JP2013538833A

JP2013538833A - 環状リポペプチド化合物又はその塩の精製方法

Info

Publication number: JP2013538833A
Application number: JP2013530550A
Authority: JP
Inventors: 張兆利; 劉石東; 卓忠浩; 李曉銘
Original assignee: 上海天偉生物制薬有限公司
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2011-09-27
Publication date: 2013-10-17
Anticipated expiration: 2031-09-27
Also published as: WO2012041220A1; CN102443050B; EP2623611A1; RU2538274C2; RU2013118534A; KR20130059455A; JP6000255B2; EP2623611A4; EP2623611B1; US20130296529A1; AU2011307733B2; US8877777B2; CA2813335A1; CN102443050A; AU2011307733A1; KR101514904B1

Abstract

環状リポペプチド化合物又はその塩の精製方法を提供する。精製方法は、ステップ：（１）ろ過又は遠心後に抽出液１を得るために、式Ｉの化合物又はその塩を共に含む発酵液を抽出すること；（２）抽出液２を得るために、有機溶媒の含有量を低減する抽出液１を希釈又は真空下で濃縮すること；（３）抽出液２をマクロポーラス樹脂にロードすること；（４）洗浄液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂を洗浄すること；（５）溶出液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂から式Ｉの化合物を溶出すること、を含む。前記精製方法は従来技術に比べて、少量の有機溶媒が使用され、シリカゲルを使用しない、環境に対する害はより少なく、収集される式Ｉの化合物の純度は向上した。
【化１】

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は有機化学分野に関し、特に、式Ｉの環状ポリペプチド化合物又はその塩の精製方法に関する。
［背景技術］
真菌感染は、免疫不全患者において発症率と死亡率が高まる主な要因になっている。過去２０年の間に、真菌感染の発症率は顕著に高まってきた。真菌感染のハイリスク集団は、重症患者、外科患者、およびＨＩＶ感染患者、血液癌や他の腫瘍疾病を有する患者を含む。さらに臓器移植を受けた患者も真菌感染のハイリスク集団である。

エキノカンジンは新規な抗真菌薬であり、カンジダ菌やアスペルギルスによる感染の治療に対して効果があり、エキノカンジン抗真菌薬の例としては、カスポファンギンとミカファンギンがある。エキノカンジンは、１，３−βグリコシド結合の形成を阻害することにより真菌を抑制することで、高い効果を維持するとともに、生体に対する毒性や副作用を低減させる。それゆえ、エキノカンジンを使用する場合は、従来の抗真菌薬と比較して安全である。

ＦＫ４６３（ミカファンギン）は、式ＩＩＩの化合物であり、式ＩＩＩの化合物で式Ｉの化合物ＦＲ９０１３７９（Ｍ０）を前駆体として、前駆体の側鎖を酵素反応を介して除去し、式ＩＩの化合物ＦＲ１７９６４２（Ｍ１）を化学修飾することによって形成することによって得られる。したがって、高純度式Ｉの化合物は高純度のミカファギンを得るために重要である。

ＥＰ０４３１３５０Ｂ１では、式Ｉの化合物を精製する方法を開示しており、その方法は次のステップ：発酵液をアセトンで抽出し、ろ液は、アセトンを除去することで濃縮され、酢酸エチルで洗浄され、ｎ−ブタノールで抽出される；ｎ−ブタノール相は乾燥して濃縮され；式Ｉの化合物はシリカゲルクロマトグラフィーによって得られる、を含む。この方法は、大量の溶媒が必要とされ、分解されず環境をひどく汚染するだろうシリカゲルを使用するため、このような方法は環境保護に不利であり、取扱者の健康に害になるだろうし、大量生産に適合しない。

よって、上記従来技術における欠点を解消するだけでなく、式Ｉの化合物の純度を向上させることができる精製法、大量の溶媒またはシリカゲルを使用しない精製方法をみつけることが当技術分野において切迫している。
［発明の内容］
本発明の要旨は、式Ｉの化合物の精製方法を提供することにある。

本発明は、式Ｉの化合物またはその塩の精製方法を提供し、前記方法は、次のステップ：
（１）発酵液を抽出するために式Ｉの化合物又はその塩を含む発酵液を有機溶媒と混合し、ろ過又は遠心によって、抽出液１を得ること、
（２）有機溶媒の含有量を低減するために抽出液１を希釈または真空で濃縮し、抽出液２を得ること、
（３）抽出液２をマクロポーラス吸着樹脂にロードすること、
（４）洗浄液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂を洗浄すること；および
（５）溶出液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂から式Ｉの化合物を溶出すること、
を含む、式Ｉで表される化合物又はその塩の精製方法を提供する。

本発明により提供される精製方法において、ステップ（３）は、抽出液２をマクロポーラス吸着樹脂で充填されたクロマトグラフィーカラムに流すようにし、または吸着樹脂をそのまま式Ｉの化合物を含む抽出液に投入し、結果として生じる混合物を５〜１２０分攪拌し、式Ｉの化合物を含む抽出液２をマクロポーラス吸着樹脂にロードすること；および、流速は１時間当たり０．１〜１０カラム体積である。

本発明により提供される精製方法において、ステップ（１）の発酵液は、発酵液をろ過又は遠心することから得られる菌体を含む。
本発明により提供された精製方法において、ステップ（２）では、抽出液２の総体積に対して、有機溶媒の体積百分率は０〜４０％である。

本発明により提供される精製方法において、ステップ（３）では、式Ｉの粗化合物とマクロポーラス吸着樹脂の重量比は０．１〜１．０：１００（ｇ／ｍｌ）である。
本発明により提供される精製方法において、ステップ（４）では、洗浄液の総体積に対して、有機溶媒の体積百分率は０〜４０％、好ましくは２０％〜４０％である。

本発明により提供される精製方法において、ステップ（５）では、溶出液の総体積に対して、有機溶媒の体積百分率は４０〜９０％、好ましくは４０〜６０％である。

本発明により提供されたる精製方法において、前記マクロポーラス吸着樹脂は、スチレンとジビニルベンゼンから重合された非極性の芳香族吸着樹脂と、該樹脂構造においてメタクリレート単位を有する中等極性のメタクリル吸着樹脂と、から選ばれる。

他の好ましい例において、前記吸着樹脂は、ＸＡＤ−１、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−３、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−５、ＸＡＤ−１６、ＸＡＤ−１６ＨＰ、ＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−２０ｓｓ、ＨＰ−２１、ＨＰ−３０、ＨＰ−４０、ＨＰ−５０、ＳＰ−８２５、ＳＰ−８５０、ＳＰ−７０、ＳＰ−７００、ＳＰ−２０７、ＳＰ２０７ｓｓ、ＸＡＤ−６、ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−７ＨＰ、ＸＡＤ−８、ＨＰ−２ＭＧ、またはそれらの混合物から選ばれる。

本発明により提供される精製方法において、有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、ブタノン、またはそれらの混合物から選ばれる
よって、本発明によれば、大量の溶媒およびシリカゲルが使用されない精製方法が提供され、そのような方法は従来技術における欠点を解消するだけでなく、式Ｉの化合物の純度を向上させる。

は、実施例１における、式Ｉの化合物を含む抽出液のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。は、実施例４で精製された式Ｉの化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。

［具体的な実施形態］
多くの実験を通して、式Ｉの化合物を精製する簡便な方法を発見し、その結果本願発明を成し遂げた。

本発明により提供される式Ｉの化合物の精製方法は、以下のステップ：
（１）発酵液を抽出するために式Ｉの化合物又はその塩を含む発酵液に有機溶媒を加えること、およびろ過又は遠心によって抽出液１を得ること、
（２）抽出液１を希釈又は真空で濃縮することによって、有機溶媒の含有量を低減し、抽出液２を得ること、
（３）抽出液２をマクロポーラス吸着樹脂にロードすること、
（４）洗浄液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂を洗浄すること、および、
（５）溶出液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂から式Ｉの化合物を溶出すること
を含む。

ステップ（３）は、式Ｉの化合物を含む抽出液をマクロポーラス吸着樹脂と接触させることで実施することができる。接触は、ａ．吸着樹脂をそのまま式Ｉの化合物を含む抽出液に投入すること、および５〜１２０分攪拌すること、またはｂ．吸着樹脂をクロマトグラフィーカラムなどのクロマトグラフィー装置に充填すること、式Ｉの化合物を含む抽出液を１時間当たり０．１〜１０カラム体積の流速でクロマトグラフィーカラムに流すこと、によって行われることができる。

本発明の一つの実施例において、精製方法は、以下のステップ；
Ａ．式Ｉの化合物又はその塩を含む発酵液に有機溶媒を加えること、および遠心又はろ過によって、抽出液１を得ること、
Ｂ．有機溶媒の含有量を低減するために抽出液１を希釈又は真空で濃縮することによって、抽出液２を得ること、
Ｃ．吸着樹脂をそのまま式Ｉの化合物を含む抽出液２に投入すること、および結果として生じる混合物を５〜１２０分攪拌すること、
Ｄ．式Ｉの化合物を含む抽出液２を樹脂から分離すること、
Ｅ．洗浄液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、ステップＤで残されたマクロポーラス吸着樹脂を洗浄すること、
Ｆ．溶出液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、ステップＥで得られた洗浄された吸着樹脂を溶出すること、および式Ｉの化合物を含む溶出液を収集することにより精製された式Ｉの化合物を得ること、
を含む。

ステップＤにおいて、分離は、ろ過、遠心などでろ液から樹脂を分離することを含む。
本発明により提供される精製方法において、ステップ（１）における式Ｉの化合物又はその塩を含む発酵液は、当技術分野で知られている方法、例えば（限定されないが）ＥＰ０４３１３５０Ｂ１の実施例１に記載されているように、コレオフォーマエンペトリ（Ｃｏｌｅｏｐｈｏｍａｅｍｐｅｔｒｉ．）Ｆ−１１８９９（ＦＥＲＭＢＰ２６３５）発酵により得ることができる。

本発明により提供される精製方法において、ステップ（１）における「抽出する」とは、発酵液を抽出するために発酵液にそのまま有機溶媒を加えること、または菌体を得るために発酵液をろ過すること、および菌体を抽出するために有機溶媒を加えることを意味する。有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、ブタノン、またはそれらの混合物から選ばれ、好ましくはメタノール、エタノール、アセトン、またはそれらの混合物から選ばれる。

本発明により提供される精製方法において、ステップ（２）では、ステップ（１）で得られる抽出液１における有機溶媒の含有量は、抽出液１に水を加える、または真空で濃縮することによって低減され、抽出液２における有機溶媒の含有量は（抽出液２の総体積に対して）４０％、好ましくは２０％〜４０％である。

本発明により提供された精製方法において、ステップ（４）と（５）で使用される有機溶媒は、Ｃ_１−４アルコール、Ｃ_１−4ケトンまたはそれらの混合物から選ばれ、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、ブタノン、またはそれらの混合物から選ばれる。

本発明により提供されたすべての精製方法において、前記吸着樹脂は、スチレンとジビニルベンゼンから重合された非極性の脂肪族吸着樹脂と、該樹脂構造においてメタクリレート単位を有する中等極性のメタクリル吸着樹脂と、から選ばれる。好ましくは、ＸＡＤシリーズ吸着樹脂（ロームハース（ＲｏｈｍＨａａｓ）社製、米国）、ダイアイオンＨＰ（ＤｉａｉｏｎＨＰ）シリーズ吸着樹脂（三菱化学社製、日本）から選ばれる。より好ましくは、樹脂はＸＡＤ−１、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−３、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−５、ＸＡＤ−６、ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−７ＨＰ、ＸＡＤ−８、ＸＡＤ−１６、ＸＡＤ−１６ＨＰ、ＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−２０ｓｓ、ＨＰ−２１、ＨＰ−３０、ＨＰ−４０、ＨＰ−５０、ＨＰ−２ＭＧ、ＳＰ−８２５、ＳＰ−８５０、ＳＰ−７０、ＳＰ−７００、ＳＰ２０７、ＳＰ２０７ｓｓ、またはそれらの混合物から選ばれる。最も好ましくは、樹脂はＨＰ−２０、ＸＡＤ−１６、ＸＡＤ−１６ＨＰ、またはＳＰ２０７から選ばれる。

本発明により提供される精製方法においてステップ（４）では、前記洗浄液における有機溶媒の含有量は４０％以下、好ましくは２０％〜４０％である。
本発明により提供される精製方法のステップ（５）において、溶出液における有機溶媒の含有量は４０〜９０％、好ましくは４０〜６０％である。

本願に用いられるように、「式Ｉの化合物」又は「化合物Ｉ」は交換して用いられることができ、いずれも次の構造を有する化合物又はその薬学的に許容される塩のことを指す。

本願に用いられるように、「薬学的に許容される塩」とは、次の塩：ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等のような無機塩基；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキサノールアミン、リシン、オルニチン等のような有機塩基；または他の薬学的に許容される塩に関する塩基；から形成される塩を意味する。

本願に用いられるように、「式Ｉの化合物の純度」、「化合物Ｉの純度」又は「化合物ＩのＨＰＬＣ純度」は交換して用いられることができ、いずれも本発明によって提供される高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）検出条件下で測定される、化合物Ｉのピーク面積と全ピーク面積の合計との百分率のことを指す。

本願に用いられるように、「ロードする」とは、粗化合物Ｉを含む抽出液をマクロポーラス吸着樹脂と接触させることで、粗化合物Ｉをマクロポーラス吸着樹脂に吸着させる方法を指す。「接触する」とは、マクロポーラス吸着樹脂をそのまま溶液に投入し、そして攪拌し吸着することを含み、またはマクロポーラス吸着樹脂をクロマトグラフィー装置に充填し、溶液をクロマトグラフィーカラムに流すことを含む。

マクロポーラス吸着樹脂を「洗浄する」するとは、適切な緩衝液を、マクロポーラス吸着樹脂の中または上に通すことを指す。
本願に用いられるように、「洗浄緩衝液」とは、目的の化合物Ｉを溶出する前に、マクロポーラス吸着樹脂（主に有機相の除去のため）を洗浄するための緩衝液のことを指す。必ずしも必須ではないが、便宜のため、洗浄緩衝液とローディング緩衝液は同じ極性であり得る。

マクロポーラス吸着樹脂から分子を「溶出する」するとは、分子を、マクロポーラス吸着樹脂の周囲の緩衝液の極性を変化させることによりマクロポーラス吸着樹脂から除去することを意味する。極性によって緩衝液は、分子とマクロポーラス吸着樹脂上における吸着部位を競争することができる。

本願に用いられるように、「溶出緩衝液」とは、固相から目的化合物Ｉを溶出するために使用される。溶出緩衝液は、マクロポーラス吸着樹脂から目的化合物Ｉを溶出することができる。

目的化合物Ｉと１種又は複数種の非目的化合物とを含有する組成物から化合物Ｉを「精製する」とは、組成物から少なくとも１種の非目的化合物を（完全にまたは部分的に）除去することにより、組成物における化合物Ｉの純度を向上させることを意味する。

本発明で説明された上述特徴、または実施例で説明された特徴を任意に組み合わせることができる。本願で開示されるすべての特徴は、任意の組み合わせで使用され得る。いずれの組成物の様態とも併用することができ、明細書で開示された各特徴は、いずれも同じ、同等または類似の目的を果たす任意の代替特徴にそれぞれ替え得る。そのため、特に説明しない限り、開示される特徴は同等または類似の特徴の一般的な例にすぎない。

本発明の主な利点は：
１．環状リポペプチド化合物、具体的にはエキノカンジン化合物を精製する新規な低コスト方法が提供される。

２．本発明により提供される方法における精製ステップの利点は、簡潔なルート、緩和な条件、高精製収率、簡潔な処理、環境に対する低い汚染などがあり、方法に対する取り扱いや設備の要求を低減し、したがってコストを低減する。

３．安定な目的産物を本発明により提供される方法を通して得ることができ、したがって最終生成物の品質管理および大規模生産を容易にする。
４．本発明により生産される目的産物は、化合物Ｉから化合物ＩＩへの変換の要求を満たすことができ、したがって化合物ＩＩ、および最終産物である化合物ＩＩＩの大量生産に有用である。

次の具体的な実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を説明しようとするだけでなく、本発明の範囲を制限しないと理解されるものである。次の実施例において、具体的な条件がない実験方法は、通常の条件下、またはメーカーによって指示されるように行われた。別の説明がない限り、すべての百分率、比率、比例または部は、重量によるものである。

本発明における重量／体積百分率の単位は当業者にとって熟知で、例えば１００ｍＬの溶液における溶質の重量である。
別の定義がない限り、本願に用いられるすべての化学用語と技術用語は、当業者に通常知られている意味と同様である。さらに、本願に記載の内容と類似または同等の方法または材料を、いずれも本発明の方法に用いることができる。本願で記載の好ましい実施形態及び材料は例示のためだけに提供される。

次の実施例において化合物Ｉ（式Ｉの化合物）はＨＰＬＣによって検出される：
Ｗａｔｅｒｓ解析ＨＰＬＣ系に基づいて解析を行った。ＦＲ９０１３７９、ニューモカンディン（Ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ）Ｂ_０および他の類縁物の検出には、逆相ＨＰＬＣ解析を用いた。逆相解析で使用された材料および条件を、次に記載する；ＣＡＬＥＳＩＬＯＤＳクロマトグラフィーカラム（粒子径５μｍ，４．６ｍｍｉ．ｄ×２５０ｍｍ）；温度：３５℃；移動相：５０％アセトニトリル／０．５％リン酸二水素アンモニウム水溶液；流速：１ｍｌ／分；２１０ｎｍ下でＵＶ検出。

［実施例１］
ＥＰ０４３１３５０Ｂ１の実施例１に記載の方法によって、化合物Ｉを含む発酵液を２２００Ｌ得た。ろ過で湿菌体を６５０ｋｇ得た。そのうちの湿菌体６５ｋｇにエタノール１００Ｌを抽出のために加えた。得られた混合物を板枠式圧濾機（ｐｌａｔｅ−ｆｒａｍｅｐｒｅｓｓｕｒｅｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）でろ過し、ろ過ケーキを洗浄し、化合物Ｉを含む抽出液１の１６０Ｌを得た。抽出液１において、化合物Ｉの的含有量は０．１１ｇ／Ｌであり、化合物ＩのＨＰＬＣ純度が７４．０８％であった。（ＨＰＬＣパターンは、図１と表１に示す。）
５．５ｇの化合物Ｉを含有する抽出液１の５０Ｌを、純水を用いて希釈し、エタノール濃度が３３％に低減し、化合物Ｉを含む抽出液２の１００Ｌを得た。

前述のステップで得られた化合物Ｉを含む抽出液２を、１時間当たり３カラム体積をロードする流速で、ＨＰ２０ｓｓ樹脂５５０ｍｌが充填されたクロマトグラフィーカラムにロードした。ロードが終了した後、３３％含水エタノール（２×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積を洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、６０％エタノール１８００ｍｌを溶出液として使用し、溶出するための流速は１時間当たり１カラム体積とした。化合物Ｉを含む画分を収集して混合した。溶出液において化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって５．２ｇ（収率９４．５％）として決定され、化合物Ｉの純度は９０．３％であった。ＨＰＬＣパターンは、図２と表２に示す。

［実施例２］
ＥＰ０４３１３５０Ｂ１の実施例１に記載の方法によって、化合物Ｉを含む発酵液を２２００Ｌ得た。発酵液に等体積のメタノールを抽出のために加えた。ろ過し、化合物Ｉを含む抽出液１を得て、化合物Ｉの含有量は０．０５１ｇ／Ｌで、ＨＰＬＣ純度が７４．５％であった。化合物Ｉを合計５．１ｇ含有する抽出液１の１００Ｌを純水で希釈し、メタノール含有量を４０％に低減し、化合物Ｉを含む抽出液２の２００Ｌを得た。

前述のステップで得られた化合物Ｉを含む抽出液２を、１時間当たり１カラム体積でロードする流速で、ＸＡＤ−１６樹脂７００ｍｌが充填されたクロマトグラフィーカラムにロードした。ロードが終了した後、４０％含水メタノール（２×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積を洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、５０％含水メタノール１８００ｍｌを溶出液として使用し、溶出するための流速は１時間当たり１カラム体積とした。化合物Ｉを含有する画分を収集して混合した。溶出液において化合物Ｉの含有量は、ＨＰＬＣによって４．７ｇ（収率９２．２％）として決定され、化合物Ｉの純度は８９．２％であった。

［実施例３］
ＥＰ０４３１３５０Ｂ１の実施例１に記載の方法によって、化合物Ｉを含む発酵液を２２００Ｌ得た。発酵液に等体積のアセトンを抽出のために加えた。ろ過し、化合物Ｉを含む抽出液１を得て、化合物Ｉの含有量は０．０５１ｇ／Ｌで、ＨＰＬＣ純度が７４．５％であった。化合物Ｉを合計２．０４ｇ含有する抽出液１の４０Ｌを純水で希釈し、アセトンの含有量を２０％に低減し、化合物Ｉを含む抽出液２の８０Ｌを得た。

前述ステップで得られた式Ｉの化合物を含む抽出液２を１００Ｌのプラスチックバケツに入れ込み、ＸＡＤ−１６ＨＰ樹脂１０００ｍｌを加えた。結果として生じる混合物を室温下で１２０分間攪拌した後、ろ紙を敷いたブフナー漏斗でろ過した。ろ液を捨て、樹脂をクロマトグラフィーカラムにロードした。２０％含水アセトン２０００ｍｌはカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、樹脂を６０％アセトンで溶出した。化合物Ｉを含有する画分を収集した。溶出液において化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣで１．７５ｇ（収率８５．８％）として決定され、純度は９０．０％であった。

［実施例４］
実施例１で得られた化合物Ｉを２．２ｇ含有する抽出液１の２０Ｌを真空で濃縮し、抽出液１におけるエタノール含有量を２０％に低減し、化合物Ｉを含む抽出液２を８Ｌ得た。

前述のステップで得られた化合物Ｉを含む抽出液２を、１時間当たり３カラム体積でロードする流速で、ＳＰ２０７樹脂の２００ｍＬが充填されたクロマトグラフィーカラムにロードした。ロードが終了した後、２０％含水エタノール（２×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積を洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、４０％含水エタノール１Ｌを溶出液として使用した。ここでの溶出するための流速は、１時間当たり１カラム体積である。化合物Ｉを含有する画分を収集し混合した。溶出液における化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって１．９４ｇ（収率８８．２％）として検出され、純度は８９．５％であった。

［実施例５］
実施例１で得られた化合物Ｉの１５９．５ｇを含有する抽出液１の１４５０Ｌを純水で希釈し、抽出液１におけるエタノール含有量を４０％に低減し、化合物Ｉを含む抽出液２の２９５０Ｌを得た。

前述ステップで得られた化合物Ｉを含む粗生成物２を、１時間当たり１０カラム体積でロードする流速で、ＨＰ２０樹脂２０Ｌが充填されたクロマトグラフィーカラムにロードした。ロードが終了した後、４０％含水エタノール（２×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積を洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、５０％含水エタノール６０Ｌを溶出液として使用した。ここでの溶出するための流速は、１時間当たり１カラム体積である。化合物Ｉを含有する画分を収集して混合した。溶出液における化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって１４５．２ｇ（収率９１．０％）として検出され、純度は９０．４％であった。

［実施例６］
実施例１で得られた化合物Ｉを５．５ｇ含有する抽出液１の５０Ｌを、純水で希釈し、抽出液１におけるエタノール含有量を１０％に低減し、化合物Ｉを含む抽出液２を得た。

前述のステップで得られた化合物Ｉを含む抽出液２を、１時間当たり３カラム体積でロードする流速で、ＨＰ２０樹脂５５０ｍｌが充填されたクロマトグラフィーカラムにロードした。ロードが終了した後、１０％含水エタノール（２×カラム体積）が、１時間当たり１カラム体積を洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、エタノール１８００ｍｌを溶出液として使用した。ここでの溶出するための流速は１時間当たり１カラム体積である。化合物Ｉを含有する画分を収集して混合した。溶出液における化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって５．１５ｇ（収率９３．６％）として決定され、純度は８５．４％であった。

［比較実施例１］
実施例１で得られた化合物Ｉを合計５．５ｇ含有する抽出液１の５０Ｌを、純水で希釈し、抽出液１におけるエタノール含有量を３２％に低減し、化合物Ｉを含む抽出液２を１０３Ｌ得た。

前述のステップで得られた化合物Ｉを含む抽出液２を、１時間当たり１０カラム体積でロードする流速で、ＨＰ２０樹脂５５０ｍｌが充填されたクロマトグラフィーカラムにロードした。ロードが終了した後、４５％含水エタノール（２×カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積を洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、５０％含水エタノール１８００ｍｌを溶出液として使用した。ここでの溶出するための流速は１時間当たり１カラム体積である。化合物Ｉを含有する画分を収集し混合した。溶出液における化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって２．１３ｇ（収率３８．７％）として決定され、純度は９０．４％であった。

［比較実施例２］
実施例１で得られた化合物Ｉを５．５ｇ含有する抽出液１の５０Ｌを、純水で希釈し、抽出液１におけるエタノール含有量を４５％に低減し、化合物Ｉを含む抽出液２の１０３Ｌを得た。

前述ステップで得られた化合物Ｉを含む抽出液２を、１時間当たり３カラム体積でロードする流速で、ＨＰ２０樹脂５５０ｍｌが充填されたクロマトグラフィーカラムにロードした。ロードが終了した後、３３％含水エタノール（２カラム体積）は、１時間当たり１カラム体積を洗浄する流速でカラムを洗浄するために使用された。洗浄が終了した後、６０％含水エタノール１８００ｍｌを溶出液として使用した。ここでの溶出するための流速は１時間当たり１カラム体積である。化合物Ｉを含有する画分を収集し混合した。溶出液における化合物Ｉの含有量はＨＰＬＣによって１．０８ｇ（収率１９．６％）として決定され、純度は８５．４％であった。

上記実施例は本発明の好ましい実施例だけで、本発明の範囲を限定するものではない。本発明に関する実質の技術内容は広義的に請求の範囲に定義される。そして、上記実体または方法が請求の範囲に定義されたものと同じであるならば他の人によって達成された実体または方法は、請求の範囲に定義されたような範囲と同等及び範囲に含まれるとして見なされるべきである。

Claims

式Ｉの化合物又はその塩の精製方法であって、
前記方法は次のステップ：
（１）発酵液を抽出するために式Ｉの化合物又はその塩を含む発酵液を有機溶媒と混合すること、およびろ過又は遠心によって、抽出液１を得ること、
（２）有機溶媒の含有量を低減するために抽出液１を希釈又は真空で濃縮することによって抽出液２を得ること、
（３）抽出液２をマクロポーラス吸着樹脂にロードすること、
（４）洗浄液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂を洗浄すること、
（５）溶出液として水、有機溶媒、または有機溶媒と水の混合溶液を用いて、マクロポーラス吸着樹脂から式Ｉの化合物を溶出すること、
を含む式Ｉの化合物又はその塩の精製方法。
ステップ（３）において、前記抽出液２を前記マクロポーラス吸着樹脂が充填されたクロマトグラフィーカラムに流すこと、または前記マクロポーラス吸着樹脂をそのまま前記式Ｉの化合物を含む抽出液に投入し、結果として生じる混合物を５〜１２０分攪拌することによって、前記式Ｉの化合物を含む前記抽出液２を前記マクロポーラス吸着樹脂にロードする請求項１に記載の精製方法。
前記流速は１時間当たり０．１〜１０カラム体積である請求項２に記載の精製方法。
ステップ（１）において、前記発酵液は、前記発酵液をろ過又は遠心することで得られる菌体を含む請求項１に記載の精製方法。
ステップ（２）において、前記抽出液２の総体積に対して、有機溶媒の体積百分率は０〜４０％である請求項１に記載の精製方法。
ステップ（３）において、式Ｉの粗化合物と前記マクロポーラス吸着樹脂の重量比は０．１〜１．０：１００（ｇ／ｍｌ）である請求項１に記載の精製方法。
ステップ（４）において、前記洗浄液の総体積に対して、前記有機溶媒の体積百分率は０〜４０％、好ましくは２０％〜４０％である請求項１に記載の精製方法。
ステップ（５）において、前記溶出液の総体積に対して、前記有機溶媒の体積百分率は４０〜９０％、好ましくは４０〜６０％である請求項１に記載の精製方法。
前記マクロポーラス吸着樹脂は、スチレンとジビニルベンゼンとが重合した非極性の芳香族吸着樹脂、または該樹脂構造においてメタクリレート単位を有する中等極性のメタクリル吸着樹脂、から選ばれる請求項１〜８のいずれか１項に記載の精製方法。
前記吸着樹脂は、ＸＡＤ−１、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−３、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−５、ＸＡＤ−１６、ＸＡＤ−１６ＨＰ、ＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−２０ｓｓ、ＨＰ−２１、ＨＰ−３０、ＨＰ−４０、ＨＰ−５０、ＳＰ−８２５、ＳＰ−８５０、ＳＰ−７０、ＳＰ−７００、ＳＰ−２０７、ＳＰ２０７ｓｓ、ＸＡＤ−６、ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−７ＨＰ、ＸＡＤ−８、ＨＰ−２ＭＧ、またはそれらの混合物から選ばれる請求項９に記載の精製方法。
前記有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、ブタノン、またはそれらの混合物から選ばれる請求項1〜８のいずれか１項に記載の精製方法。