JP2980689B2 - シクロスポリンａの製造方法 - Google Patents

シクロスポリンａの製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、下記の構造式（Ｉ）で示されるシクロスポ
リンＡを製造する新規の方法に関するものである。
前記構造式のシクロスポリンＡは、11個のアミノ酸か
らなる、分子量1202、分子式C62H111N11O12の環式ペプ
チドであり、シクロスポリンＡを生産する菌株であるト
リポクラジウム インフラチュム（Tolypocladium infl
atum）の培養液から得られる。アミノ酸の種類により25
個のシクロスポリンＡの誘導体がある［Traber R.,HELV
ETICA ACTA,70,13（1987）］。
シクロスポリンＡの化学名は、シクロ［｛（Ｅ）−
（2S,3R,4R）−３−ヒドロキシ−４−メチル−２−（メ
チルアミノ）−６−オクテノイル｝−Ｌ−２−アミノブ
チリル−Ｎ−メチル−グリシル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイ
シル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ア
ラニル−０−アラニル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｎ
−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル］で
ある。シクロスポリンＡは、非常に強い免疫抑制効果を
示すため、移植組織に対する免疫反応の症状の抑制およ
び自己免疫症の治療に用いられている。また、抗真菌、
殺菌および抗炎症効果も有することも知られている［Bo
rel J.F.,Prog.Allerqy,38,9（1986）］。
背景技術 シクロスポリンＡを製造する方法に関する先行技術と
して、カビ菌の種であるシンリンドロカルボン ルシジ
ル（Cylindrocarpon lucidum）およびトリポクラジウム
インフラチュム（Tolypocladium inflatum）による発
酵を用いる方法が、英国特許第1,491,509号と、米国特
許第4,117,118号と、米国特許第4,215,199号に記載され
ている。また、これら特許には培養液からシクロスポリ
ンＡを回収するための各種の方法が開示されている。
前記特許において、先ず培養液から単離される菌糸体
を溶媒抽出してから、抽出物をセファデックス（Sephad
ex）、酸化アルミニウムおよびシリカゲル等のクロマト
グラフィ媒体を順次に使用して回収する方法が、培養液
からシクロスポリンＡを回収するための方法として用い
られている。これらの方法によれば、培養液をろ過する
ことにより得られた単離固体物である菌糸体に培養を加
え；この混合物を遠心抽出機により溶媒抽出し；得られ
た抽出物を水またはヘキサン等を用いて前処理し；セフ
ァデックス、酸化アルニミウムおよびシリカゲル等のク
ロマトグラフィ媒体により精製してシクロスポリンＡを
得る。しかし、この工程は、培養液をろ過することによ
り得られた単離固体物である菌糸体を溶媒抽出して、セ
ファデックスを含めて２または３種のクロマトグラフィ
媒体を使用するので、複雑である。さらに、この工程
は、各々のクロマトグラフィ媒体処理に別途の展開溶媒
を使用しなければならないので、工程経済上の問題およ
び環境問題を招くおそれがある。
従って、このような工程の複雑さを克服するためおよ
び経済的な負担を軽減するために、シクロスポリンＡの
様々な精製方法が研究されてきた。
例えば、米国特許第5,256,547号と欧州特許第057,968
（A1）号によれば、培養液をろ過することにより得られ
た単離固体物である菌糸体を乾燥し、溶媒抽出し、粗シ
クロスポリンＡを得て；生成物を水等で洗浄することな
く前処理し、高価なセファデックスの使用を避けて酸化
アルミニウムおよびシリカゲルを用いたクロマトグラフ
ィにより精製してシクロスポリンＡを得る。また、米国
特許第5,156,960号の教示内容によれば、培養液に溶媒
を直接加えることで抽出し、その抽出液をより高い溶解
度を有する溶媒に移し、その溶液を無水硫酸マグネシウ
ムなどの乾燥剤で乾燥させ、セファデックスおよびシリ
カゲル等によるクロマトグラフィにより精製してシクロ
スポリンＡを得る。
しかし、前記米国特許第5,256,547号に記載された技
術は、溶媒抽出により色素量が減少すること、およびこ
の処理が溶媒の前処理工程とクロマトグラフィ工程にお
いて単純化されるという長所があるが、それは菌糸体を
乾燥させる追加工程が必要になる短所も有している。一
方、米国特許第5,156,960号に記載された技術は、ろ過
後培養液から分離した菌糸体から溶媒抽出する代わり
に、単に直接溶媒を加えて培養液から溶媒抽出するこ
と、および溶媒を前処理せずにクロマトグラフィ媒体に
よる処理を行うといった長所がある。しかし、その工程
短縮により転移溶媒に多量の水分が含まれているので、
高価な無水硫酸マグネシウムで乾燥させる更なる工程が
なければならず、セファデックスおよびシリカゲルのク
ロマトグラフィ媒体を使用することで、産業化させるに
は、それは、複雑さおよび経済的短所をなお含んでい
る。
発明の開示 本発明者等は、上記の先行技術の問題点を解決すべく
努力した結果、培養液をろ過することで単離した菌糸体
の溶媒抽出の代わりに、培養液に直接溶媒を加えて溶媒
抽出する工程；無水硫酸マグネシウムの乾燥工程なしで
シリカゲルを用いた単一のクロマトグラフィの工程から
なる、シクロスポリンＡを製造するための新規で経済的
な方法を完成した。
本発明は、トリポクラジウム インフラチュム（Toly
pocladium inflatum）の変異株の培養液にアルカノール
溶媒を加えてこの混合物を抽出する工程；その抽出物を
より高い溶解度を有する低級塩化炭化水素溶媒に移す工
程；その溶液を活性炭で処理する工程；および得られた
生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィにかける
工程からなる、シクロスポリンＡの製造方法に関するも
のである。
前記培養液の抽出過程では、アルカノール溶媒が使用
される。添加されるアルカノールの量は培養液のかさの
約２倍が望ましく、抽出は約30分間撹拌しながら、行う
ことが望ましい。
また、生成物が移される先の低級塩化炭化水素溶媒と
しては、塩化メチレン、塩化エチレン、クロロホルムを
用いることができる。これら溶媒の中でも、塩化メチレ
ンが好ましく用いられる。また、クロマトグラフィ媒体
による処理の前に、有色不純物を除去するために、生成
物を活性炭で処理することが望ましい。
本発明に係る製法において、先行技術の、産業化する
ための大きな問題点を有する乾燥工程が省略され、か
つ、非極性の低級塩化炭化水素を使用することで、抽出
溶液の水分含量を大きく低減する。
また、シクロスポリンＡの純度は、転移溶媒としての
低級塩化炭化水素の選択および活性炭の処理により改善
され、クロマトグラフィ処理の単純化によりかなりの量
の溶媒が節約され、経済的負担が低減される。
発明の最良の実施形態 ここで、本発明を以下の実施例によりさらに説明す
る。しかしながら、本発明はその実施例によって限定さ
れることではない。
実施例１ ３リットルのメタノールを、1.5リットルのシクロス
ポリンＡ（7,115μg/ml）を含む培養液に加え、この混
合物をろ過し、抽出されたシクロスポリンＡを回収し
た。得られた抽出物を、２リットルのヘキサンで洗浄
し、２リットルの塩化メチレンを加えることでさらに生
成物を抽出した。有色不純物を除去するために、30gの
活性炭をこの混合物に添加した。ろ過後、この混合物を
蒸発乾固させた。
得られた生成物を、50mlの酢酸エチルに溶解し、この
溶液をシリカゲルカラムの上方にのせた。酢酸エチルで
生成物を溶離した後、ひとまとめにした所望の生成物を
含んだフラクション（3,000ml）を、蒸発乾固させた。
３リットルのエチルエーテルを添加し、生成物を溶解
し、150mlのメトキシメタンをこの混合物に添加した。
沈殿した生成物を単離し、シクロスポリンＡを得た（6.
4g,含量:98.5〜100.0％）。
実施例２ ３リットルのメタノールを、1.5リットルのシクロス
ポリンＡ（6,757μg/ml）を含む培養液（1.5L）に加
え、この混合物をろ過し、抽出されたシクロスポリンＡ
を回収した。この抽出物を1.1リットルのかさまで濃縮
した後、この濃縮物を、1.1リットルのメトキシメタン
で洗浄し、得られた生成物を1.1リットルの塩化メチレ
ンで２回抽出した。
実施例１に従って、生成物を活性炭処理し、シリカゲ
ルのクロマトグラフィを行い、シクロスポリンＡを得た
（7.09g,含量:98.5〜100.0％）。
実施例３ メタノール抽出物を、２リットルのメトキシメタンで
清浄したことを除いては、実施例１と同じような方法を
反復してシクロスポリンＡを得た（含量:98.5〜100.0
％）。
フロントページの続き (72)発明者 リー，サング，チュル 大韓民国 キェオングギ−ドー 463− 020，セオングナム、ブンダング−グ, スナエ−ドング，34 (72)発明者 チョイ，ガング，スン 大韓民国 キェオングギ−ドー 441− 090，スウェオン，クウェオンスン−グ, ゴデウング−ドング，198−22， ロッ テ アパートメント，１−401 (72)発明者 ハム，ユン，ベオム 大韓民国 キェオングギ−ドー 402− 022，インチェオン，ナム−グ，ヨング ヒュン ２−ドング，ドンガー ビラ, ２−302 (72)発明者 リー，ドン，ワ 大韓民国 キェオングギ−ドー 403− 013，インチェオン，ブグ−グ，プピェ オング ３−ドング，182，バイグン ビラ，８−301 (72)発明者 ミン，キェオング，ボク 大韓民国 ソウル 151−057，クワナグ −グ，ボングチュン ７−ドング，1626 −23 (56)参考文献 特開 昭57−63093（ＪＰ，Ａ) 国際公開94／16091（ＷＯ，Ａ１) 国際公開92／13094（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/04 C07K 1/00 - 1/36 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】トリポクラジウム インフラチュム（Toly
    pocladium inflatum）の変異株の培養液に低級アルカノ
    ール溶媒を加えてこの混合物を抽出する工程；その抽出
    物を塩化メチレン、塩化エチレンおよびクロロホルムよ
    り選ばれる低級ハロゲン化炭化水素溶媒に移す工程；お
    よび得られた生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラ
    フィにかける工程からなるシクロスポリンＡの製造方
    法。
  2. 【請求項２】転移されたハロゲン化炭化水素溶液を、活
    性炭で処理することを特徴とする請求項１に記載のシク
    ロスポリンＡの製造方法。
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