RU2182577C2 - Способ получения циклоспорина a высокой чистоты из сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс - Google Patents
Способ получения циклоспорина a высокой чистоты из сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс Download PDFInfo
- Publication number
- RU2182577C2 RU2182577C2 RU98123499/04A RU98123499A RU2182577C2 RU 2182577 C2 RU2182577 C2 RU 2182577C2 RU 98123499/04 A RU98123499/04 A RU 98123499/04A RU 98123499 A RU98123499 A RU 98123499A RU 2182577 C2 RU2182577 C2 RU 2182577C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cyclosporin
- toluene
- vol
- mixture
- column
- Prior art date
Links
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 title claims abstract description 78
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 title claims abstract description 73
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 title claims abstract description 43
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 108
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 46
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 34
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 claims description 22
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 11
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 10
- JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-[(1r)-1-hydroxyethyl]-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontan Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N 0.000 claims description 9
- FWMBRFVXLUJFCT-WKHWYDSQSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-ethyl-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,25,28-octamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20 Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O FWMBRFVXLUJFCT-WKHWYDSQSA-N 0.000 claims description 9
- ZNVBEWJRWHNZMK-SYOLRUPNSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21,30-tri(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20,2 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC1=O ZNVBEWJRWHNZMK-SYOLRUPNSA-N 0.000 claims description 9
- ZSNYYEIGOZADKA-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin L Natural products CCC1NC(=O)C(C(O)C(C)CC=CC)NC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O ZSNYYEIGOZADKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- FWMBRFVXLUJFCT-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin U Natural products CCC1NC(=O)C(C(O)C(C)CC=CC)N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O FWMBRFVXLUJFCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108010019594 cyclosporin D Proteins 0.000 claims description 9
- UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28,30-decamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20,23 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C)NC1=O UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N 0.000 claims description 8
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 6
- XYKIUTSFQGXHOW-UHFFFAOYSA-N propan-2-one;toluene Chemical compound CC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 XYKIUTSFQGXHOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 20
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 abstract description 18
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 abstract description 18
- 108010036941 Cyclosporins Proteins 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 13
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 9
- JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin C Natural products CC=CCC(C)C(O)C1N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C(C(C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010019248 cyclosporin C Proteins 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 7
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;toluene Chemical compound CCOC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000123975 Trichoderma polysporum Species 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;propan-2-one Chemical compound ClCCl.CC(C)=O FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N intermediate I Chemical compound COC(=O)[C@@]1(C=O)[C@H]2CC=[N+](C\C2=C\C)CCc2c1[nH]c1ccccc21 QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N 0.000 description 2
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000875119 Cylindrocarpon lucidum Species 0.000 description 1
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- WYJQVXRGLXLWMZ-UHFFFAOYSA-N chloroform;dichloromethane;ethanol Chemical compound CCO.ClCCl.ClC(Cl)Cl WYJQVXRGLXLWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFKWBMYVKWXMCO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol;ethyl acetate Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl.CCOC(C)=O XFKWBMYVKWXMCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- -1 cyclosporin compound Chemical class 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000012899 standard injection Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
- C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Silicon Compounds (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения циклоспорина А высокой чистоты путем очистки сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс, путем многоступенчатой хроматографии на силикагеле при высокой загрузке колонны от 10 до 52%, с использованием в качестве элюента смеси толуола с ацетоном в количестве от 10 до 30 об.% или толуола с этилацетатом в количестве от 10 до 35 об.%, циклоспорина А высокой чистоты с содержанием в нем циклоспорина L, U и D менее 0,05% и содержанием в нем циклоспорина В и С < 0,02 об.%, промышленного способа очистки циклоспорина А от сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс. 3 с. и 7 з.п.ф-лы, 1 табл.
Description
Объектом этого изобретения является способ хроматографической очистки циклоспорина А от сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс, с использованием колонки, заполненной силикагелем, и посредством применения многоступенчатой хроматографии с колонкой, заполненной нормальной фазой силикагеля, и растворяющей смеси, содержащей в качестве основного компонента толуол.
Циклоспорины представляют собой N-метилированные в нескольких местах ундекапептиды и большинство из них обладает фармакологическим действием. До сих пор были известны 25 членов этой группы соединений, которые обозначены буквами от А до Z. Сначала из них выделили циклоспорин А, который представляет собой природный материал, выделенный из культуральной жидкой среды (бульона) штамма Тоlypocladium inflatum Gams (Helv. Chim. Acta 59, 1075/1976/). Сперва это соединение стало известным как легкий противогрибковый антибиотик, а позже внимание было привлечено к его иммунодепрессивному действию. (J.F. Borel et al. Immunology 32, 1017/1977/). По этой причине его в основном применяли при трансплантации органов от других субъектов (легкого, сердца, почки, костного мозга, кожи). Фармакологические исследования подтвердили, что он ингибирует как тканевые, так и клеточные иммунные реакции путем воспрепятствования разрастанию Т-клеток и прерывания синтеза интерлейкина-2. Позже стало ясно, что он является эффективным при различных типах аутоиммунных и воспалительных заболеваний, например при аутоиммунных гематологических болезнях, неспецифическом язвенном колите, болезни Грейвса, рассеянном склерозе, псориазе, а также ревматическом артрите. Для лечения инфекционных заболеваний, вызванных простейшими, а также опухолей были проведены дополнительные эксперименты. Важность этой группы показывается тем фактом, что посредством модификации различных аминокислот и заместителей может быть получен ряд синтетических родственных соединений (например, патенты ЕР 56782, СН 630062 и ЕР 29122).
Большую чть циклоспоринов получают путем ферментации. В качестве примеров культур микроорганизмов использовали Cylindrocarpon Lucidum Booth (описание патента N CH 589716); Trichoderma polysporum Rifai (описание патента N CH 603790); Tolypocladium varium (описание патента N HU 201557). В конце ферментации в зависимости от характера процесса образуется циклоспориновый комплекс, который может также содержать другие примеси (ингредиенты культуральной среды, противовспенивающее вещество, метаболиты и т.д.).
Обычно продукт отделяют от бульона посредством процесса экстракции. Его можно осуществлять путем выделения из бульона мицелия посредством центрифугирования или фильтрации, затем растворения активного ингредиента из мицелия метанолом или ацетоном и экстракции фильтрата водонесмешивающимися растворителями. Другим известным способом выполнения является способ без фильтрации, в котором применяют экстракцию всего бульона водонесмешивающимся органическим растворителем. Растворитель, содержащийся в органической фазе, выпаривают посредством вакуумной перегонки. Однако во время экстракции органическим растворителем соединения, имеющие липидные свойства, также переносятся в органическую фазу, что вызывает трудности при дальнейшей очистке. Для отделения этих соединений известны следующие способы (например, описание патента Швейцарии N 589716 или опубликованная заявка на патент Германии N 2455859), где после удаления экстрагирующего растворителя остаток растворяют в смеси метанола-воды и затем несколько раз экстрагируют таким же объемом петролейного эфира. Порции петролейного эфира соединяют и из них посредством смеси метанола-воды извлекают циклоспорины. Активное вещество посредством многоступенчатой экстракции переносят из фазы смеси метанола-воды в этиленхлорид, которое затем промывают водой и выпаривают до сухого остатка. Полученный вышеуказанным способом сырой продукт, содержащий циклоспорины, можно очистить более эффективно одним из хроматографических методов.
В соответствии со способом, описанным в патенте США N 4117118, циклоспориновую смесь сначала переносят в колонку Sephadex LH-20 (Сефадекса) и элюируют метанолом, затем ее последовательно элюируют в колонке с оксидом алюминия смесью толуола и этилацетата (15%) и в колонке с силикагелем смесью хлороформа и этанола (2%). Несмотря на повторную хроматографию, полученный продукт не является чистым, а представляет собой смесь циклоспорина А и В.
Подобный хроматографический способ раскрыт среди прочих в патенте США N 4215199, в котором грубую очистку осуществляют в колонке с силикагелем смесью хлороформа и метанола при объемном соотношении компонентов в смеси 98:2. Затем элюат выпаривают до сухого остатка. Остаток растворяют в метаноле и подвергают хроматографии в колонке Сефадекса LH-20 с применением в качестве элюента метанола. Фракции элюата выпаривают до
сухого остатка, затем остаток растворяют в смеси хлороформа и метанола при объемном соотношении компонентов в смеси 98:2. Затем его опять подвергают силикагельной хроматографии. В элюате первым появляется циклоспорин А. Эту и последующие фракции отделяют и посредством выпаривания элюента получают чистые компоненты.
сухого остатка, затем остаток растворяют в смеси хлороформа и метанола при объемном соотношении компонентов в смеси 98:2. Затем его опять подвергают силикагельной хроматографии. В элюате первым появляется циклоспорин А. Эту и последующие фракции отделяют и посредством выпаривания элюента получают чистые компоненты.
В соответствии с патентом Германии N DD 298276 маслянистый сырой продукт растворяют в небольшом количестве хлороформа, затем подвергают хроматографии в колонке с оксидом алюминия с применением хлороформа. Содержащие циклоспорин А фракции выпаривают в вакууме, растворяют в хлороформе, подвергают подобной колоночной хроматографии и затем элюируют хлороформом. Фракции, содержащие активное вещество, опять выпаривают в вакууме. К остатку добавляют гексан и кристаллизуют циклоспорин А. Продукт промывают гексаном, затем сушат и наконец повторно кристаллизуют из смеси простого эфира и гексана или ацетона.
В соответствии с патентом Венгрии N 201577 сырой продукт, полученный после выпаривания, может быть очищен в колонке с силикагелем путем элюирования смесью хлороформа и метанола при постепенно возрастающей концентрации метанола. Процесс начинают с применения чистого хлороформа и продолжают при увеличении концентрации метанола в элюате на последующих ступенях на 0,5 об. %. Циклоспорин А элюируют из колонки хлороформом, содержащим метанол в количестве 2 об.%, циклоспорин В-хлороформом, содержащим метанол в количестве 2,5 об.%, циклоспорин С-хлороформом, содержащим метанол в количестве 3 об.%. Компоненты получают путем выпаривания фракций.
Упомянутые выше способы описывают в основном методы ферментации циклоспорина, в которых основной целью ступеней очистки является идентификация полученного продукта. Поэтому продукт выделяют лишь в небольшом количестве, причем приводятся только физические и химические свойства без публикации данных, относящихся к чистоте продукта и к количествам примесей.
Rueger и Со. /Helv. Chim. Acta 59(4), р-1075-92 (1976)/ для идентификации и структурного анализа выделили небольшие количества чистого циклоспорина А и С посредством повторных хроматографий и других стадий очистки. В соответствии с этой статьей сырой продукт, полученный в результате ферментации Trichoderma polysporum Rifai, содержащий в основном циклоспорины А и С, обезжиривают метанолом и петролейным эфиром. После выпаривания остаток растворяют в хлороформе и подвергают хроматографии посредством градиентного элюирования с применением в качестве элюента смеси хлороформа и метанола при объемном соотношении компонентов в смеси 98,5:1,5. Посредством дальнейшей хроматографии получают чистый кристаллический циклоспорин А. Фракцию, содержащую циклоспорин А, растворяют в метаноле и подвергают хроматографии в колонке Сефадекса LP-20 с использованием в качестве элюента метанола. Фракции выпаривают, растворяют в толуоле и подвергают хроматографии в колонке, заполненной оксидом алюминия, с применением в качестве элюента толуола в присутствии увеличивающейся концентрации уксусной кислоты. После выпаривания фракций и обработки активированным углем в спиртовом растворе получают кристаллический продукт.
Способ очистки, осуществляемый в промышленном масштабе, описан в патенте США 5382655. В соответствии со способом сырой продукт, содержащий различные циклоспориновые компоненты, подвергают термообработке до хроматографии в колонке с силикагелем с применением в качестве элюента смесей хлороформа-этанола-дихлорметана и хлороформа-этилацетатаэтанола. Затем полученный продукт подвергают дальнейшей хроматографии и перекристаллизации, в результате получают высококачественный чистый продукт, подходящий для инъекции.
Очистка сырого продукта, содержащего смесь циклоспоринов, является очень трудной, так как примеси, имеющие подобные химические структуры, имеют хроматографические характеристики, очень похожие на хроматографические характеристики циклоспорина А, являющегося основным продуктом. Способы, которые описаны ранее, доказывают, что независимо от применяемой растворяющей смеси и из-за перекрытия хроматографических пиков для получения определенных компонентов в чистой форме следует осуществлять дополнительные стадии хроматографии или очистки. Способы очистки, известные до сих пор, обычно характеризуются не только тем фактом, что при их применении предъявляются большие требования к растворителю, а также тем, что необходимо применение 3-4 различных типов растворителей или растворяющих смесей и 2-3 типов набивки колонки. Как следствие этих фактов в способе необходимы несколько типов хроматографических методов и способов регенерации, которые создают трудности при разработке конструктивно простой и одинаково управляемой экономичной технологии для осуществления в промышленном масштабе.
При применении хлорированных углеводородов с точки зрения охраны окружающей среды возникают дополнительные проблемы, поэтому все большее количество стран предпринимает попытки для ограничения их использования.
Что касается материалов набивки колонки, то применение алюминиоксидной набивки для промышленных целей вызывает большие сомнения, потому что вследствие ее небольшой удельной поверхности ее несущая способность и способность к разделению являются очень малыми. Кроме того, она является невыгодной для промышленных целей, потому что алюминийоксидная набивка является жесткой и хрупкой, вследствие чего возникает необходимость в специальном оборудовании и технологии. Такие набивки не могут быть использованы в часто опорожняемых колонках из нержавеющей стали, обычно применяемых в химической промышленности.
Набивки типа Сефадекса являются очень дорогостоящими и в случае циклоспоринового комплекса их эффективность очень ограничена, так как размеры различных молекул являются очень близкими.
Целью настоящего изобретения является создание легко применимого в промышленном масштабе хроматографического способа очистки, который является подходящим для производства ингредиента циклоспорина А, содержащего гораздо меньше примесей, вследствие чего его можно использовать безопасным путем в медицинской практике.
Нашей целью является создание такой технологии хроматографической очистки, для которой необходим только один тип растворяющей смеси и один тип набивки колонки.
Вследствие его выгодных свойств - высокой удельной поверхности, большого размера пор, высокой поглощающей способности, легкого манипулирования и относительно низкой стоимости - в качестве набивки колонки применяли силикагель. Для этой набивки, которая является подходящей для отделения циклоспориновых компонентов с высокой селективностью, следует выбрать идеальную растворяющую смесь и способ.
В результате наших экспериментов мы поняли, что наша цель может быть реализована посредством многоступенчатой хроматографии в колонке с силикагелем с применением в качестве элюента растворяющей смеси, основным компонентом которой является толуол. Неожиданно было обнаружено, что посредством трехступенчатой хроматографии в колонке с силикагелем с применением в качестве элюента толуола, содержащего ацетон, могут быть отделены даже компоненты циклоспорин U и L, которые являются самыми близкими к циклоспорину А. Эти компоненты отличаются от циклоспорина А только метильной группой.
В соответствии с первым примером заявки No. WO 94/16091 растворяющую смесь толуола и ацетона также применяют на одной стадии. Полученный продукт перекристаллизовывают из растворяющей смеси простого эфира и гексана (Выход: 66,6%). Оптическое вращение продукта является достаточным, но его температура плавления значительно ниже той, которая описана в литературе, что указывает на то, что продукт является нечистым. Таким образом, даже перекристаллизация из растворителя будет давать продукт с невысокой степенью чистоты и низким выходом.
Способ в соответствии с настоящим изобретением является подходящим для разделения наиболее часто встречающихся примесей, например циклоспоринов В и С, которые присутствуют в больших количествах и, кроме того, циклоспориновых компонентов D, U и L, которые присутствуют в следовых количествах. Содержание циклоспоринов В и С в конечном продукте циклоспорине А, полученном этим способом, составляет менее 0,02 об.%, тогда как содержание циклоспоринов L, U и D составляет ниже 0,05 об.%.
Объектом нашего изобретения является усовершенствованный способ очистки циклоспорина А от сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс, который обеспечивает также получение высокочистого циклоспорина А в большом масштабе хроматографическим методом в силикагельной колонке с применением многоступенчатой хроматографии, которую осуществляют с помощью растворяющей смеси, содержащей в качестве основного компонента толуол. Другой новой особенностью способа является применение нами высокой колоночной нагрузки. В общепринятой хроматографической практике степень колоночной нагрузки составляет не более 5-10% от загрузки колонки, и это значение для циклоспоринов является более низким.
Многоступенчатая хроматография, растворяющая смесь, содержащая в качестве основного компонента толуол, и высокая колоночная нагрузка взаимосвязаны, и желательный результат может быть также достигнут посредством их совместного применения. Поэтому для получения очень чистого продукта следует одновременно применять все три вышеуказанных свойства.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно последовательно применяют 2-4 хроматографические ступени и более целесообразно три ступени.
Перенагрузка колонки является самой высокой на первой ступени хроматографии. Точное разделение активного вещества и примесей обеспечивает также высокую колоночную нагрузку на двух последующих стадиях хроматографии.
Для очистки выгодно использовать растворяющую смесь толуола-ацетона, которая содержит не более 30 об.% ацетона.
В соответствии с другим подходящим способом применяют растворяющую смесь толуола-этилацетата, в которой концентрация этилацетата ниже 35 об.%.
В способе очистки благоприятно, по меньшей мере, один раз применять градиентное элюирование.
В соответствии с нашими экспериментами было найдено, что для очистки циклоспоринового комплекса в нашем случае выгодно использовать 10-30 об.% и более подходящие 13-18 об.% ацетона и 10-35 об.% или 15-20 об.% этилацетата.
В соответствии с возможным способом настоящего изобретения в случае трехступенчатой хроматографии элюирование осуществляют толуолом, содержащим 15 об. % ацетона или 18 об.% этилацетата. На первой ступени отделяют основную часть циклоспорина С, на второй ступени удаляют большую часть циклоспориновых компонентов В, L и U, и на последней третьей ступени некоторые количества компонентов L и U и других неидентифицируемых примесей могут быть уменьшены до содержания менее 0,05 об.%. На первой ступени потери циклоспорина А являются минимальными, однако в предварительно полученных фракциях второй и третьей ступеней вместе с циклоспориновым компонентом D, который очень близок к циклоспорину А, удаляется значительное количество циклоспорина А. Этот циклоспорин А можно извлечь на четвертой ступени в очень чистой форме.
Для сравнения ниже в таблице представлены профили примесей стандартного циклоспорина А фармацевтической чистоты согласно Фармакопеи США (USP), активный ингредиент циклоспорин А из инъекции SANDIMMUN®, а также данные продукта циклоспорина А, полученного настоящим изобретением.
Стандартная инъекция SANDIMMUN® согласно фармакопеи США продукт в соответствии с примером 1 (см. таблицу в конце описания).
Из данных можно видеть, что качество циклоспорина А, полученного настоящим изобретением, значительно превосходит свойства инъекции SANDIMMUN®, более того, циклоспорин А, полученный настоящим изобретением, даже перевыполняет требования фармакопеи США.
Способ в соответствии с настоящим изобретением применим для очистки сырого продукта как в небольшом, так и в большом масштабе.
Кроме того факта, что способ в соответствии с изобретением обеспечивает получение чистого циклоспорина А, он имеет также некоторые весьма значительные технологические преимущества. Поскольку применяют только один вид технологического метода (хроматографию), способ очистки является легко управляемым, кроме того он воспроизводим и может быть превращен в непрерывный процесс. Более того, имеется еще одно определенное преимущество, состоящее в том, что на трех ступенях хроматографии применяют только один тип растворяющей смеси, в связи с чем регенерация как колонок, так и растворителей упрощается.
Дополнительная выгода способа заключается в том, что во время первой ступени хроматографии значительно связывающиеся примеси остаются в колонке, что значительно облегчает регенерацию загрузок колонки на двух последующих стадиях.
Изобретение объясняется далее примерами, приведенными не с целью ограничения защиты, а с целью иллюстрации.
В сравнительном примере (примере 4) показано, что при применении в трехступенчатой хроматографии растворяющей смеси дихлорметана-ацетона, используемой до сих пор в известных способах, невозможно получить конечный продукт подобной чистоты.
Пример 1
Очистка сырого цикдоспоринового продукта трехступенчатой хроматографией с применением растворяющей смеси толуола-ацетона.
Очистка сырого цикдоспоринового продукта трехступенчатой хроматографией с применением растворяющей смеси толуола-ацетона.
Качество исходного циклоспоринового продукта,об.%:
Содержание циклоспорина А - 60,9
Содержание циклоспорина В - 11,2
Содержание циклоспорина С - 8,3
Содержание циклоспорина L - 1,79
Содержание циклоспорина U - 1,58
Содержание циклоспорина D - 1,25
1-я Ступень
Хроматографию осуществили с помощью соединенных последовательно двух хроматографических колонок, каждая колонка вместе с кожухом имела объем 8 л, диаметр 10 см, длину 100 см. Каждая из двух колонок содержала 3,95 кг силикагеля Kieselgel типа Мерка с размером зерна 0,04-0,063 мм. На первой ступени хроматографии обе колонки содержали свежий силикагель. На следующей ступени хроматографии первую колонку отделили, и вторую колонку соединили с колонкой, содержащей свежий силикагель. В дальнейшем на каждой ступени хроматографии применяли только одну новую колонку.
Содержание циклоспорина А - 60,9
Содержание циклоспорина В - 11,2
Содержание циклоспорина С - 8,3
Содержание циклоспорина L - 1,79
Содержание циклоспорина U - 1,58
Содержание циклоспорина D - 1,25
1-я Ступень
Хроматографию осуществили с помощью соединенных последовательно двух хроматографических колонок, каждая колонка вместе с кожухом имела объем 8 л, диаметр 10 см, длину 100 см. Каждая из двух колонок содержала 3,95 кг силикагеля Kieselgel типа Мерка с размером зерна 0,04-0,063 мм. На первой ступени хроматографии обе колонки содержали свежий силикагель. На следующей ступени хроматографии первую колонку отделили, и вторую колонку соединили с колонкой, содержащей свежий силикагель. В дальнейшем на каждой ступени хроматографии применяли только одну новую колонку.
Получение сырого продукта
4,1 кг сырого продукта чистотой 60,9 об.% загрузили в пару последовательно соединенных колонок, предварительно растворив его в 15 л толуола. Получили 19 л раствора, который подали на вершину первой колонки через фильтр со скоростью подачи 2,4 л/ч. После загрузки материал элюировали растворяющей смесью ацетона-толуола при их объемном соотношении в смеси 13:87 до тех пор, пока объем вытекающего потока на дне второй колонки составил 39 л. Содержание циклоспорина в вытекающем потоке анализировали TLC (тонкослойной хроматографией). В виде отхода собрали фракции, не содержащие циклоспорин. В качестве основной фракции приняли 28 л вытекающего потока после появления циклоспорина. Содержание сухого вещества в полученном этим способом промежуточном соединении I составило 3,23 кг.
4,1 кг сырого продукта чистотой 60,9 об.% загрузили в пару последовательно соединенных колонок, предварительно растворив его в 15 л толуола. Получили 19 л раствора, который подали на вершину первой колонки через фильтр со скоростью подачи 2,4 л/ч. После загрузки материал элюировали растворяющей смесью ацетона-толуола при их объемном соотношении в смеси 13:87 до тех пор, пока объем вытекающего потока на дне второй колонки составил 39 л. Содержание циклоспорина в вытекающем потоке анализировали TLC (тонкослойной хроматографией). В виде отхода собрали фракции, не содержащие циклоспорин. В качестве основной фракции приняли 28 л вытекающего потока после появления циклоспорина. Содержание сухого вещества в полученном этим способом промежуточном соединении I составило 3,23 кг.
Состав,об.%:
Циклоспорин А - 75
Циклоспорин В - 10,1
Циклоспорин С - 1,6
Циклоспорин L - 1,7
Циклоспорин U - 1,5
Циклоспорин D - 1,3
Выход в пересчете на циклоспорин А составил 97%.
Циклоспорин А - 75
Циклоспорин В - 10,1
Циклоспорин С - 1,6
Циклоспорин L - 1,7
Циклоспорин U - 1,5
Циклоспорин D - 1,3
Выход в пересчете на циклоспорин А составил 97%.
2-я Ступень
Разделение осуществили в снабженной кожухом 8 л колонке, имеющей длину 1 м. Колонка содержала силикагель Kieselgel 60 типа Мерка (0,015-0,040 мм). Масса набивочного материала составила 3,95 кг. Раствор промежуточного соединения 1 объемом около 3 л, содержащий 370 г сухого вещества, полученного на первой ступени, загрузили в колонку со скоростью подачи 2,4 л/ч, затем его промыли 1 л толуола.
Разделение осуществили в снабженной кожухом 8 л колонке, имеющей длину 1 м. Колонка содержала силикагель Kieselgel 60 типа Мерка (0,015-0,040 мм). Масса набивочного материала составила 3,95 кг. Раствор промежуточного соединения 1 объемом около 3 л, содержащий 370 г сухого вещества, полученного на первой ступени, загрузили в колонку со скоростью подачи 2,4 л/ч, затем его промыли 1 л толуола.
После загрузки материала колонку элюировали 10 л смеси ацетона и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 15:85 и затем 20 л раствора ацетона и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 25:75. Скорость потока растворителя до получения 17 л фракции составила 2,4 л/ч, затем начиная с 18 л фракции - 5 л/ч. Фракции анализировали TLC (тонкослойной хроматографией). 1-11 л фракции представляли собой отходы, 12-19 л фракции рассматривали как критические и из них взяли пробы. Посредством HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) анализировали профиль содержащихся в них примесей и ими манипулировали как предварительными фракциями или смешивали с основными фракциями. Таким способом можно получить предварительную фракцию, содержащую 80 г сухого вещества, которую затем выпарили до образования сухого остатка. 20-25 л фракции соединили в качестве основной фракции. 26-31 л фракции рассматривали как критические фракции и после анализа их соединили с основной фракцией или манипулировали ими как последующей фракцией.
Полученную вышеуказанным образом основную фракцию выпарили до сухого остатка в пленочном испарителе, снабженном вибрирующей мешалкой. Получили 234 г промежуточного соединения П с выходом 80%, имеющего следующее качество,об.%:
Циклоспорин А 95
Циклоспорин U 1,2
Циклоспорин L 0,7
Циклоспорин В < 0,1
Циклоспорин D 0,5
Циклоспорин С 0,1
3-я Ступень
Хроматографию осуществили в колонках с той же самой конструкцией и теми же самыми геометрическими размерами, которые были описаны для первой и второй ступеней. Из промежуточного соединения II, полученного на второй ступени, приготовили 1,7 л толуолового раствора, содержащего 220 г сухого вещества, и подали на вершину колонки со скоростью 2,4 л/ч, затем его промыли 1 л толуола.
Циклоспорин А 95
Циклоспорин U 1,2
Циклоспорин L 0,7
Циклоспорин В < 0,1
Циклоспорин D 0,5
Циклоспорин С 0,1
3-я Ступень
Хроматографию осуществили в колонках с той же самой конструкцией и теми же самыми геометрическими размерами, которые были описаны для первой и второй ступеней. Из промежуточного соединения II, полученного на второй ступени, приготовили 1,7 л толуолового раствора, содержащего 220 г сухого вещества, и подали на вершину колонки со скоростью 2,4 л/ч, затем его промыли 1 л толуола.
Колонку элюировали смесью 20 л ацетона и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 15:85, и затем циклоспорин элюировали смесью 20 л ацетона и толуола при соотношении компонентов в смеси 25:75. Скорость потока элюента до получения 31 л фракции составила 2,4 л/ч, затем начиная с 32 л фракции - 5 л/ч 1-18 л фракции представляли собой отходы, 19-23 л фракции представляли собой предварительные фракции и их рассматривали как критические фракции I. Для анализа содержания сухого вещества и профиля примесей высокоэффективной жидкостной хроматографией из них взяли пробы.
После анализа ими манипулировали как предварительными фракциями или смешивали с основными фракциями. 29-38 л фракции соединили в качестве основной фракции, 39-41 л фракции собрали в 1 л порции и рассматривали как критические фракции II. После анализа их соединили с основной фракцией или манипулировали как последующими фракциями II. После анализа их смешали с основной фракцией или манипулировали как последующей фракцией. В результате сбора фракций после выпаривания до сухого остатка можно получить 70 г предварительной фракции.
Основные фракции соединили и после выпаривания до сухого остатка получили 157 г чистого циклоспорина с выходом 75%. Качество продукта было следующим,об.%:
Циклоспорин А 99,6
Циклоспорин L < 0,05
Циклоспорин U < 0,05
Циклоспорин D < 0,05
Циклоспорин В < 0,02
Циклоспорин С < 0,02
Пример 2
Очистка сырого циклоспоринового продукта четырехступенчатой хроматографией в колонке с неподвижным слоем силикагеля с применением растворяющих смесей толуола-ацетона или толуола-этилацетата.
Циклоспорин А 99,6
Циклоспорин L < 0,05
Циклоспорин U < 0,05
Циклоспорин D < 0,05
Циклоспорин В < 0,02
Циклоспорин С < 0,02
Пример 2
Очистка сырого циклоспоринового продукта четырехступенчатой хроматографией в колонке с неподвижным слоем силикагеля с применением растворяющих смесей толуола-ацетона или толуола-этилацетата.
Сырой циклоспориновый продукт очистили трехступенчатой хроматографией, описанной в примере 1. Полученные трехступенчатой хроматографией предварительные фракции очистили на четвертой ступени в неподвижном слое растворяющей смесью толуола-этилацетата.
4-я ступень
Конструкция и геометрические размеры хроматографической колонки были такими же, которые описаны в примере 1. Колонка, которая описана в примере 1, содержала силикагель типа Kieselgel 60 Мерка (0,015-0,40 мм).
Конструкция и геометрические размеры хроматографической колонки были такими же, которые описаны в примере 1. Колонка, которая описана в примере 1, содержала силикагель типа Kieselgel 60 Мерка (0,015-0,40 мм).
Колонку обработали концентратом со скоростью подачи 2,4 л/ч, полученным из предварительной фракции в количестве 260 г материала, растворенного в 2,5 л толуола.
Содержание циклоспорина А 80,6 об.%.
Содержание циклоспорина D 4,2 об.%.
Подвергнутую обработке пробу промыли 1 л толуола, затем колонку элюировали смесью 20 л этилацетата и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 17: 83 со скоростью потока 2,4 л/ч, затем элюирование продолжили смесью 40 л этилацетата и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 28:72. 1-19 л фракции во время сбора фракций представляли собой отход. После анализа высокоэффективной жидкостной хроматографией 20-25 л фракции представляли собой отход или их смешивали с основной фракцией. 26-35 л фракции собрали в качестве основной фракции. После отбора проб и анализа HPLC 36-42 л фракции или соединяли с основной фракцией или манипулировали как отходом. Собранную 23-42 л основную фракцию выпарили до сухого остатка. Таким способом получили 195 г чистого циклоспорина А, содержащего 99,6 об.% активного ингредиента с выходом 75%, имеющего следующее качество,об.%:
Циклоспорин А 99,6
Циклоспорин D < 0,05
Циклоспорин U
Циклоспорин L
Пример 3
Очистка сырого циклоспоринового продукта двухступенчатой хроматографией в колонке с неподвижным слоем силикагеля с применением растворяющей смеси толуола-ацетона
Сырой циклоспориновый продукт очистили в соответствии с тем же самым способом, который описан на первой стадии примера 1, получив при этом промежуточное циклоспориновое соединение I, имеющее такое же качество. Далее способ осуществили следующим образом:
2-я Ступень
Колонку подвергли обработке 3 л промежуточного соединения I, содержащего 370 г высушенного материала, со скоростью подачи 2,4 л/ч, затем обработанную пробу промыли 1 л толуола.
Циклоспорин А 99,6
Циклоспорин D < 0,05
Циклоспорин U
Циклоспорин L
Пример 3
Очистка сырого циклоспоринового продукта двухступенчатой хроматографией в колонке с неподвижным слоем силикагеля с применением растворяющей смеси толуола-ацетона
Сырой циклоспориновый продукт очистили в соответствии с тем же самым способом, который описан на первой стадии примера 1, получив при этом промежуточное циклоспориновое соединение I, имеющее такое же качество. Далее способ осуществили следующим образом:
2-я Ступень
Колонку подвергли обработке 3 л промежуточного соединения I, содержащего 370 г высушенного материала, со скоростью подачи 2,4 л/ч, затем обработанную пробу промыли 1 л толуола.
После загрузки колонку элюировали 10 л смеси ацетона и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 15:85, затем элюирование продолжили 20 л смеси ацетона и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 25: 75. Скорость потока растворителя до получения 17 л составила 2,4 л/ч и начиная с 18 л - 5 л/ч.
В соответствии с тонкослойной хроматографией и высокоэффективной жидкостной хроматографией 1-11 л фракции представляли собой отходы, 12-20 л фракции представляли собой предварительные фракции, 21-24 л фракции рассматривали как основные фракции и фракциями от 25 л до конца манипулировали как последующими фракциями. Промытые ацетоном фракции представляли собой отходы.
После фракционирования собранные основные фракции соединили и выпарили до сухого остатка, получив при этом 114 г циклоспорина А с выходом 41% и с таким же высоким качеством продукта, которое описано в примере 1.
Пример 4
Сравнительный пример очистки сырого продукта трехступенчатой хроматографией с применением растворяющей смеси дихлорметана-ацетона
Качество исходного сырого циклоспоринового продукта (того же самого, который применяли в примере 1,об.%:
Содержание циклоспорина А 60,9
Содержание циклоспорина В 11,2
Содержание циклоспорина С 8,3
Содержание циклоспорина L 1,79
Содержание циклоспорина U 1,58
Содержание циклоспорина D 1,25
1-я Ступень
Хроматографическое оборудование и набивки колонки были такими же, которые описаны в примере 1. Одну пару соединенных последовательно колонок подвергли обработке 4,1 кг сырого продукта чистотой 60,9% в 15 л раствора дихлорметана.
Сравнительный пример очистки сырого продукта трехступенчатой хроматографией с применением растворяющей смеси дихлорметана-ацетона
Качество исходного сырого циклоспоринового продукта (того же самого, который применяли в примере 1,об.%:
Содержание циклоспорина А 60,9
Содержание циклоспорина В 11,2
Содержание циклоспорина С 8,3
Содержание циклоспорина L 1,79
Содержание циклоспорина U 1,58
Содержание циклоспорина D 1,25
1-я Ступень
Хроматографическое оборудование и набивки колонки были такими же, которые описаны в примере 1. Одну пару соединенных последовательно колонок подвергли обработке 4,1 кг сырого продукта чистотой 60,9% в 15 л раствора дихлорметана.
После загрузки пробы колонку элюировали дихлорметаном со скоростью потока 2,4 л/ч до сбора 35 л вытекающего потока.
1-10 л фракции представляли собой отходы, тогда как 11-35 л фракции рассматривали как основные фракции.
Содержание сухого вещества в промежуточном соединении 1, полученном этим способом, составило 2,9 кг, содержание активного ингредиента - 75 об.%.
2-я Ступень
Хроматографическое оборудование и набивка колонки были такими же, которые описаны в примере 1. Колонку подвергли обработке на вершине 3 л промежуточного соединения I, содержащего 350 г сухого вещества, со скоростью подачи 2,4 л/ч. Элюирование осуществили 10 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 1:9, затем элюирование продолжили 25 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 2:8 и закончили со скоростью 2,4 л/ч.
Хроматографическое оборудование и набивка колонки были такими же, которые описаны в примере 1. Колонку подвергли обработке на вершине 3 л промежуточного соединения I, содержащего 350 г сухого вещества, со скоростью подачи 2,4 л/ч. Элюирование осуществили 10 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 1:9, затем элюирование продолжили 25 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 2:8 и закончили со скоростью 2,4 л/ч.
В соответствии с тонкослойной хроматографией объем предварительной фракции составил 13 л, объем основной фракции - 22 л и объем последующей фракции - 11л. 22 л основной фракции выпарили до сухого остатка и вследствие этого получили 220 г промежуточного продукта II, имеющего чистоту 91%.
3-я Cтупень
Хроматографическое оборудование и набивка колонки были такими же, как в примере 1. При подаче в колонку дихлорметанового концентрата со скорость 2,4 л/час набивку нагрузили 220 г промежуточного соединения П. Элюирование осуществили 20 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 1:9, затем элюирование продолжили 30 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 2:8 и закончили ацетоном со скоростью его подачи 2,4 л/ч.
Хроматографическое оборудование и набивка колонки были такими же, как в примере 1. При подаче в колонку дихлорметанового концентрата со скорость 2,4 л/час набивку нагрузили 220 г промежуточного соединения П. Элюирование осуществили 20 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 1:9, затем элюирование продолжили 30 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 2:8 и закончили ацетоном со скоростью его подачи 2,4 л/ч.
Первые 26 л фракции рассматривали как предварительные фракции, затем собрали 26 л основной фракции и наконец 11 л последующих фракций. 26 л основной фракции выпарили до сухого остатка и вследствие этого получили 140 г промежуточного продукта III, имеющего следующее качество,об.%:
Циклоспорин А 98,6
Циклоспорин U 0,6
Циклоспорин D 0,3
Циклоспорин L 0,2
Циклоспорин В 0,1
Циклоспорин С 0,1с
Циклоспорин А 98,6
Циклоспорин U 0,6
Циклоспорин D 0,3
Циклоспорин L 0,2
Циклоспорин В 0,1
Циклоспорин С 0,1с
Claims (10)
1. Способ получения циклоспорина А высокой чистоты путем очистки сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс, хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси растворителей, включающей толуол, отличающийся тем, что используют многоступенчатую хроматографию при высокой загрузке колонны от 10 до 52%, элюирование осуществляют смесью толуола с ацетоном в количестве от 10 до 30 об. % или толуола с этилацетатом в количестве от 10 до 35 об. %.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что последовательно осуществляют 2-4 хроматографические ступени.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что последовательно осуществляют 3 хроматографические ступени.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве растворяющей смеси используют толуол-ацетон.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что используют толуол, содержащий не более 30% ацетона.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют растворяющую смесь толуола и этилацетата.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что используют толуол, содержащий не более 35 об. % этилацетата.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что градиентное элюирование применяют в случае, по меньшей мере, одной хроматографической ступени.
9. Циклоспорин А высокой чистоты, где содержание в нем циклоспорина L, циклоспорина U и циклоспорина D составляет менее 0,05 об. % и содержание в нем циклоспорина В и С составляет менее 0,02 об. %.
10. Способ промышленного масштаба для очистки циклоспорина А от сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс, хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси растворителей, включающей толуол, отличающийся тем, что используют многоступенчатую хроматографию при высокой загрузке колонны от 10 до 52%, элюирование осуществляют смесью толуола с ацетоном в количестве от 10 до 30 об. % или толуола с этилацетатом в количестве от 10 до 35 об. %.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU9700645A HU223054B1 (hu) | 1997-03-25 | 1997-03-25 | Tisztítási eljárás nagytisztaságú ciklosporin A előállítására |
HUP9700645 | 1997-03-25 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU98123499A RU98123499A (ru) | 2000-12-10 |
RU2182577C2 true RU2182577C2 (ru) | 2002-05-20 |
Family
ID=89994909
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU98123499/04A RU2182577C2 (ru) | 1997-03-25 | 1998-03-23 | Способ получения циклоспорина a высокой чистоты из сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0920447B1 (ru) |
JP (1) | JP2000511939A (ru) |
AT (1) | ATE223434T1 (ru) |
AU (1) | AU737260B2 (ru) |
BG (1) | BG64215B1 (ru) |
CA (1) | CA2255062C (ru) |
CZ (1) | CZ293687B6 (ru) |
DE (1) | DE69807635T2 (ru) |
DK (1) | DK0920447T3 (ru) |
ES (1) | ES2180159T3 (ru) |
HK (1) | HK1020740A1 (ru) |
HU (1) | HU223054B1 (ru) |
IL (1) | IL126871A0 (ru) |
NO (1) | NO322211B1 (ru) |
NZ (1) | NZ332718A (ru) |
PL (1) | PL194252B1 (ru) |
PT (1) | PT920447E (ru) |
RU (1) | RU2182577C2 (ru) |
SK (1) | SK283672B6 (ru) |
UA (1) | UA58511C2 (ru) |
WO (1) | WO1998042734A1 (ru) |
YU (1) | YU49468B (ru) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2151450A1 (de) * | 2008-07-29 | 2010-02-10 | Sandoz AG | Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden |
DE102009037551A1 (de) | 2009-08-17 | 2011-02-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Cyclosporinderivate |
HUP1500502A2 (en) | 2015-10-26 | 2017-04-28 | Rotachrom Tech Kft | Process for the purification of cyclosporin-a |
CN114653350A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-06-24 | 江苏九阳生物制药有限公司 | 一种环孢素a层析硅胶的再生方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HU213553B (en) * | 1992-05-25 | 1997-07-28 | Biogal Gyogyszergyar | Process for isolating of cyclosporin-a |
FI92334C (fi) * | 1992-12-30 | 1994-10-25 | Leiras Oy | Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta |
KR100304324B1 (ko) * | 1994-10-13 | 2001-11-22 | 김용규 | 사이클로스포린a의제조방법 |
-
1997
- 1997-03-25 HU HU9700645A patent/HU223054B1/hu not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-23 UA UA98116251A patent/UA58511C2/ru unknown
- 1998-03-23 WO PCT/HU1998/000029 patent/WO1998042734A1/en active IP Right Grant
- 1998-03-23 CA CA002255062A patent/CA2255062C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-23 PL PL98330142A patent/PL194252B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 DK DK98913969T patent/DK0920447T3/da active
- 1998-03-23 RU RU98123499/04A patent/RU2182577C2/ru active
- 1998-03-23 YU YU53598A patent/YU49468B/sh unknown
- 1998-03-23 AU AU68482/98A patent/AU737260B2/en not_active Ceased
- 1998-03-23 IL IL12687198A patent/IL126871A0/xx unknown
- 1998-03-23 NZ NZ332718A patent/NZ332718A/xx unknown
- 1998-03-23 PT PT98913969T patent/PT920447E/pt unknown
- 1998-03-23 CZ CZ19983814A patent/CZ293687B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 JP JP10545312A patent/JP2000511939A/ja not_active Ceased
- 1998-03-23 EP EP98913969A patent/EP0920447B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 ES ES98913969T patent/ES2180159T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 DE DE69807635T patent/DE69807635T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-23 AT AT98913969T patent/ATE223434T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 SK SK1618-98A patent/SK283672B6/sk unknown
- 1998-11-10 BG BG102911A patent/BG64215B1/bg unknown
- 1998-11-24 NO NO19985483A patent/NO322211B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-12-09 HK HK99105786A patent/HK1020740A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SK161898A3 (en) | 1999-05-07 |
ES2180159T3 (es) | 2003-02-01 |
DK0920447T3 (da) | 2002-12-16 |
EP0920447B1 (en) | 2002-09-04 |
SK283672B6 (sk) | 2003-11-04 |
IL126871A0 (en) | 1999-09-22 |
CZ381498A3 (cs) | 1999-02-17 |
ATE223434T1 (de) | 2002-09-15 |
WO1998042734A1 (en) | 1998-10-01 |
JP2000511939A (ja) | 2000-09-12 |
BG64215B1 (bg) | 2004-05-31 |
UA58511C2 (ru) | 2003-08-15 |
YU53598A (en) | 1999-11-22 |
HUP9700645A3 (en) | 2001-11-28 |
HUP9700645A2 (hu) | 1999-06-28 |
HU9700645D0 (en) | 1997-05-28 |
NO985483D0 (no) | 1998-11-24 |
HU223054B1 (hu) | 2004-03-01 |
DE69807635D1 (de) | 2002-10-10 |
AU737260B2 (en) | 2001-08-16 |
CA2255062C (en) | 2008-06-17 |
CA2255062A1 (en) | 1998-10-01 |
EP0920447A1 (en) | 1999-06-09 |
CZ293687B6 (cs) | 2004-07-14 |
DE69807635T2 (de) | 2003-08-07 |
NO322211B1 (no) | 2006-08-28 |
PL194252B1 (pl) | 2007-05-31 |
PT920447E (pt) | 2002-11-29 |
AU6848298A (en) | 1998-10-20 |
PL330142A1 (en) | 1999-04-26 |
BG102911A (en) | 1999-09-30 |
NO985483L (no) | 1998-11-24 |
YU49468B (sh) | 2006-05-25 |
HK1020740A1 (en) | 2000-05-19 |
NZ332718A (en) | 2000-04-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5709797A (en) | Method of isolating cyclosporins | |
EP0056782B1 (en) | Novel cyclosporins | |
HU213553B (en) | Process for isolating of cyclosporin-a | |
US6306306B1 (en) | Chromatographic process for obtaining highly purified cyclosporin A and related cyclosporins | |
RU2182577C2 (ru) | Способ получения циклоспорина a высокой чистоты из сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс | |
EP0801686B1 (en) | Process for preparing cyclosporin a | |
KR20060052874A (ko) | 마크로라이드의 정제 방법 | |
US6423233B1 (en) | Purification process | |
KR100496929B1 (ko) | 시클로스포린의정제방법 | |
CN1763084B (zh) | 高纯度环孢菌素a的制备方法 | |
CN101031654A (zh) | 结晶他克莫司的分离方法 | |
HRP980604A2 (en) | Purification process | |
RU2138509C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ РАСТЕНИЯ РОДА SERRATULA αЭКДИЗОНА, βЭКДИЗОНА И ИНОКОСТЕРОНА | |
KR100341355B1 (ko) | 사이클로스포린a의제조방법 | |
HU213934B (en) | Process for isolation of cyclosporin a | |
JPH0338280B2 (ru) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
PD4A | Correction of name of patent owner |