抽提液2。
将上步得到的含式I化合物的抽提液2上样到一个装有550ml HP20ss树脂的层析柱，上样流速为每小时3个柱床体积。上样结束后，以33％乙醇洗涤2个柱体积，洗涤流速为每小时1个柱床体积。洗涤完毕后，以1800ml  60％乙醇为洗脱液，洗脱流速为每小时1个柱床体积，收集含有式I化合物的部分并混匀。收集液经HPLC检测，其中的式I化合物含量为5.2克(收率94.5％)，纯度为90.3％，HPLC图谱参见附图2和表2。
表1
  保留时间   面积   峰高   ％面积
  1   7.380   17747   824   0.63
  2   8.196   86433   5744   3.07
  3   9.627   11782   965   0.42
  4   10.531   28138   2048   1.00
  5   11.364   69799   3534   2.48
  6   11.020   2087596   117791   74.08
  7   12.473   32176   2002   1.14
  8   13.444   34705   1437   1.23
  9   14.137   316897   16282   11.25
  10   15.273   33033   1676   1.17
  11   16.332   40054   1779   1.42
  12   23.203   59506   2471   2.11
表2
  保留时间   面积   峰高   ％面积
  1   8.145   4472   428   0.15
  2   9.100   57767   4639   1.99
  3   10.500   22462   1475   0.77
  4   11.732   2617300   169214   90.30
  5   13.500   20314   1138   0.71
  6   14.121   120749   6234   3.82
  7   14.744   14455   855   0.49
  8   15.332   40897   1993   1.42
实施例2
参照EP0431350B1实施例1中描述的方法，获得2200L含式I化合物的发酵液，加入相同体积的甲醇浸泡抽提，然后过滤，制备得到含有式I化合物的抽提液1，其中式I化合物的含量为0.051克/升，HPLC纯度为74.5％。取100L式I化合物的抽提液1，含式I化合物共5.1克，用纯化水将其甲醇浓度稀释至40％，得200L的含式I化合物的抽提液2。
将上步得到的含式I化合物的抽提液2上样到一个装有700ml XAD-16树脂的层析柱，上样流速为每小时1个柱床体积。上样结束后，以40％甲醇洗涤2个柱体积，洗涤流速为每小时1个柱床体积。洗涤完毕后，以1800ml 50％甲醇为洗脱液，洗脱流速为每小时1个柱床体积，收集含有式I化合物的部分并混匀。收集液经HPLC检测，其中的式I化合物含量为4.7克(收率92.2％)，纯度为89.2％。
实施例3
参照EP0431350B1实施例1中描述的方法，获得2200L含式I化合物的发酵液，加入相同体积的丙酮浸泡抽提，然后过滤，制备得到含有式I化合物的抽提液1，其中式I化合物的含量为0.051克/升，HPLC纯度为74.5％。取40L式I化合物的抽提液1，含式I化合物共2.04克，用纯化水将其丙酮浓度稀释至20％，得到80L含式I化合物的抽提液2。
将上步得到的含式I化合物的抽提液2装到一个100L塑料白桶中，加入1000mlXAD-16HP树脂，于室温下搅拌120分钟然后将含有树脂的滤液倾倒于铺有滤纸的布氏漏斗中过滤，滤液弃去，树脂装入层析柱中，以2000ml 20％丙酮洗涤，洗涤完毕以60％丙酮洗脱，收集含有式I化合物的部分，收集液经HPLC检测，其中的式I化合物为1.75克(收率85.8％)，纯度90.0％。
实施例4
取20L实施例1获得的含式I化合物的抽提液1，含式I化合物共2.2克，真它浓缩将其乙醇浓度降至20％，得8L含式I化合物的抽提液2。
将上步得到的含式I化合物的抽提液2上样到一个装有200mL SP207树脂的层析柱，上样流速为每小时3个柱床体积。上样结束后，以20％乙醇洗涤2个柱体积，洗涤流速为每小时1个柱床体积。洗涤完毕后，以1L 40％乙醇为洗脱液，洗脱流速为每小时1个柱床体积，收集含有式I化合物的部分并混匀。收集液经HPLC检测，其中的式I化合物含量为1.94克(收率88.2％)，纯度为89.5％。
实施例5
取1450L实施例1获得的含式I化合物的抽提液1，含式I化合物共159.5克，用纯化水将其乙醇浓度稀释至40％，得2950L含式I化合物的抽提液2。
将上步得到的含式I化合物的粗品2上样到一个装有20L HP20树脂的层析柱，上样流速为每小时10个柱床体积。上样结束后，以40％乙醇洗涤2个柱体积，洗涤流速为每小时1个柱床体积。洗涤完毕后，以60L 50％乙醇为洗脱液，洗脱流速为每小时1个柱床体积，收集含有式I化合物的部分并混匀。收集液经HPLC检测，其中的式I化合物含量为145.2克(收率91.0％)，纯度为90.4％。
实施例6
取50L实施例1获得的含式I化合物的抽提液1，含式I化合物共5.5克，用纯化水将其乙醇浓度稀释至10％，得含式I化合物的抽提液2。
将上步得到的含式I化合物的抽提液2上样到一个装有550ml HP20树脂的层析柱，上样流速为每小时3个柱床体积。上样结束后，以10％乙醇洗涤2个柱体积，洗涤流速为每小时1个柱床体积。洗涤完毕后，以1800ml乙醇为洗脱液，洗脱流速为每小时1个柱床体积，收集含有式I化合物的部分并混匀。收集液经HPLC检测，其中的式I化合物含量为5.15克(收率93.6％)，纯度为85.4％。
对比实施例1
取50L实施例1获得的含式I化合物的抽提液1，含式I化合物共5.5克，用纯化水将其乙醇浓度稀释至32％，得103L含式I化合物的抽提液2。
将上步得到的含式I化合物的抽提液2上样到一个装有550ml HP20树脂的层析柱，上样流速为每小时10个柱床体积。上样结束后，以45％乙醇洗涤2个柱体积，洗涤流速为每小时1个柱床体积。洗涤完毕后，以1800ml 50％乙醇为洗脱液，洗脱流速为每小时1个柱床体积。收集洗脱液中式I化合物的部分并混匀，经HPLC检测，其中的式I化合物含量为2.13克(收率38.7％)，纯度为90.4％。
对比实施例2
取50L实施例1获得的含式I化合物的抽提液1，含式I化合物共5.5克，用纯化水将其乙醇浓度稀释至45％，得103L含式I化合物的抽提液2。
将上步得到的含式I化合物的抽提液2上样到一个装有550ml HP20树脂的层析柱，上样流速为每小时3个柱床体积。上样结束后，以33％乙醇洗涤2个柱体积，洗涤流速为每小时1个柱床体积。洗涤完毕后，以1800ml 60％乙醇为洗脱液，洗脱流速为每小时1个柱床体积，收集洗脱液中含有式I化合物的部分并混匀。收集液经HPLC检测，其中的式I化合物含量为1.08克(收率19.6％)，纯度为85.4％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (11)

1.一种如式I化合物或其盐的纯化方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)将含有式I化合物或其盐的发酵液和有机溶剂混合，进行抽提，过滤或离心后得到抽提液1；
(2)将抽提液1进行稀释或真空浓缩，降低有机溶剂含量，得到抽提液2；
(3)将抽提液2上样至大孔吸附树脂；
(4)将水、有机溶剂、或有机溶剂和水的混合溶液作为洗涤液洗涤大孔吸附树脂；和
(5)将水、有机溶剂、或有机溶剂和水的混合溶液作为洗脱液，将式I化合物从大孔吸附树脂上洗脱下来；
Figure FDA0000094562290000011
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)是将抽提液2流过装载有大孔吸附树脂的层析柱，或将吸附树脂直接投入含有式I化合物的抽提液中，搅拌5-120分钟，使含有式I化合物的抽提液2上样至大孔吸附树脂。
3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述的流过速度为每小时0.1-10个柱床体积。
4.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述的发酵液包括将发酵液过滤或离心后得到的菌体。
5.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，以抽提液2的总体积计，其中有机溶剂的体积百分比为0-40％。
6.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，式I化合物粗品和大孔吸附树脂的重量体积比为0.1-1.0∶100(g/ml)。
7.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，以洗涤液的总体积计，其中有机溶剂的体积百分比为0-40％，优选20％-40％。
8.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(5)中，以洗脱液的总体积计，其中有机溶剂的体积百分比为40-90％，优选40-60％。
9.如权利要求1-8任一所述的纯化方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂选自：由苯乙烯与二乙烯苯聚合而成的非极性的芳香族吸附树脂；或具有甲基丙烯酸酯单元结构的中等极性的甲基丙烯酸吸附树脂。
10.如权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，所述的吸附树脂选自：XAD-1、XAD-2、XAD-3、XAD-4、XAD-5、XAD-16、XAD-16HP、HP-10、HP-20、HP-20ss、HP-21、HP-30、HP-40、HP-50、SP-825、SP-850、SP-70、SP-700、SP-207、SP207ss、XAD-6、XAD-7、XAD-7HP、XAD-8、HP-2MG、或它们的混合物。
11.如权利要求1-8任一所述的纯化方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、丁酮、或它们的混合物。
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