SK283672B6 - Purifikačný postup na prípravu vysoko čistého cyklosporínu A - Google Patents
Purifikačný postup na prípravu vysoko čistého cyklosporínu A Download PDFInfo
- Publication number
- SK283672B6 SK283672B6 SK1618-98A SK161898A SK283672B6 SK 283672 B6 SK283672 B6 SK 283672B6 SK 161898 A SK161898 A SK 161898A SK 283672 B6 SK283672 B6 SK 283672B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- cyclosporin
- liters
- toluene
- weight
- column
- Prior art date
Links
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 title claims abstract description 66
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 title claims abstract description 64
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 18
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 72
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims abstract description 36
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 30
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 37
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-[(1r)-1-hydroxyethyl]-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontan Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N 0.000 claims description 13
- JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin C Natural products CC=CCC(C)C(O)C1N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C(C(C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 108010019248 cyclosporin C Proteins 0.000 claims description 13
- XYKIUTSFQGXHOW-UHFFFAOYSA-N propan-2-one;toluene Chemical compound CC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 XYKIUTSFQGXHOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28,30-decamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20,23 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C)NC1=O UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N 0.000 claims description 11
- ZNVBEWJRWHNZMK-SYOLRUPNSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21,30-tri(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20,2 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC1=O ZNVBEWJRWHNZMK-SYOLRUPNSA-N 0.000 claims description 11
- 108010019594 cyclosporin D Proteins 0.000 claims description 11
- FWMBRFVXLUJFCT-WKHWYDSQSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-ethyl-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,25,28-octamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20 Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O FWMBRFVXLUJFCT-WKHWYDSQSA-N 0.000 claims description 10
- ZSNYYEIGOZADKA-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin L Natural products CCC1NC(=O)C(C(O)C(C)CC=CC)NC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O ZSNYYEIGOZADKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- FWMBRFVXLUJFCT-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin U Natural products CCC1NC(=O)C(C(O)C(C)CC=CC)N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O FWMBRFVXLUJFCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 8
- OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;toluene Chemical compound CCOC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 55
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 108010036941 Cyclosporins Proteins 0.000 description 13
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 7
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 7
- FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;propan-2-one Chemical compound ClCCl.CC(C)=O FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 5
- QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N intermediate I Chemical compound COC(=O)[C@@]1(C=O)[C@H]2CC=[N+](C\C2=C\C)CCc2c1[nH]c1ccccc21 QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000123975 Trichoderma polysporum Species 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 241000875119 Cylindrocarpon lucidum Species 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 description 1
- 241001149960 Tolypocladium inflatum Species 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- WYJQVXRGLXLWMZ-UHFFFAOYSA-N chloroform;dichloromethane;ethanol Chemical compound CCO.ClCCl.ClC(Cl)Cl WYJQVXRGLXLWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFKWBMYVKWXMCO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol;ethyl acetate Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl.CCOC(C)=O XFKWBMYVKWXMCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
- C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Silicon Compounds (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
Abstract
Postup chromatografického čistenia cyklosporínu A zo surového produktu, obsahujúceho cyklosporínovú zmes, s použitím kolóny naplnenej silikagélom a aplikáciou viacstupňovej chromatografickej metódy na kolóne plnenej normálnou silikagélovou fázou, v zmesi rozpúšťadiel obsahujúcej ako hlavnú zložku toluén. ŕ
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka postupu na chromatografické čistenie cyklosporínu A zo surového produktu, obsahujúceho zmes cyklosporínov, s použitím kolóny plnenej silikagélom a aplikáciou viacstupňovej chromatografie na kolóne plnenej normálnou silikagélovou fázou s použitím zmesi rozpúšťadiel, obsahujúcej ako hlavnú zložku toluén.
Doterajší stav techniky
Cyklosporíny sú cyklické undckapcptidy, ktoré sú na niekoľkých miestach N-metylované. Pri väčšine z nich bola potvrdená farmakologická účinnosť. Zatiaľ je známych 25 členov tejto skupiny, a sú označované písmenami A až Z. Ako prvý z nich sa získal z prírodného materiálu cyklosporín A, ktorý bol izolovaný z kultivačnej pôdy kmeňa Tolypocladium inflatum Gams (Helv. Chim. Acta 59, 1075 (1976)). Najskôr bola táto zlúčenina známa ako slabé fungicídne antibiotikum, neskôr ale upútala pozornosť pre svoj imunosupresívny účinok (J.F. Borel a kol.: Immunology 32, 1017 (1977)). Pre túto svoju vlastnosť sa používalo hlavne pri heterotransplantáciách (pľúc, srdca, ľadvín, kostnej drene alebo kože). Farmakologické štúdie ukázali, že táto zlúčenina inhibuje tak humorálne ako cclulárne imunitné odpovede tým, že zabraňuje proliferácii T-buniek a prerušuje syntézu interleukínu-2. Neskôr sa ukázalo, že zlúčenina je účinná aj pri rôznych typoch autoimúnnych a zápalových ochorení, ako sú autoimúnne hematologické ochorenia, ulcerózna kolitída, Gravesove ochorenie, roztrúsená skleróza, psoriáza a reumatická artritída. Uskutočnili sa tiež pokusy s liečbou infekcií spôsobených protozoami a s liečbou nádorov. Dôležitosť tejto skupiny zlúčenín ukazuje fakt, že je možné pripraviť veľa syntetických príbuzných zlúčenín vnesením rôznych aminokyselín a substituentov do molekuly (pozri napríklad patentové spisy EP 56782, CH 630062 a EP 29122).
Väčšina cyklosporínov sa pripravuje fermentáciou. Ako príklady použitých kultúr je možné uviesť mikroorganizmy Cylindrocarpon Lucidum Booth (patentový spis č. CH 589 716), Trichoderma polysporum Rifai (patentový spis č. CH 603 790) alebo Tolypocladium varium (patentový spis č. HU 201 577). Po skončení fermentácie sa získa cyklosporínová zmes, ktorá podľa charakteru procesu môže obsahovať rôzne nečistoty (prísady v kultivačnej pôde, odpeňovací prostriedok, mctabolity a podobne).
Obvykle sa produkt izoluje z fermentačnej zmesi extrakčnými procesmi. Môže sa to uskutočniť tak, že sa mycélium oddelí od fermentačného roztoku odstredením alebo filtráciou, potom sa aktívna zložka vylúhuje z mycélia metanolom alebo acetónom a filtrát sa extrahuje rozpúšťadlami, ktoré sa nemiešajú s vodou. Pri inom známom spôsobe sa neuskutoční filtrácia a celá fermentačná zmes sa extrahuje s vodou nemiešateľným organickým rozpúšťadlom a organický extrakt sa potom odparí vo vákuu. Pri extrakcii organickým rozpúšťadlom sa však do organickej fázy extrahujú aj zlúčeniny lipidového charakteru a pri ďalšom čistení spôsobujú ťažkosti. Na ich odstránenie boli vypracované niektoré postupy (napríklad švajčiarsky patentový spis č. 589 716 alebo vyložená nemecká patentová prihláška č. 2455859), pri ktorých po odstránení extrakčného rozpúšťadla sa odparok rozpustí vo vodnom metanole a potom sa niekoľkokrát extrahuje rovnakým objemom petroléteru. Petrolétcrické extrakty sa spoja a cyklosporíny sa z nich získajú vodným metanolom. Aktívna zložka sa potom viacnásobnou extrakciou spojenej vodno-metanolickej fázy prevedie do etylénchloridu, ktorý sa potom premyje vodou a odparí do sucha. Surový produkt, získaný uvedeným spôsobom, obsahuje cyklosporíny a môže sa účinnejšie čistiť jednou z nasledujúcich chromatografických metód.
Podľa postupu opísaného v americkom patentovom spise č.4 117 118 sa cyklosporínová zmes najskôr prenesie na kolónu Sephadexu LH-20 a eluuje sa metanolom. Potom sa chromatografúje na kolóne kysličníka hlinitého v zmesi toluénu a etylacetátu (15 %) a potom na kolóne silikagélu v zmesi chloroformu a etanolu (2 %). Napriek opakovanej chromatografíi nie je výsledný produkt čistý, aleje zmesou cyklosporínu A a B.
Podobný chromatografický postup je opísaný aj v americkom patentovom spise č. 4 215 199, kde sa hrubé čistenie uskutočňuje na kolóne silikagélu a ako eluent sa použije zmes chloroformu a metanolu (v objemovom pomere 98 : 2). Eluát sa potom odparí do sucha, odparok sa rozpustí v metanole a chromatografúje sa na kolóne Sephadexu LH-20 s metanolom ako eluentom. Eluované frakcie sa odparia do sucha a odparok sa rozpustí v zmesi chloroformu a metanolu (objemový pomer 98 : 2) a znova sa podrobí chromatografíi na silikagéli. Cyklosporín A sa eluuje ako prvý. Odparením príslušných ďalších frakcií sa získajú čisté zložky.
Podľa nemeckého patentového spisu č. DD 298276 sa olejovitý surový produkt rozpustí v malom množstve chloroformu a potom sa chromatografúje na kolóne kysličníka hlinitého s použitím chloroformu ako eluentu. Frakcie, obsahujúce cyklosporín A, sa odparia vo vákuu, rozpustia v chloroforme a chromatografújú sa na podobnej kolóne s chloroformom ako eluentom. Frakcie, ktoré obsahujú aktívnu látku, sa znova odparia vo vákuu. K odparku sa pridá hexán a cyklosporín A sa kryštalizuje. Produkt sa premyje hexánom, vysuší sa a nakoniec sa rekryštalizuje zo zmesi éteru a hexánu alebo acetónu.
Podľa maďarského patentového spisu č. 201577 sa surový produkt, získaný po odparení, môže prečistiť na kolóne silikagélu elúciou zmesí chloroformu a metanolu s postupne sa zvyšujúcou koncentráciou metanolu. Chromatografícký postup začína s čistým chloroformom a pokračuje zvyšovaním koncentrácie metanolu v eluente po 0,5 % (objemových) krokoch. Cyklosporín A sa eluuje chloroformom obsahujúcim 2 % objemové metanolu, cyklosporín B chloroformom obsahujúcim 2,5 % objemových metanolu a cyklosporín C chloroformom obsahujúcim 3 % objemové metanolu. Odparením príslušných frakcií sa získajú jednotlivé zložky.
Uvedené postupy opisujú hlavne fermentačné procedúry, vedúce k cyklosporínu, kde hlavným cieľom purifikačných krokov je identifikácia získaného produktu. Produkt je izolovaný len v malom množstve a sú uvedené iba fyzikálne a chemické charakteristiky bez toho, aby boli publikované údaje o čistote produktu a množstve nečistôt, ktoré obsahuje.
Rúeger a kol. (Helv. Chim. Acta 59(4), 1075 - 1092 (1976)) izolovali na identifikáciu a štruktúrnu analýzu malé množstvá čistého cyklosporínu A a C opakovanou chromatografiou a inými čistiacimi postupmi. Podľa publikácie surový produkt, získaný fermentáciou Trichoderma polysporum Rifai a obsahujúci hlavne cyklosporín A a C, sa zbaví tuku metanolom a petroléterom. Po odparení sa zvyšok rozpustí v chloroforme a chromatografúje sa gradientovou elúciou zmesou chloroformu a metanolu (v objemovom pomere 98,5 : 1,5). Čistý kryštalický cyklosporín A sa získa ďalšou chromatografiou. Frakcia, obsahujúca cyklosporín A, sa rozpustí v metanole a chromatografúje sa na kolóne Sephadexu LII-20 s použitím metanolu ako eluentu.
Hlavná frakcia sa odparí, odparok sa rozpustí v toluéne a chromatografuje na kysličníku hlinitom za elúcie s toluénom s rastúcou koncentráciou kyseliny octovej. Kryštalický produkt sa získa po odparení príslušných frakcií a prečistení aktívnym uhlím v alkoholickom roztoku.
Čistiaci postup, použiteľný v priemyselnom meradle, je opísaný v americkom patentovom spise č. 5382655. Podľa tohto postupu surový produkt, obsahujúci rôzne cyklosporínové zložky, sa podrobí tepelnému spracovaniu pred tým, ako sa chromatografuje na kolóne silikagélu v zmesiach chloroform-dichlórmetán-etanol a chloroform-etylacetát-etanol. Získaný produkt sa podrobí ďalšej chromatografii a rekryštalizácii, čím sa získa čistý produkt, použiteľný na prípravu injekčných foriem.
Čistenie surového produktu, obsahujúceho zmes cyklosporínov, je veľmi ťažké, pretože nečistoty majú podobné chemické štruktúry a majú veľmi podobné chromatografické charakteristiky ako hlavný produkt, cyklosporín A. Uvedené postupy potvrdzujú, že bez ohľadu na použitú zmes rozpúšťadiel dochádza k prekrývaniu chromatografických pásov a že na získanie žiadaných zložiek v čistom stave sú potrebné ďalšie chromatografické alebo iné purifikačné kroky. Doteraz známe čistiace postupy sa všeobecne vyznačujú nielen tým, že vyžadujú veľké množstvá rozpúšťadiel, ale tiež tým, že je potrebné použiť tri až štyri rôzne typy rozpúšťadiel alebo ich zmesí a dva až tri typy kolónových náplní. V dôsledku toho je na výrobu potrebné použiť niekoľko typov chromatografických techník a regeneračných metód, čo predstavuje ťažkosti pri vývoji jednoduchých, reprodukovane zvládnuteľných a ekonomických technológií v priemyselnom meradle.
Z ekologického hľadiska sú chlórované rozpúšťadlá nežiaduce a stále viac štátov sa snaží obmedziť ich použitie.
Čo sa týka materiálu na náplň kolón, použitie kysličníka hlinitého ako náplne na priemyselné použitie je veľmi problematické, pretože vďaka jeho malému špecifickému povrchu je záťaž a separačná schopnosť takýchto kolón veľmi malá. Ďalej kysličník hlinitý nie je vhodný na priemyselné využitie preto, že je tuhý a krehký, a preto si vyžaduje špeciálne zariadenie a technológiu, ktorá sa nemôže použiť v často vyprázdňovaných nerezových kolónach, ktoré sa zvyčajne používajú v chemickom priemysle.
Náplne typu Sephadexu sú veľmi nákladné a v prípade cyklosporínových zmesí je ich účinnosť veľmi obmedzená, pretože molekuly delených zlúčenín majú veľmi podobnú veľkosť.
Podstata vynálezu
Podstata predloženého vynálezu spočíva vo vývoji chromatografickej purifikačnej metódy, ktorá je ľahko použiteľná v priemyselnom meradle a pomocou ktorej je možné vyrábať cyklosporín A, obsahujúci oveľa menej nečistôt ako doteraz, čím sa dosiahne väčšia bezpečnosť pri použití v medicíne.
Cieľom bol vývoj takej chromatografickej purifikačnej technológie, ktorá by vyžadovala len jeden typ rozpúšťadlovej zmesi a jeden typ kolónovej náplne.
Ako kolónová náplň bol zvolený silikagél, a to kvôli svojim výhodným vlastnostiam, ako je veľký špecifický povrch, vysoká pórovitosť, priaznivá sorpčná schopnosť, ľahká manipulácia a relatívne nízka cena.
K náplni bolo potrebné nájsť ideálnu metódu a ideálnu zmes rozpúšťadiel, ktoré by boli vhodné na vysoko selektívnu separáciu cyklosporínových zložiek.
Pokusy ukázali, že tento cieľ môže byť realizovaný viacstupňovou chromatografiou na kolóne silikagélu a elúciou zmesí rozpúšťadiel, ktorých hlavnou zložkou je toluén. Zistilo sa, že aj cyklosporín U a L, ktoré sú najbližšie cyklosporínu A, môžu byť separované trojstupňovou chromatografiou na silikagélovej kolóne a elúciou toluénom, obsahujúcim acetón. Uvedené zložky sa odlišujú od cyklosporínu A iba metylovou skupinou.
Podľa prvého príkladu patentovej prihlášky č. WO 94/16091 sa tiež používa zmes toluénu a acetónu, ale v jednostupňovej chromatografii. Získaný produkt sa rekryštalizuje zo zmesi éteru a hexánu (výťažok 66,6 %). Optická rotácia produktu je síce dostatočná, ale teplota topenia je výrazne nižšia ako je uvedené v literatúre, čo naznačuje, že produkt nie je čistý, a žc teda dokonca aj rekryštalizáciou vznikne produkt s nízkou čistotou a s nízkym výťažkom.
Postup podľa predloženého vynálezu je vhodný na separáciu najbežnejších nečistôt ako cyklosporínu B a cyklosporínu C, ktoré sú najviac zastúpené, a navyše aj cyklosporínov D, U a L, ktoré sa vyskytujú v stopách. Obsah cyklosporínov B a C v konečnom produkte cyklosporínu A, získanom postupom podľa vynálezu, je menší ako 0,02 % hmotnostných, zatiaľ čo obsah cyklosporínov L, U a D je pod 0,05 % hmotnostných.
Predmet predloženého vynálezu je zlepšený postup na čistenie cyklosporínu A zo surového produktu, obsahujúceho zmes cyklosporínov, ktorý umožňuje výrobu extrémne čistého cyklosporínu A vo veľkom meradle, pomocou chromatografickej metódy na kolóne silikagélu, a to viacstupňovej chromatografie s použitím zmesi rozpúšťadiel, obsahujúcej ako hlavnú zložku toluén. Ďalšou novou črtou postupu podľa vynálezu je to, že sa používa extrémne vysoká záťaž kolóny. Pri bežných chromatografiách nie je množstvo násady na kolónu väčšie ako 5 - 10 % náplne kolóny, a na cyklosporíny je to ešte menej.
Viacstupňová chromatografia, zmes rozpúšťadiel s toluénom ako hlavnou zložkou a vysoká kolónová záťaž navzájom spolu súvisia a žiadaný vysoko čistý produkt je možné dosiahnuť iba ich kombináciou.
Pri postupe podľa vynálezu sa používajú výhodne 2 - 4 za sebou idúce chromatografické stupne, výhodne tri stupne.
Zaťaženie kolóny je najväčšie v prvom chromatografickom stupni, ale dobré oddelenie aktívnej zložky od nečistôt umožňuje zaťažiť kolónu aj v nasledujúcich dvoch stupňoch chromatografie.
Pri čistení podľa vynálezu je výhodne používať zmes toluénacetón, obsahujúcu najviac 30 % objemových acetónu.
Iné výhodné uskutočnenie postupu podľa vynálezu je použitie zmesi toluén-etylacetát, v ktorej je koncentrácia etylacetátu nižšia ako 35 % objemových.
Pri čistení postupom podľa vynálezu je výhodné aspoň raz použiť gradientovú elúciu.
Pokusy ukázali, že na čistenie cyklosporínovej zmesi podľa vynálezu je výhodné použiť 10-30 % objemových, výhodnejšie 13 - 18 % objemových acetónu, a 10 - 35 % objemových alebo 15-20 % objemových etylacetátu.
Podľa iného uskutočnenia podľa vynálezu sa v prípade trojstupňovej chromatografie uskutočňuje elúcia toluénom obsahujúcim 15 % objemových acetónu alebo 18 % objemových etylacetátu. V prvom stupni sa oddelí hlavný podiel cyklosporínu C, v druhom stupni sa odstráni väčšia časť cyklosporínov B, L a U, a nakoniec v treťom stupni sa obsah cyklosporínov L a U a iných neidentifikovaných nečistôt môže znížiť pod 0,05 % hmotnostných. Zatiaľ čo strata cyklosporínu A v prvom stupni je minimálna, v pr3 vých frakciách druhej a tretej chromatografie sa odstráni značné množstvo cyklosporínu A spolu s cyklosporínom D, ktorý mu je veľmi podobný. Tento podiel cyklosporínu A sa môže získať naspäť vo veľmi čistej forme v štvrtom stupni.
Na porovnanie je v nasledujúcej tabuľke uvedený obsah nečistôt v cyklosporíne A podľa USP štandardu, obsah nečistôt v injekčnom liekovom prostriedku SANDIMMUNR a obsah nečistôt v cyklosporíne A, ktorý bol pripravený postupom podľa vynálezu.
gel, veľkosť častíc 0,04 - 0,063 mm). V prvej chromatografii obsahujú obidve kolóny nový silikagél, v ďalšej chromatografii sa prvá kolóna odpojí a pripojí sa k nej druhá kolóna, obsahujúca čerstvú silikagélovú náplň. V každej ďalšej chromatografíi sa použije len jedna nová kolóna.
| Nečistota | USP štandard | sanľimmunr | Príklad 1 |
| Cyklosporín C | 0,17 | 0, 05 | |
| Cyklosporín B | - | 0,21 | 0,05 |
| Ne identifikované | |||
| zlúčeniny | 0,09 | 0,35 | 0,05 |
| Cľyklosporín L | 0,05 | 0,35 | 0,05 |
| Cyklosporín U | - | - | 0,05 |
| Cyklosporín D | 0,12 | - | 0,05 |
Príprava surového produktu
4,1 kg surového produktu s čistotou 60,9 % hmotnostných sa rozpustí v 15 litroch toluénu. Získa sa tak 19 litrov roztoku, ktorý sa privádza na vrch prvej kolóny cez filter, rýchlosťou 2,4 litrov/hod. Po nanesení sa materiál eluuje zmesou acetón-toluén v objemovom pomere 13 : 87, až objem eluátu z druhej kolóny predstavuje 39 litrov. Obsah cyklosporínu v eluente je analyzovaný chromatografiou na tenkej vrstve (TLC). Frakcie, ktoré neobsahujú cyklosporín, sa odoberajú ako odpad. Po zistení cyklosporínu v eluáte sa odoberá 28 litrov eluátu ako hlavná frakcia. Takto získaný medziprodukt I obsahuje 3,23 kg sušiny.
Z uvedených údajov je vidieť, že kvalita cyklosporínu A získaného podľa predloženého vynálezu podstatne prevyšuje parametre injekčného preparátu SANDIMMUN* a prevyšuje dokonca aj požiadavky USP.
Postup podľa vynálezu sa môže aplikovať na čistenie surového produktu v malej aj vo veľkej miere.
Okrem toho, že postup podľa vynálezu poskytuje čistý cyklosporín A, má aj nezanedbateľné technologické prednosti. Pretože sa používa iba jeden typ technologickej metódy (chromatografie), je čistiaci proces jednotne uskutočniteľný, navyše je ho možné opakovať a môže byť prevedený na kontinuálny proces. Ďalej je postup podľa vynálezu špeciálne výhodný v tom, že sa vo všetkých troch chromatografických stupňoch používa iba jeden typ zmesi rozpúšťadiel, a preto je regenerácia kolónových náplní aj rozpúšťadiel jednoduchšia.
Ďalšiu výhodu má postup v tom, že v prvom chromatografickom kroku zostanú na kolóne zlúčeniny so silnou afinitou k náplni, čo veľmi uľahčí regeneráciu kolónových náplní v ďalších dvoch stupňoch.
Vynález je ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi bez toho, aby sa nimi akokoľvek obmedzoval jeho rozsah.
Porovnávací príklad (príklad 4) ukazuje, že pri použití zmesi dichlórmetán-acetón, ktorá bola doteraz bežne používaná ako eluent v známych postupoch, ani trojstupňová chromatografia neposkytla produkt s kvalitou porovnateľnou s kvalitou konečného produktu, získaného postupom podľa vynálezu.
Zloženie je nasledujúce:
Cyklosporín A Cyklosporín B Cyklosporín C Cyklosporín L Cyklosporín U Cyklosporín D % hmotnostných 10,1 % hmotnostných
1.6 % hmotnostných
1.7 % hmotnostných
1,5 % hmotnostných
1,3 % hmotnostných
Výťažok počítaný na cyklosporín A je 97 %.
Stupeň 2
Separácia sa uskutočňuje na 1 meter dlhej osemlitrovej kolóne s plášťom, ktorá obsahuje 3,95 kg silikagélu (Merck Kieselgel 60; 0,015-0,040 mm).
Asi 3 litre roztoku medziproduktu I, získaného v prvom stupni a obsahujúceho 370 g sušiny, sa aplikujú na kolónu rýchlosťou 2,4 litrov/hod. a potom sa premyjú 1 litrom toluénu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Čistenie surového cyklosporínového produktu trojstupňovou chromatografiou s použitím zmesi toluén-acetón ako eluentu
Po aplikácii na kolónu sa materiál eluuje 10 litrami zmesi acetón-toluén (v objemovom pomere 15 : 85) a potom 20 litrami zmesi acetón-toluén (v objemovom pomere 25 : 75). Do objemu 17 litrov eluátu je prietok eluentu 2,4 litrov/hod. a po 18 litroch sa zvýši na 5 litrov/hod.. Jednotlivé frakcie sa analyzujú TLC. Frakcie od 1 až do 11 litrov sú odpad, frakcie 12-19 litrov sú považované za kritické a sú z nich odobrané vzorky, ktoré sa analyzujú HPLC. Podľa analýzy sa považujú za prvé frakcie alebo sa spoja s hlavnými frakciami. Po odparení prvej frakcie sa získa 80 g suchého materiálu. Frakcie 20 - 25 litrov sa spoja ako hlavné frakcie. Frakcie 26-31 litrov sa považujú znova za kritické a po analýze sa buď spoja s hlavnou frakciou, alebo sa považujú za posledné frakcie.
Hlavná frakcia, ktorá sa takto získa, sa odparí do sucha vo filmovej odparke spojenej s vibračným miešadlom. Získa sa tak 234 g (80 %) medziproduktu II s nasledujúcim zložením:
Zloženie východiskovej surovej cyklosporínovej zmesi:
Cyklosporín A
Cyklosporín B
Cyklosporín C
Cyklosporín L
Cyklosporín U
Cyklosporín D
60,9 % hmotnostných 11,2 % hmotnostných 8,3 % hmotnostných 1,79 % hmotnostných 1,58 % hmotnostných 1,25 % hmotnostných
Cyklosporín A Cyklosporín U Cyklosporín L Cyklosporín B Cyklosporín D Cyklosporín C % hmotnostných
1,2 % hmotnostných
0,7 % hmotnostných <0,1 % hmotnostných
0,5 % hmotnostných 0,1 % hmotnostných
Stupeň 1
Chromatografia sa uskutočňuje na dvoch chromatografických kolónach s plášťom, zapojených v sérii. Každá z nich má obsah 8 litrov, priemer 10 cm a dĺžku 100 cm. Každá kolóna obsahuje 3,95 kg silikagélu (Merck KieselStupeň 3
Chromatografia sa uskutoční na kolónach rovnakej konštrukcie a geometrických parametrov ako sú opísané v prvom a druhom stupni.
Z medziproduktu II, získaného v stupni 2, sa pripraví 1,7 litra toluénového roztoku, obsahujúceho 220 g suchého
SK 283672 Β6 materiálu, a tento roztok sa uvádza na vrch kolóny rýchlosťou 2,4 litrov/hod. Potom sa premyje 1 litrom toluénu.
Kolóna sa eluujc 20 litrami zmesi acetón-toluén v objemovom pomere 15 : 85 a potom 20 litrami zmesi acetón-toluén v objemovom pomere 25 : 75. Do 31 litrov eluátu je prietok 2,4 litrov/hod. a od 32 litrov sa zvýši na 5 litrov/hod.. Prvých 18 litrov je odpad, frakcie 19 - 23 litrov sú prvé kritické frakcie I. Vzorky frakcií sa analyzujú HPLC na obsah sušiny a nečistôt a podľa výsledku analýzy sa považujú za prvú frakciu alebo sa spoja s hlavnou frakciou. Frakcie 29 - 38 litrov sa spoja ako hlavná frakcia. Frakcie 39 - 41 litrov sa odoberajú po litrových porciách a sú považované za kritické frakcie II. Podľa výsledkov analýzy sa buď spoja s hlavnou frakciou, alebo sa považujú za poslednú frakciu.
Po odparení do sucha sa získa celkom 70 g prvej frakcie.
Spojená hlavná frakcia po odparení do sucha poskytne
157 g čistého cyklosporínu vo výťažku 75 %. Zloženie produktu je nasledujúce.
Cyklosporín A Cyklosporín L Cyklosporín U Cyklosporín D Cyklosporín B Cyklosporín C
99,6 % hmotnostných <0,05 % hmotnostných <0,05 % hmotnostných <0,05 % hmotnostných <0,02 % hmotnostných <0,02 % hmotnostných
Príklad 2
Chromatografické čistenie surového cyklosporínového produktu v štyroch stupňoch na kolóne silikagélu s pevným dnom s použitím zmesí toluén-acetón alebo toluén-etylacetát
Surový cyklosporínový produkt sa prečistí trojstupňovou chromatografiou, ako je opísané v príklade 1. Prvé frakcie, získané v troch chromatografíckých stupňoch, sa prečistia v štvrtom stupni s použitím zmesi toluén-etylacetát.
Stupeň 4
Konštrukcia a geometrické parametre chromatografickej kolóny sú rovnaké ako je opísané v príklade 1. Kolóna je naplnená silikagélom Merck Kieselgel 60 (0,015 - 0,040), ako je opísané v príklade 1.
260 g koncentrátu získaného z prvých frakcií sa rozpustí v 2,5 litra toluénu a roztok sa nanesie na kolónu rýchlosťou 2,4 litrov/hod.. Koncentrát obsahuje 80,6 % hmotnostných cyklosporínu A a 4,2 % hmotnostných cyklosporínu D. Po premytí 1 litrom toluénu sa kolóna eluuje 20 litrami zmesi etylacetát-toluén (v objemovom pomere 17 : 83) rýchlosťou 2,4 litrov/hod. a potom 40 litrami zmesi etylacetát-toluén (v objemovom pomere 28 : 72).
Frakcie 1 až 19 litrov sú odpad. Frakcie 20 - 25 litrov sa podľa výsledku HPLC analýzy považujú buď za odpad, alebo sa spoja s hlavnou frakciou. Frakcie 26 - 35 litrov sa odoberajú ako hlavné frakcie. Frakcie 36 - 42 litrov sa podľa výsledkov HPLC analýzy buď spoja s hlavnou frakciou, alebo sa považujú za odpad. Hlavné frakcie (frakcie 23 - 42 litrov) sa odparia do sucha, čím sa získa 195 g (výťažok 75 %) cyklosporínu A s čistotou 99,6 % hmotnostných nasledujúceho zloženia:
Cyklosporín A 99,6 % hmotnostných
Cyklosporín D <0,05 % hmotnostných
Cyklosporín U
Cyklosporín L
Príklad 3
Chromatografické čistenie surového cyklosporínového produktu v dvoch stupňoch na kolóne silikagélu s pevným dnom s použitím zmesi toluén-acetón
Cyklosporínový surový produkt sa prečistí ako je opísané v stupni 1 v príklade L Získa sa cyklosporínový medziprodukt 1 rovnakej kvality, aká je uvedená v príklade L Ďalej sa postupuje nasledovne.
Stupeň 2
Na kolónu sa aplikujú 3 litre roztoku medziproduktu I, obsahujúceho 370 g suchého materiálu, a to rýchlosťou 2,4 litrov/hod.. Potom sa vzorka premyje jedným litrom toluénu.
Kolóna sa eluuje 10 litrami zmesi acetón-toluén (v objemovom pomere 15 : 85) a potom 20 litrami zmesi acetón-toluén (v objemovom pomere 25 : 75). Do 17 litrov eluátu je prietok 2,4 litrov/hod., od 18 litrov je prietok 5 litrov/hod..
Podľa TLC a HPLC analýzy sú frakcie 1-11 litrov odpad, frakcie 12 - 20 litrov sú prvé frakcie, frakcie 21 - 24 litrov sú hlavné frakcie a frakcie od 25 vyššie sú posledné frakcie. Frakcie vymyté acetónom sú odpad.
Hlavné frakcie sa spoja a odparia do sucha, čím sa získa 114 g cyklosporínu A vo výťažku 41 % a v tej istej vysokej kvalite, aká je uvedená v príklade 1.
Príklad 4
Porovnávací príklad čistenia surového produktu trojstupňovou chromatografiou s použitím zmesi dichlórmetán-acetón
Zloženie východiskového surového cyklosporínového produktu je nasledujúce (rovnaké ako v príklade 1): Cyklosporín A Cyklosporín B Cyklosporín C Cyklosporín L Cyklosporín U Cyklosporín D
60,9 % hmotnostných 11,2 % hmotnostných 8,3 % hmotnostných 1,79 % hmotnostných 1,58 % hmotnostných 1,25 % hmotnostných
Stupeň 1
Chromatografické vybavenie a náplň sú rovnaké ako v príklade L Na jeden pár kolón, zapojených v sérii, sa aplikuje 4,1 kg surového produktu s čistotou 60,9 % v 15 litroch dichlórmetánu.
Po aplikácii sa kolóna eluuje dichlórmetánom rýchlosťou 2,4 litrov/hod. a odoberá sa 35 litrov eluátu.
Frakcie 1 - 10 litrov sú odpad, frakcie 11-35 litrov sa považujú za hlavné frakcie. Takto získaný medziprodukt I obsahuje 2,9 kg sušiny a 75 % hmotnostných aktívnej zložky·
Stupeň 2
Chromatografické vybavenie a náplň sú také isté ako v príklade L
Na vrch kolóny sa aplikujú 3 litre medziproduktu I, obsahujúceho 350 g sušiny, rýchlosťou 2,4 litrov/hod.. Elúcia sa uskutočňuje 10 litrami zmesi acetón-dichlórmetán (v objemovom pomere 1 : 9), potom 25 litrami zmesi acetón-dichlórmetán (v objemovom pomere 2 : 8), a nakoniec acelónom. Prietok je 2,4 litrov/hod..
Podľa HPLC analýzy je objem prvej frakcie 13 litrov, objem hlavnej frakcie 22 litrov a objem poslednej frakcie 11 litrov. Hlavné frakcie (22 litrov) sa odparia do sucha, čím sa získa 220 g medziproduktu II s čistotou 91 %.
Stupeň 3
Chromatografické vybavenie a náplň sú také isté ako je opísané v príklade 1.
Na kolónu sa aplikuje dichlórmetánový koncentrát 220 g medziproduktu II rýchlosťou 2,4 litrov/hod.. Elúcia sa uskutočňuje rýchlosťou 2,4 litrov/hod., a to 20 litrami zmesi acetón-dichlórmetán (v objemovom pomere 1 : 9), potom 30 litrami zmesi acetón-dichlórmetán (v objemovom pomere 2 : 8) a nakoniec acetónom.
Prvých 26 litrov eluátu sa považuje za prvé frakcie, ďalších 26 litrov za hlavnú frakciu a nakoniec 11 litrov za posledné frakcie.
Hlavná frakcia (26 litrov) sa odparí do sucha, čím sa získa 140 g medziproduktu III, ktorý' má nasledujúce zloženie:
zmes, použitá ako východiskový materiál chromatografie, sa pred chromatografiou zohreje na 80 až 120 °C.
12. Ktorýkoľvek z postupov podľa nároku 1 alebo 10, vyznačujúci sa tým, že sa použije toluén s obsahom 10 až 30 % acetónu.
13. Ktorýkoľvek z postupov podľa nároku 1 alebo 10, vyznačujúci sa tým, že sa použije toluén s obsahom 10 až 35 % objemových etylacetátu.
Koniec dokumentu
Cyklosporín A Cyklosporín U Cyklosporín D Cyklosporín L Cyklosporín B Cyklosporín C
98,6 % hmotnostných
0,6 % hmotnostných
0,3 % hmotnostných
0,2 % hmotnostných
0,1 % hmotnostných
0,1 % hmotnostných
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Purifikačný postup na prípravu vysoko čistého cyklosporínu A zo surového produktu, obsahujúceho cyklosporínovú zmes, pomocou chromatografickej metódy na silikagélovej kolóne, vyznačujúci sa tým, že sa použije viac stupňová chromatografia v zmesi rozpúšťadiel, obsahujúcej ako hlavnú zložku toluén.
- 2. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa uskutočnia 2 až 4 následné chromatografické stupne.
- 3. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa uskutočnia 3 následné chromatografické stupne.
- 4. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa ako zmes rozpúšťadiel použije zmes toluén-acetón.
- 5. Postup podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m , že sa použije toluén, obsahujúci najviac 30 % acetónu.
- 6. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa ako zmes rozpúšťadiel použije zmes toluén-etylacetát.
- 7. Postup podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že sa použije toluén, obsahujúci najviac 35 % objemových etylacetátu.
- 8. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa najmenej v jednom chromatografickom stupni použije gradientová elúcia.
- 9. Vysoko čistý cyklosporín A, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje menej ako 0,05 % hmotnostných cyklosporínu L, cyklosporínu U a cyklosporínu D a menej ako 0,02 % hmotnostných cyklosporínu B a cyklosporínuC.
- 10. Postup v priemyselnom meradle na čistenie cyklosporínu A z cyklosporínovej zmesi, obsahujúcej surový produkt, s použitím chromatografickej metódy na silikagélovej kolóne, vyznačujúci sa tým, že sa použije viacstupňová chromatografia na kolóne s normálnou fázou silikagélu v zmesi rozpúšťadiel, obsahujúca ako hlavnú zložku toluén.
- 11. Ktorýkoľvek z postupov podľa nároku 1 alebo 10, vyznačujúci sa tým, že cyklosporínová
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9700645A HU223054B1 (hu) | 1997-03-25 | 1997-03-25 | Tisztítási eljárás nagytisztaságú ciklosporin A előállítására |
| PCT/HU1998/000029 WO1998042734A1 (en) | 1997-03-25 | 1998-03-23 | Process of purification of cyclosporin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK161898A3 SK161898A3 (en) | 1999-05-07 |
| SK283672B6 true SK283672B6 (sk) | 2003-11-04 |
Family
ID=89994909
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1618-98A SK283672B6 (sk) | 1997-03-25 | 1998-03-23 | Purifikačný postup na prípravu vysoko čistého cyklosporínu A |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0920447B1 (sk) |
| JP (1) | JP2000511939A (sk) |
| AT (1) | ATE223434T1 (sk) |
| AU (1) | AU737260B2 (sk) |
| BG (1) | BG64215B1 (sk) |
| CA (1) | CA2255062C (sk) |
| CZ (1) | CZ293687B6 (sk) |
| DE (1) | DE69807635T2 (sk) |
| DK (1) | DK0920447T3 (sk) |
| ES (1) | ES2180159T3 (sk) |
| HK (1) | HK1020740A1 (sk) |
| HU (1) | HU223054B1 (sk) |
| IL (1) | IL126871A0 (sk) |
| NO (1) | NO322211B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ332718A (sk) |
| PL (1) | PL194252B1 (sk) |
| PT (1) | PT920447E (sk) |
| RU (1) | RU2182577C2 (sk) |
| SK (1) | SK283672B6 (sk) |
| UA (1) | UA58511C2 (sk) |
| WO (1) | WO1998042734A1 (sk) |
| YU (1) | YU49468B (sk) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2151450A1 (de) * | 2008-07-29 | 2010-02-10 | Sandoz AG | Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden |
| DE102009037551A1 (de) * | 2009-08-17 | 2011-02-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Cyclosporinderivate |
| HUP1500502A2 (en) * | 2015-10-26 | 2017-04-28 | Rotachrom Tech Kft | Process for the purification of cyclosporin-a |
| CN114653350A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-06-24 | 江苏九阳生物制药有限公司 | 一种环孢素a层析硅胶的再生方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU213553B (en) * | 1992-05-25 | 1997-07-28 | Biogal Gyogyszergyar | Process for isolating of cyclosporin-a |
| FI92334C (fi) * | 1992-12-30 | 1994-10-25 | Leiras Oy | Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta |
| KR100304324B1 (ko) * | 1994-10-13 | 2001-11-22 | 김용규 | 사이클로스포린a의제조방법 |
-
1997
- 1997-03-25 HU HU9700645A patent/HU223054B1/hu not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-23 PL PL98330142A patent/PL194252B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 YU YU53598A patent/YU49468B/sh unknown
- 1998-03-23 DE DE69807635T patent/DE69807635T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-23 CZ CZ19983814A patent/CZ293687B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 EP EP98913969A patent/EP0920447B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 ES ES98913969T patent/ES2180159T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 WO PCT/HU1998/000029 patent/WO1998042734A1/en active IP Right Grant
- 1998-03-23 AU AU68482/98A patent/AU737260B2/en not_active Ceased
- 1998-03-23 CA CA002255062A patent/CA2255062C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-23 SK SK1618-98A patent/SK283672B6/sk unknown
- 1998-03-23 AT AT98913969T patent/ATE223434T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 JP JP10545312A patent/JP2000511939A/ja not_active Ceased
- 1998-03-23 DK DK98913969T patent/DK0920447T3/da active
- 1998-03-23 NZ NZ332718A patent/NZ332718A/xx unknown
- 1998-03-23 PT PT98913969T patent/PT920447E/pt unknown
- 1998-03-23 UA UA98116251A patent/UA58511C2/uk unknown
- 1998-03-23 RU RU98123499/04A patent/RU2182577C2/ru active
- 1998-03-23 IL IL12687198A patent/IL126871A0/xx unknown
- 1998-11-10 BG BG102911A patent/BG64215B1/bg unknown
- 1998-11-24 NO NO19985483A patent/NO322211B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-12-09 HK HK99105786A patent/HK1020740A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU737260B2 (en) | 2001-08-16 |
| ATE223434T1 (de) | 2002-09-15 |
| IL126871A0 (en) | 1999-09-22 |
| EP0920447B1 (en) | 2002-09-04 |
| AU6848298A (en) | 1998-10-20 |
| YU49468B (sh) | 2006-05-25 |
| NO985483L (no) | 1998-11-24 |
| CZ381498A3 (cs) | 1999-02-17 |
| NO322211B1 (no) | 2006-08-28 |
| PL194252B1 (pl) | 2007-05-31 |
| WO1998042734A1 (en) | 1998-10-01 |
| JP2000511939A (ja) | 2000-09-12 |
| CZ293687B6 (cs) | 2004-07-14 |
| UA58511C2 (uk) | 2003-08-15 |
| PL330142A1 (en) | 1999-04-26 |
| YU53598A (en) | 1999-11-22 |
| DE69807635T2 (de) | 2003-08-07 |
| SK161898A3 (en) | 1999-05-07 |
| BG102911A (en) | 1999-09-30 |
| DK0920447T3 (da) | 2002-12-16 |
| NO985483D0 (no) | 1998-11-24 |
| DE69807635D1 (de) | 2002-10-10 |
| CA2255062A1 (en) | 1998-10-01 |
| EP0920447A1 (en) | 1999-06-09 |
| BG64215B1 (bg) | 2004-05-31 |
| HUP9700645A3 (en) | 2001-11-28 |
| RU2182577C2 (ru) | 2002-05-20 |
| NZ332718A (en) | 2000-04-28 |
| HUP9700645A2 (hu) | 1999-06-28 |
| HU9700645D0 (en) | 1997-05-28 |
| CA2255062C (en) | 2008-06-17 |
| ES2180159T3 (es) | 2003-02-01 |
| HU223054B1 (hu) | 2004-03-01 |
| HK1020740A1 (en) | 2000-05-19 |
| PT920447E (pt) | 2002-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2257271C (en) | Method of isolating cyclosporins | |
| EP2623611B1 (en) | Method for purifying cyclic lipopeptide or salt thereof | |
| EP0056782A1 (en) | Novel cyclosporins | |
| US5382655A (en) | Process for the purification of cyclosporin A | |
| US6306306B1 (en) | Chromatographic process for obtaining highly purified cyclosporin A and related cyclosporins | |
| JP2013516406A (ja) | 高純度無水結晶形ドセタキセルの製造方法 | |
| SK283672B6 (sk) | Purifikačný postup na prípravu vysoko čistého cyklosporínu A | |
| KR100304324B1 (ko) | 사이클로스포린a의제조방법 | |
| US6706192B2 (en) | Purification process | |
| KR100496929B1 (ko) | 시클로스포린의정제방법 | |
| US8691770B2 (en) | Method for processing microbiologically produced cyclic oligopeptides | |
| HRP980604A2 (en) | Purification process | |
| CN117106830A (zh) | 一种Asperparaline A的生物合成及提纯的方法 | |
| KR100341355B1 (ko) | 사이클로스포린a의제조방법 | |
| HU213934B (en) | Process for isolation of cyclosporin a |