UA58511C2 - Способи очищення циклоспорину а та циклоспорин а високої чистоти - Google Patents
Способи очищення циклоспорину а та циклоспорин а високої чистоти Download PDFInfo
- Publication number
- UA58511C2 UA58511C2 UA98116251A UA98116251A UA58511C2 UA 58511 C2 UA58511 C2 UA 58511C2 UA 98116251 A UA98116251 A UA 98116251A UA 98116251 A UA98116251 A UA 98116251A UA 58511 C2 UA58511 C2 UA 58511C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- cyclosporine
- toluene
- chromatography
- differs
- cyclosporin
- Prior art date
Links
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 title claims abstract description 95
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 title claims abstract description 94
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 title claims abstract description 79
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 title claims description 65
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 12
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 105
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 42
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 22
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims abstract description 12
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 41
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 29
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 28
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-[(1r)-1-hydroxyethyl]-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontan Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-QRVTZXGZSA-N 0.000 claims description 5
- JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin C Natural products CC=CCC(C)C(O)C1N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C(C(C)O)NC1=O JTOKYIBTLUQVQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108010019248 cyclosporin C Proteins 0.000 claims description 5
- OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;toluene Chemical compound CCOC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- XYKIUTSFQGXHOW-UHFFFAOYSA-N propan-2-one;toluene Chemical compound CC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 XYKIUTSFQGXHOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010019251 cyclosporin H Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 2
- PMATZTZNYRCHOR-JLPRAAIDSA-N (3r,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-ethyl-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17 Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-JLPRAAIDSA-N 0.000 claims 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108010036941 Cyclosporins Proteins 0.000 description 14
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 9
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 7
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 6
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 6
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28,30-decamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20,23 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C)NC1=O UCOQITKXMNKTKF-MXGZYYNMSA-N 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- ZMKGDQSIRSGUDJ-VSROPUKISA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-30-propyl-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,1 Chemical compound CCC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O ZMKGDQSIRSGUDJ-VSROPUKISA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UYPPEWHLQQUDPM-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin I Natural products CC=CCC(C)C(O)C1N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C(C(C)C)NC1=O UYPPEWHLQQUDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLGBWFHSHJPDQX-UHFFFAOYSA-N Cyclosporin O Natural products CCCC1NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O NLGBWFHSHJPDQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMKGDQSIRSGUDJ-UHFFFAOYSA-N NVa2 cyclosporine Natural products CCCC1NC(=O)C(C(O)C(C)CC=CC)N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O ZMKGDQSIRSGUDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 108010019249 cyclosporin G Proteins 0.000 description 3
- 108010017923 cyclosporin O Proteins 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;propan-2-one Chemical compound ClCCl.CC(C)=O FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- GRTOGORTSDXSFK-XJTZBENFSA-N ajmalicine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN3C[C@@H]4[C@H](C)OC=C([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 GRTOGORTSDXSFK-XJTZBENFSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- WYJQVXRGLXLWMZ-UHFFFAOYSA-N chloroform;dichloromethane;ethanol Chemical compound CCO.ClCCl.ClC(Cl)Cl WYJQVXRGLXLWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFKWBMYVKWXMCO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol;ethyl acetate Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl.CCOC(C)=O XFKWBMYVKWXMCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011437 continuous method Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- -1 cyclosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N intermediate I Chemical compound COC(=O)[C@@]1(C=O)[C@H]2CC=[N+](C\C2=C\C)CCc2c1[nH]c1ccccc21 QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000399 thyrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001897 thyrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
- C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Silicon Compounds (AREA)
Abstract
Метою цього винаходу є спосіб хроматографічного одержання циклоспорину А з неочищеного продукту, до складу якого входить циклоспориновий комплекс, за допомогою колонки, наповненої силікагелем та застосуванням багатоетапного хроматографування з використанням колонки, наповненої силікагелем у нормальній фазі, та суміші розчинників, головним компонентом якої є толуол.
Description
Опис винаходу
Метою цього винаходу є спосіб хроматографічного очищення циклоспорину А з неочищеного продукту, до 2 складу якого входить циклоспориновий комплекс, за допомогою колонки, наповненої силікагелем та шляхом застосування багатоетапного хроматографування з колонкою, заповненою силікагелем у нормальній фазі та сумішшю розчинників, головною складовою якої є толуол.
Циклоспорини є циклічними ундекапептидами, М-метильованими у декількох місцях, причому більшість з них має підтверджений фармакологічний ефект. На цей час відомо 25 членів цієї групи сполук, які позначено 70 літерами від А до 7. Спочатку циклоспорин А виділяли разом з ними. Згаданий циклоспорин є природним матеріалом і його було виділено з культурального бульйону Тоїуросіадіит іпЯайт штаму Сатвз (Нем. Спіт. Асіа 52.1075/1976/). Спочатку ця сполука стала відомою, як слабкий протигрибковий антибіотик, пізніше увагу було притягнуто до його імуносупресорного ефекту (Дж. Ф. Борел (.). Р. Вогеї) та інші: Іттипоіоду 32 1017/1977). З цієї причини він знаходив застосування, головним чином, під час трансплантування органів від інших людей 12 (легені, серце, нирки, кістковий мозок, шкіра). Дані фармакологічних досліджень підтвердили, що ця сполука пригнічує як гуморальні, так і клітинні імунні реакції завдяки гальмуванню проліферації Т-клітин та припиненню синтезу інтерлейкіну-2. Пізніше було встановлено, що циклоспорин А є ефективним при лікуванні автоїмунних та запальних захворювань різного типу, наприклад, автоїмунних гематологічних захворювань, виразкового коліту, дифузного тиреотоксичного зобу, розсіяного склерозу, псоріазу, а також ревматичного артриту. Було проведено додаткові експерименти по лікуванню інфекцій, викликаних найпростішими, а також пухлин. Важливість цієї групі засвідчується тим фактом, що шляхом введення різних амінокислот та замісників може бути одержано цілий ряд синтетичних споріднених сполук (наприклад, патенти ЕР 56782, Швейцарії Мо 630062 та ЕР 29122).
Більша частина циклоспоринів може бути одержана шляхом бродіння. З цією метою використовують, с наприклад, культури мікроорганізмів Суїїпагосагроп ІГисідит Вооїй (опис винаходу до патенту Швейцарії Мо (3 589716); Тгісподепта роїузрогит Кіїаії (опис винаходу до патенту Швейцарії Мо 603790); Тоіуросіадіит магішт (опис винаходу до патенту Угорщини Мо 201577). Наприкінці процесу зброджування утворюється циклоспориновий комплекс, до складу якого можуть входити також інші домішки (складові культуральних живильних середовищ, протиспінювачі, метаболіти і т.Ін.), у залежності від характеру згаданого процесу. --
Взагалі, згаданий продукт виділяють з бульйону шляхом екстрагування. Це може здійснюватись шляхом «-- відокремлення міцелію від бульйону центрифугуванням або фільтрацією, з наступним розчиненням активного інгредієнту, який знаходиться у міцелії, метанолом або ацетоном, та наступним екстрагуванням фільтрату за о допомогою розчинників, які не змішуються з водою. Іншим відомим способом є застосування процесу без Ге) фільтрування, шляхом екстрагування цільного бульйону органічним розчинником, який не змішується з водою. 325 Розчинник, який входить до складу органічної фази, випарюють вакуумною перегонкою. Однак, під час о екстрагування органічним розчинником до органічної фази переходять також сполуки, які мають ліпідну природу, що викликає ускладнення впродовж подальшого очищення. Існують відомі способи відокремлення цих сполук (наприклад, опис винаходу до патенту Швейцарії Мо 589716 або опублікована заявка на патент Германії Мо « 2455859), за якими залишок, після видалення розчиннику до екстрагування, розчиняється у суміші метанолу та З води, після чого декілька разів екстрагується таким же самим об'ємом петролейного ефіру. Порції петролейного с ефіру об'єднуються і циклоспорини виділяють з них за допомогою суміші метанолу та води. Згадана активна з» речовина, завдяки багаторазовому екстрагуванню, переходить з об'єднаної метаноловодяної фази до етиленхлориду, який, після цього, промивають водою та випарюють до сухості. Згаданий неочищений продукт, одержаний вищезгаданим способом, до складу якого входять циклоспорини, може бути з більшою ефективністю очищений за допомогою одного з хроматографічних способів. і-й Відповідно до способу, опис якого наведено у патенті США Мо 4117118, суміш циклоспоринів переносять
Ге | спочатку до колонки Зерпадех І Н-20 та елююють метанолом, після чого, послідовно, елююють на колонці з оксидом алюмінію сумішшю толуолу та етилацетату (1595), та на силікагелевій колонці сумішшю хлороформу та і-й етанолу (2965). Незважаючи на повторні етапи хроматографування, одержаний продукт не є чистим, але -к 70 представляє собою суміш циклоспорину А та В.
Подібний хроматографічний спосіб, разом з іншими, розкривається у патенті США Мо 4215199, за яким та попереднє очищення здійснюють за допомогою суміші хлороформу та метанолу (98:296, у об'ємному відношенні) на силікагелевій колонці. Після цього елюат випарюють до сухості. Згаданий залишок розчиняють у метанолі та піддають хроматографуванню на колонці Зерпадех І Н-20 з використанням метанолу, як елюенту. Елюатні 29 фракції випарюють до сухості, після чого згаданий залишок розчиняють у суміші хлороформу та метанолу
ГФ) (98:295, у об'ємному відношенні). Одержаний розчин знову піддають хроматографуванню на силікагелевій колонці. У елюаті першим з'являється циклоспорин А. Цю та наступні фракції відокремлюють і очищені о компоненти одержують шляхом випарювання згаданих елюатів.
За патентом Німеччини Мо 298276, маслянистий неочищений продукт розчиняють у невеликій кількості 60 хлороформу, після чого піддають хроматографуванню на алюмінієвій колонці за допомогою хлороформу.
Фракції, до складу яких входить циклоспорин А, випарюють у вакуумі, розчиняють у хлороформі, вносять до подібної ж колонки, після чого елююють хлороформом. Фракції, до складу яких входить активна речовина, знову випарюють у вакуумі. До одержаного залишку додають гексан та кристалізують циклоспорин А. Одержаний продукт промивають гексаном, потім сушать і, нарешті, перекристалізовують з суміші ефіру та гексану або 62 ацетону.
За патентом Угорщини Мо 201577, згаданий неочищений продукт, одержаний після випарювання, може бути очищеним на силікагелевій колонці шляхом елюювання сумішшю хлороформу та метанолу з поступовим підвищенням концентрації метанолу. Згаданий процес починають чистим хлороформом з поступовим підвищенням (ступенями по 0,595 об'ємних) вмісту метанолу у елюаті. Циклоспорин А елююють з колонки хлороформом, до складу якого входить 2 об'ємних відсотки метанолу; у разі циклоспорину В згадана доля дорівнює 2,5 об'ємним відсоткам, у разі циклоспорину С вона дорівнює З об'ємним відсоткам. Компоненти одержують шляхом випарювання згаданих фракцій.
У вищезгаданих способах наведено опис, головним чином, способів зброджування циклоспорину, причому 7/0 Головною метою етапів очищення є ідентифікування одержаного продукту. Внаслідок цього, згаданий продукт виділяють лише у незначній кількості їі наводяться лише фізичні та хімічні характеристики без публікування даних, які мають відношення до чистоти продукту та кількісного вмісту домішок.
Рюгер (КОедег) та інші (Неїм. Спіт. Асіа 59(4), стор. 1075-92 (1976)) виділяв невеликі кількості чистого циклоспорину А та С шляхом повторного хроматографування та інших етапів очищення для ідентифікування та 7/5 бтруктурного аналізу. Відповідно до згаданої статті, неочищений продукт, одержаний внаслідок зброджування
Тгісподегта роїузрогит Кіїаі, до складу якого входили, головним чином, циклоспорини А та С, знежирювали метанолом та петролейним ефіром. Після випарювання одержаний залишок розчиняють у хлороформі та піддають хроматографуванню шляхом градієнтного елюювання за допомогою суміші хлороформу та метанолу (98,5:1,5, у об'ємному відношенні), як елюенту. Чистий кристалічний циклоспорин А одержують шляхом 2о додаткового хроматографування. Згадану фракцію, до складу якої входить циклоспорин А, розчиняють у метанолі та піддають хроматографуванню на колонці Зерпадех І Н-20 з застосуванням метанолу, як елюенту.
Пікові фракції випарюють, розчиняють у толуолі та піддають хроматографуванню на колонці, заповненій оксидом алюмінію, з використанням толуолу, як елюенту, у присутності концентрації оцтової кислоти, яка підвищується.
Кристалічний продукт одержують після випарювання фракцій та обробки активованим вугіллям у спиртовому с ов розчині.
Спосіб очищення, який може бути здійснено у промисловому масштабі, описано у патенті США Мо 5382655. і)
За цим способом, неочищений продукт, до складу якого входять різні циклоспоринові компоненти, піддають тепловій обробці перед хроматографуванням на силікагелевій колонці за допомогою сумішей хлороформ-дихлорметан-етанолу та хлороформ-етилацетат-етанолу. Одержаний продукт піддають -жд зо додатковому хроматографуванню та перекристалізації, наслідком чого є одержання чистого продукту, придатного для застосування у препаратах до впорскування. -
Очищення неочищеного продукту, до складу якого входить суміш циклоспоринів, є дуже важким, оскільки ю домішки подібної хімічної структури дуже нагадують за хроматографічними характеристиками циклоспорин А, як головний продукт. Попередньо описані способи підтверджують, що, незалежно від застосованої суміші со розчинників та внаслідок перекриття хроматографічних шків, для одержання певних компонентів у чистій формі ю необхідно здійснення додаткових етапів хроматографічного або іншого очищення. Відомі способи очищення поки що характеризуються, у цілому, не тільки тим, що їх запотребування розчинників є доволі великим, але і тим, що вони також потребують застосування розчинників або сумішей розчинників З - 4 різних типів та наповнювачів колонок 2 - З типів. Внаслідок згаданих фактів, під час здійснення одного процесу необхідними виявляються « способи хроматографування та регенерування декількох типів, що ускладнює розробку економного в с технологічного способу промислового використання, простого за конструктивним рішенням та застосуванням.
Й З точки зору захисту довколишнього середовища, додаткові проблеми становить застосування хлорованих и?» вуглеводнів, оскільки все більша та більша кількість країн прикладає зусилля до обмеження їх використання.
Щодо наповнювачів хроматографічних колонок, застосування оксиду алюмінію, як наповнювача для промислового використання, є дуже сумнівним, оскільки припустиме навантаження та відокремлювальна с здатність, внаслідок його невеликої питомої поверхні, є дуже малими. На додаток до цього, він є невигідним для промислового застосування, оскільки наповнювач з оксиду алюмінію є жорстким та дуже крихким, що бо викликає необхідність застосування спеціального обладнання та технології. Таким чином, подібні наповнювачі не с можуть використовуватись у часто спорожнюваних колонках з нержавіючої сталі, які широко застосовуються у
Хімічній промисловості. - Наповнювачі типу Зерпадех є дуже дорогими і у випадку циклоспоринового комплексу їх ефективність є дуже
Кк обмеженою, оскільки розміри молекул дуже незначно взаємно відрізняються.
Метою цього винаходу є розробка легкого до застосування у промисловому масштабі способу хроматографічного очищення, придатного для одержання інгредієнту циклоспорину А, який вміщує набагато
Менше домішок, і, завдяки цьому, є більш безпечним для застосування у медичній практиці.
Метою авторів цього винаходу була розробка такої технології хроматографічного очищення, яка потребувала (Ф, б суміші розчинників та наповнювача для колонки тільки одного типу. ка Силікагель було використано, як наповнювач для колонки завдяки його переважаючим властивостям -- високій питомій поверхні, великому розміру пор, сприятливій здатності до поглинання, легкого маніпулювання та во відносно низькій вартості.
Для цього наповнювача, який є придатним для відокремлення циклоспоринових компонентів з високою вибірковістю, необхідно було підібрати ідеальну суміш розчинників та спосіб.
В результаті експериментів, автори цього винаходу дійшли висновку, що мета може бути здійсненою багатоетапним хроматографуванням на силікагелевій колонці з використанням суміші розчинників, як елюенту, 65 Головною складовою якої є толуол. Здивування викликало те, що навіть такі компоненти, як циклоспорини " таї, які є найближчими до циклоспорину А, можуть бути відокремленими за допомогою триетапного хроматографування на силікагелевій колонці з використанням, як елюенту, ацетону, до складу якого входить толуол. Згадані компоненти відрізняються від циклоспорину А тільки метальною групою.
Відповідно до першого прикладу міжнародної заявки Мо МО 94/16091, суміш розчинників, яка складається з толуолу та ацетону, також використовується на одному етапі. Одержаний продукт перекристалізовують з суміші розчинників, яка складається з ефіру та гексану. (Вихід: 66,695). Оптичне обертання згаданого продукту є достатнім, однак температура його розтоплення є значно нижча за наведену у літературі, що свідчить про те, що згаданий продукт не є чистим. Таким чином, навіть у разі перекристалізації з розчиннику одержують продукт низького рівня чистоти з низьким виходом. 70 Спосіб за цим винаходом є придатним для відокремлення домішок, які стрічаються найчастіше, наприклад, циклоспоринів В та С, які на цей час є присутніми у найбільших кількостях, та, крім того, таких складових, як циклоспорини О, І та І, які на цей час є присутніми у слідових кількостях. Вміст циклоспоринів В та С у кінцевому продукті, циклоспорині А, який було одержано таким чином, складає менше, аніж 0,02 мас. 95, у той час, як вміст циклоспоринів ГІ, О та О є меншим від 0,05 мас. 905.
Метою цього винаходу є поліпшений спосіб очищення циклоспорину А з неочищеного продукту, до складу якого входить циклоспориновий комплекс, який, крім того, забезпечує можливість одержання надзвичайно чистого циклоспорину А у великих масштабах, за допомогою хроматографічного очищення на силікагелевій колонці з застосуванням багатоетапного хроматографування з сумішшю розчинників, до складу якої, як головна складова, входить толуол. Іншою новою особливістю цього способу є надзвичайно високе навантаження
Колонки. У традиційній хроматографічній практиці ступінь навантаження колонки складає не більше, ніж 5 - 1090 від наповнення згаданої колонки, причому згадане значення для циклоспоринів є ще нижчим.
Згадані багатоетапна хроматографія, суміш розчинників, до складу якої толуол входить, як головний компонент, та високе навантаження колонки є взаємопов'язаними складовими, і необхідний результат може бути досягнуто лише у разі їх спільного застосування. Таким чином, для одержання надзвичайно чистого продукту, с одночасно повинні використовуватись усі три вищезгадані складові.
За цим винаходом, у переважному варіанті, послідовно застосовуються 2 - 4 хроматографічні етапи, більш і) доцільним є застосування трьох етапів.
Перевантаження згаданої колонки є найбільшим на першому етапі хроматографування. Безперечне відокремлення активної речовини та домішок забезпечує також можливість застосування високого навантаження - ди зо Колонки на двох наступних етапах хроматографування.
Сприятливим для згаданого очищення є застосування суміші розчинників, яка складається з - толуолу-ацетону, причому максимальний вміст ацетону дорівнює 30 об'ємним відсоткам. ю
За іншим сприятливим способом, застосовується суміш розчинників, яка складається з толуолу-етилацетату, причому концентрація етилацетату є нижчою за 35 об'ємних відсотків. со
У згаданому способі очищення сприятливим є, як мінімум, одноразове застосування градієнтного елюювання. ю
За даними експериментів, які було проведено авторами цього винаходу, встановлено, що для очищення циклоспоринового комплексу, який піддається обробці у нашому випадку, сприятливим є застосування 10 - 30 об'ємних 95, більш сприятливим - 13 - 18 об'ємних 95, ацетону та 10 - 35 об'ємних 95 або 15 - 20 об'ємних 95 етилацетату. «
Відповідно до можливого способу за цим винаходом, елюювання, у випадку триетапного хроматографування, ств) с здійснюють толуолом, до складу якого входить 15 об'ємних 95 ацетону або 18 об'ємних 9о етилацетату. На першому етапі відокремлюється основна частина циклоспорину С, на другому етапі видаляється більша частина з циклоспоринів В, ЇЇ та М, і, нарешті, на третьому етапі, кількість компонентів Ї та І, а також інших невизначених домішок, може бути зменшеною до рівня нижче 0,05 мас. 95. На першому етапі втрати циклоспорину А є мінімальними, однак у попередніх фракціях другого та третього етапу значні кількості с циклоспорину А видаляються разом з циклоспорином О, який є дуже близьким до циклоспорину А. Згаданий циклоспорин А може бути одержаним на четвертому етапі у дуже чистій формі. со Для порівняння, у таблиці, яку представлено далі, наведено профілі вмісту домішок у циклоспорині А, який с відповідає стандартам фармакопеї США, у активному інгредієнті, циклоспорині А, препарату для впорскувань а ю ЗАМОІММИМФ), а також відповідні дані по циклоспорину А, який було одержано за цим винаходом. щ 7 етандартфармаютеі СА Препарат для влородувань ЗАМОІММОМ Продукт га Прикладом 7 св Цилетювино 10001000000и700000001000006
Цитеєтриня 00111100 о Невизничена домше| 000090100000000000350111000000000о6 ю
Цилеюино 01001006 бо ЩиклоспоринО 10? 111111111111101711111005
З наведених даних видно, що циклоспорин А, який було одержано за цим винаходом, за якістю значно перевищує параметри препарату для впорскувань ЗАМОІММИМФ», більше того, він перевищує навіть вимоги фармакопеї США. бе Спосіб за цим винаходом є придатним також для очищення неочищеного продукту як у невеликих, так і у значних масштабах.
Крім того, що спосіб за цим винаходом є придатним для одержання чистого циклоспорину А, він має також деякі суттєві технологічні переваги. Оскільки використовується технологічний спосіб (хроматографія) тільки одного типу, згаданий спосіб очищення надає можливість уніфікованого керування, більше того, він є Відтворюваним і може бути перетвореним на безперервний спосіб. Крім того, згаданий спосіб має особливу перевагу, яка полягає у тому, що, оскільки на трьох етапах хроматографування застосовується суміш розчинників одного типу, це значно спрощує регенерування як згаданих колонок, так і згаданих розчинників.
Додаткова особлива перевага згаданого процесу полягає у тому, що на першому етапі хроматографування домішки з високими зв'язувальними властивостями залишаються у згаданій колонці, що значно полегшує 7/0 регенерування наповнювачів колонки на двох наступних етапах.
Цей винахід представляється наведеними далі прикладами, які ні в якому разі не обмежують обсягу цього винаходу.
З порівняльного прикладу (Приклад 4) витікає, що у разі застосування у триетапному способі хроматографування традиційної суміші розчинників, до складу якої входять дихлорметан та ацетон, і яка /5 застосовувалась до цього часу у відомих способах, було б неможливим одержання кінцевого продукту подібної чистоти.
Приклад 1
Триетапне хроматографічне очищення неочищеного циклоспоринового продукту з застосуванням суміші розчинників толуолу та ацетону
Якість вихідного неочищеного циклоспоринового продукту:
Вміст циклоспорину А 60,9 мас. 90
Вміст циклоспорину В 11,2 мас. 90
Вміст циклоспорину С 8,3 мас. 90
Вміст циклоспорину Г. 1,79 мас. 90 с
Вміст циклоспорину І 1,58 мас. 90
Вміст циклоспорину О 1,25 мас. 90 і)
Перший етап
Хроматографування здійснюють на двох хроматографічних колонках, з'єднаних послідовно, кожна з яких споряджена оболонкою, має об'єм 8 літрів, діаметр 10см, довжину 100см. Кожна з двох колонок вміщує 3,95 - «- зо ЗЗокг силікагелю Кіеведе! типу Мегск з розміром зерна 0,04 - 0,063мм. Під час першого етапу хроматографування обидві колонки вміщують свіжий силікагель. У разі наступного етапу хроматографування, -- перша згадана колонка відокремлюється і з нею з'єднується друга колонка, яка вміщує свіжий силікагель. У ю подальшому, на кожному етапі хроматографування використовується тільки одна нова колонка. Одержання неочищеного продукту со 4 кг неочищеного продукту (з чистотою 60,995), попередньо розчинені у 15 літрах толуолу, вносять до пари ю послідовно з'єднаних колонок. 19 літрів одержаного розчину заливають до верхньої частини згаданої першої колонки через фільтр зі швидкістю 2,4л/годину. Після завантаження, згаданий матеріал елююють сумішшю розчинників ацетону-толуолу (13:87 об'ємних 90), доки об'єм потоку, що витікає, на дні другої колонки не буде дорівнювати 39 літрам. Вміст циклоспорину у потоці, що витікає, аналізують засобами тонкошарової « хроматографії. Фракції, які не вміщують циклоспорину, збирають, як відходи. 28 літрів потоку, що виходить, з с після появи циклоспорину, розглядаються, як головна фракція. Вміст сухого матеріалу у проміжній речовині І, яку одержано таким чином, складає 3,23ЗКкг. ;» Якість: циклоспорин А 75 мас. 90 цикл оспорил В 10,1 мас. 90 циклоспорин С 1,6 мас. 90 с циклоспорин Г. 1,7 мас. 90 циклоспорин Ш 1,5 мас. 90 со циклоспорин О 1,3 мас. 90 с Вихід, вирахований за циклоспорином А: 9790
Другий етап - Розділення здійснюють на колонці довжиною 1 метр, об'ємом 8 літрів, спорядженій оболонкою. Згадана як колонка вміщує силікагель КіезеїЇде! 60 Мегск (0,015 - О0,040мм). Маса наповнювача складає З,95кг.
Розчин проміжної речовини І (об'ємом, приблизно, З літри та вмістом сухої речовини 370 грамів), яку було одержано на першому етапі, завантажують до згаданої колонки зі швидкістю 2,4л/годину, після чого промивають дво ло толуолу.
Після завантаження згаданого матеріалу, колонку елююють 10 літрами суміші ацетону:толуолу (15:85 (Ф, об'ємних 905), потім 20 літрами розчину ацетону:толуолу (25:75 об'ємних 96). ка Швидкість потоку розчиннику до фракції 17 літрів дорівнює 2,4л/годину, після чого, з фракції 18 літрів, вона підвищується до 5бл/годину. Фракції аналізуються засобами тонкошарової хроматографії (ТІ С). Фракції 1-11 бо Літрів є відходами; фракції 12 - 19 літрів розглядаються, як критичні фракції І, ї з них відбираються зразки.
Профілі домішок аналізуються засобами високоефективної тонкошарової хроматографії (НРІ С), ії ними маніпулюють, як попередніми фракціями або змішують з головними фракціями. Таким чином може бути одержана попередня фракція, вміст сухого матеріалу якої дорівнює 80г, яка після цього випарюється до сухості.
Фракції 20 - 25 літрів об'єднуються, як головна фракція. Фракції 26 - 31 літр розглядаються, як критичні 65 фракції і, після аналізу, вони об'єднуються з головною фракцією або ними маніпулюють, як кінцевою фракцією.
Головну фракцію, одержану вищезгаданим чином, випарюють до сухості на плівковому випарювачі,
спорядженому вібраційною мішалкою. Одержують 234г проміжної речовини її з виходом 8095 та наступною якістю: циклоспорин А 95 мас. 90 циклоспорин и 1,2 мас. 90 циклоспорин Г. 0,7 мас. 90 циклоспорин В «0,1 мас. 90 циклоспорин О 0,5 мас. 90 циклоспорин С 0,1 мас. 90 70 Третій етап
Хроматографування здійснюють на колонках тієї ж самої конструкції та геометричних розмірів, як ті, опис яких наведено на першому та другому етапах.
Толуоловий розчин проміжної речовини ІІ (об'ємом 1,7 літри та вмістом сухої речовини 220 грамів), яку було одержано на другому етапі, завантажують до верхньої частини згаданої колонки зі швидкістю 2,4л/годину, 7/5 Після чого промивають 1л толуолу.
Колонку елююють сумішшю 20 літрів ацетону/толуолу (15:85 об'ємних 90), після чого циклоспорин елююють літрами розчину ацетону:толуолу (25:75 об'ємних 96).
Швидкість потоку розчиннику до фракції 31 літр дорівнює 2,4л/годину, після чого, з фракції 32 літри, вона підвищується до 5л/годину. 20 Фракції 1 - 18 літрів є відходами; фракції 19 - 23 літри є попередніми фракціями і розглядаються, як критичні фракції І. З них відбирають зразки для аналізу на вміст сухого матеріалу та профілі домішок засобами високоефективної тонкошарової хроматографії (НРІ С). Після аналізу ними маніпулюють, як попередніми фракціями або змішують з головними фракціями. Фракції 29 - 38 літрів об'єднуються, як головна фракція.
Фракції 39 - 41 літр збираються Тл порціями і розглядаються, як критичні фракції ІІ. Після аналізу, вони сч об'єднуються з головною фракцією або ними маніпулюють, як кінцевою фракцією. 7Ог попередньої фракції можуть бути одержані збиранням фракцій із подальшим випарюванням до сухості. і)
Головні фракції об'єднують, і після випарювання до сухості одержують 157г чистого циклоспорину з 7590 виходом. Згаданий продукт має наступну якість: циклоспорин А 99,6 мас. 90 - зо циклоспорин ГІ «0,05 мас. 90 циклоспорин О «0,05 мас. 90 - циклоспорин О «0,05 мас. 90 ю циклоспорин В «0,02 мас. 90 циклоспорин С «0,02 мас. 90 со
Приклад 2 ю
Чотириетапне хроматографічне очищення неочищеного циклоспоринового продукту на колонці з нерухомим шаром силікагелю з застосуванням суміші розчинників толуолу-ацетону або толуолу-етилацетату
Неочищений циклоспориновий продукт очищають засобами триетапного хроматографування, опис якого наведено у Прикладі 1. Попередні фракції, одержані внаслідок триетапного хроматографування, очищають на « четвертому етапі на нерухомому шарі з застосуванням суміші розчинників толуолу-етилацетату. в с Четвертий етап
Конструкція та геометричні розміри хроматографічної колонки є такими ж самими, опис яких наведено у ;» Прикладі 1. Згадана колонка вміщує силікагель КіезеїЇде! 60 Мегеск (0,015 - 0,04Омм), як описано у Прикладі 1.
До колонки, зі швидкістю 2,4л/годину, завантажують розчинений у 2,5л толуолу концентрат вагою 260Гг, одержаний з попередньої фракції. с вміст циклоспорину А 80,6 мас. 90 вміст циклоспорину 0 42 мас. 90 со Завантажений зразок промивають 1 літром толуолу, після чого колонку елююють сумішшю 20л «сл етилацетату:толуолу (17:83 об'ємних 95) зі швидкістю 2,4л/годину. Подальше елюювання здійснюють сумішшю 5р Ол етилацетатутолуолу (28:72 об'ємних 9б). - Впродовж збирання фракцій, фракції 1 - 19 літрів розглядаються, як відходи. Після НРІ С аналізу фракції 20 як - 25 літрів розглядаються, як відходи, або об'єднуються з головною фракцією. Фракції 26 - 35 літрів збираються, як головна фракція. Після відбирання зразків та НРІ С аналізу фракції 36 - 42 літрів об'єднуються зі згаданою головною фракцією або ними маніпулюють, як відходами. Зібрана головна фракція 23 - 42 літри, ов Згадана перед тим, випарюється до сухості. Таким чином одержують 195 грамів чистого циклоспорину А, до складу якого входить 99,6 мас. 9о активного інгредієнту з 7595 виходом наступної якості:
Ф) циклоспорин А 99,6 мас. 90 ка циклоспорин О «0,05 мас. 90 циклоспорин Ш - во циклоспорин І. -
Приклад З
Двоетапне хроматографічне очищення неочищеного циклоспоринового продукту на колонці з нерухомим шаром силікагелю з застосуванням суміші розчинників толуолу та ацетону
Неочищений циклоспориновий продукт очищають за допомогою того ж самого способу, який описано на 65 першому етапі Прикладу 1, з одержанням проміжного циклоспорину | такої ж самої якості. Подальший спосіб виглядає таким чином:
Другий етап
До колонки зі швидкістю 2,4л/годину завантажують З літри проміжної речовини І, до складу якої входить 370 грамів сухого матеріалу, після чого згаданий зразок промивають 1 літром толуолу.
Після завантаження згадану колонку елююють сумішшю 10 літрів ацетону:толуолу (15:85 об'ємних 90), після чого елюювання продовжують за допомогою 20 літрів суміші ацетону:толуолу (25:75 об'ємних 905).
Швидкість потоку розчиннику до фракції 17 літрів дорівнює 2,4л/годину, після чого, з фракції 18 літрів, вона підвищується до бл/годину.
За даними ТС та НРІ С, фракції 1 - 11 літрів є відходами; фракції 12 - 20 літрів розглядаються, як 7/0 попередні фракції, фракції 21 - 24 літрів розглядаються, як головні фракції і з фракціями від 25 літрів до кінця маніпулюють, як з кінцевими фракціями. Фракції ацетону, використаного для промивки, розглядаються, як відходи.
Після фракціонування зібрані головні фракції об'єднуються та випарюються до сухості з одержанням 114г циклоспорину А з 4195 виходом та з такою ж доброю якістю, як описано у прикладі 1.
Приклад 4
Порівняльний приклад для триетапного хроматографічного очищення неочищеного продукту з застосуванням суміші розчинників дихлорметану-ацетону
Якість вихідного неочищеного циклоспоринового продукту (така ж сама, що і у продукту, який було використано у Прикладі 1):
Циклоспорин А 60,9 мас. 90
Циклоспорин В 11,2 мас. 90
Циклоспорин С 8,3 мас. 90
Циклоспорин Г. 1,79 мас. 90
Циклоспорин І 1,58 мас. 90 с
Циклоспорин О 1,25 мас. 90
Перший етап і)
Хроматографічне обладнання та заповнення є тими ж самими, що і описані у Прикладі 1. До однієї пари послідовно з'єднаних колонок завантажують 4,1кг неочищеного продукту з чистотою 60,995 у 15 літрах розчину дихлорметану. «- зо Після введення зразків згадану колонку елююють дихлорметаном зі швидкістю 2,4л/годину, доки не буде зібрано З5 літрів потоку, що витікає. --
Фракції 1 - 10 літрів є відходами, у той час, як фракції 11 - 35 літрів розглядаються, як головні ю фракції. Вміст сухого матеріалу у проміжній речовині І одержаній таким шляхом, дорівнює 2,9кг, вміст активного інгредієнту складає 75 об'ємних відсотків. со
Другий етап ю
Хроматографічне обладнання та заповнення є тими ж самими, що і описані у Прикладі 1.
До верхньої частини колонки зі швидкістю 2,4л/годину вносять З літри проміжної речовини І, до складу якої входить З50г сухого матеріалу. Елюювання здійснюють 10 літрами суміші ацетону:дихлорметану (1:9, у об'ємному відношенні), після чого продовжують 25 літрами суміші ацетонух-дихлорметану (2:8, у об'ємному « відношенні) і закінчують ацетоном зі швидкістю 2,4л/годину. з с За даними ТІС, об'єм попередньої фракції складав 13 літрів, об'єм головної фракції складав 22 літри, об'єм кінцевої фракції складав 11 літрів. 22 літри головної фракції випарювали до сухості, внаслідок чого ;» одержували 220г проміжного продукту ІЇ з чистотою 9190.
Третій етап
Хроматографічне обладнання та заповнення є тими ж самими, що і описані у Прикладі 1. с До колонки зі швидкістю 2,4л/годину вносять 220г концентрату проміжної речовини ІІ у дихлорметані.
Елюювання здійснюють 20 літрами суміші ацетону:дихлорметану (1:29, у об'ємному відношенні), після чого со продовжують 30 літрами суміші ацетону:дихлорметану (2:8, у об'ємному відношенні) і закінчують ацетоном зі с швидкістю 2,4л/годину.
Перші 26-літрові фракції розглядаються, як попередні, потім збирають 26б-літрову головну фракцію і, - нарешті, збирають 11-літрову кінцеву фракцію. як 26 літрів головної фракції випарювали до сухості, внаслідок чого одержували 140г проміжного продукту ЇЇ наступної якості:
Циклоспорин А 98,6 мас. 90
Циклоспорин І 0,6 мас. 90
Циклоспорин 0 0,3 мас. 90
Ф) Циклоспорин ГІ. 0,2 мас. 90 ка Циклоспорин В 0,1 мас. 90
Циклоспорин С 0,1 мас. 90
Claims (16)
1. Спосіб очищення циклоспорину А для одержання циклоспорину А високої чистоти з неочищеного продукту, ви ЩО містить циклоспориновий комплекс, з використанням процесу хроматографування на силікагелевій колонці, в якому застосовують багатостадійне хроматографування з використанням суміші розчинників, основним компонентом якої є толуол.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що послідовно здійснюють 2-4 стадії хроматографування.
3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що послідовно здійснюють З стадії хроматографування.
4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як суміш розчинників використовують толуол-ацетон.
5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить щонайбільше 30 90 ацетону.
6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як суміш розчинників використовують толуол-етилацетат.
7. Спосіб за п. 6, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить щонайбільше З5 95 (об.) 7/0 етилацетату.
8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на щонайменше одній стадії хроматографування застосовують градієнтне елюювання.
9. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що циклоспориновий комплекс, що його використовують як вихідний матеріал для хроматографування, перед хроматографуванням нагрівають до 80-120 "С.
10. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до 30 95 ацетону.
11. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до 35 95 (об.) етилацетату.
12. Циклоспорин А високої чистоти, в якому вміст циклоспорину Її, циклоспорину ОО та циклоспорину Ю становить менше ніж 0,05 9о (мас.), і вміст циклоспорину В та циклоспорину С становить менше ніж 0,02 9о (мас.).
13. Промисловий спосіб очищення циклоспорину А з неочищеного продукту, що містить циклоспориновий комплекс, з використанням процесу хроматографування на силікагелевій колонці, в якому здійснюють багатостадійне хроматографування на колонці із силікагелем у нормальній фазі, з використанням суміші розчинників, основним компонентом якої є толуол.
14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що циклоспориновий комплекс, що його використовують як сч вихідний матеріал для хроматографування, перед хроматографуванням нагрівають до 80-120 "С.
15. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до ЗО 95 ацетону. і)
16. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що використовують толуол, який містить від 10 до 35 95 (об.) етилацетату. «- зо Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2003, М 8, 15.08.2003. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і 00/07 науки України. ю (ее) Іс)
- . и? 1 (ее) 1 - 70 - іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9700645A HU223054B1 (hu) | 1997-03-25 | 1997-03-25 | Tisztítási eljárás nagytisztaságú ciklosporin A előállítására |
| PCT/HU1998/000029 WO1998042734A1 (en) | 1997-03-25 | 1998-03-23 | Process of purification of cyclosporin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA58511C2 true UA58511C2 (uk) | 2003-08-15 |
Family
ID=89994909
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA98116251A UA58511C2 (uk) | 1997-03-25 | 1998-03-23 | Способи очищення циклоспорину а та циклоспорин а високої чистоти |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0920447B1 (uk) |
| JP (1) | JP2000511939A (uk) |
| AT (1) | ATE223434T1 (uk) |
| AU (1) | AU737260B2 (uk) |
| BG (1) | BG64215B1 (uk) |
| CA (1) | CA2255062C (uk) |
| CZ (1) | CZ293687B6 (uk) |
| DE (1) | DE69807635T2 (uk) |
| DK (1) | DK0920447T3 (uk) |
| ES (1) | ES2180159T3 (uk) |
| HK (1) | HK1020740A1 (uk) |
| HU (1) | HU223054B1 (uk) |
| IL (1) | IL126871A0 (uk) |
| NO (1) | NO322211B1 (uk) |
| NZ (1) | NZ332718A (uk) |
| PL (1) | PL194252B1 (uk) |
| PT (1) | PT920447E (uk) |
| RU (1) | RU2182577C2 (uk) |
| SK (1) | SK283672B6 (uk) |
| UA (1) | UA58511C2 (uk) |
| WO (1) | WO1998042734A1 (uk) |
| YU (1) | YU49468B (uk) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2151450A1 (de) * | 2008-07-29 | 2010-02-10 | Sandoz AG | Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden |
| DE102009037551A1 (de) * | 2009-08-17 | 2011-02-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Cyclosporinderivate |
| HUP1500502A2 (en) | 2015-10-26 | 2017-04-28 | Rotachrom Tech Kft | Process for the purification of cyclosporin-a |
| CN114653350A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-06-24 | 江苏九阳生物制药有限公司 | 一种环孢素a层析硅胶的再生方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU213553B (en) * | 1992-05-25 | 1997-07-28 | Biogal Gyogyszergyar | Process for isolating of cyclosporin-a |
| FI92334C (fi) * | 1992-12-30 | 1994-10-25 | Leiras Oy | Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta |
| KR100304324B1 (ko) * | 1994-10-13 | 2001-11-22 | 김용규 | 사이클로스포린a의제조방법 |
-
1997
- 1997-03-25 HU HU9700645A patent/HU223054B1/hu not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-23 SK SK1618-98A patent/SK283672B6/sk unknown
- 1998-03-23 YU YU53598A patent/YU49468B/sh unknown
- 1998-03-23 AT AT98913969T patent/ATE223434T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 JP JP10545312A patent/JP2000511939A/ja not_active Ceased
- 1998-03-23 PT PT98913969T patent/PT920447E/pt unknown
- 1998-03-23 ES ES98913969T patent/ES2180159T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 CZ CZ19983814A patent/CZ293687B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 RU RU98123499/04A patent/RU2182577C2/ru active
- 1998-03-23 WO PCT/HU1998/000029 patent/WO1998042734A1/en active IP Right Grant
- 1998-03-23 NZ NZ332718A patent/NZ332718A/xx unknown
- 1998-03-23 DK DK98913969T patent/DK0920447T3/da active
- 1998-03-23 PL PL98330142A patent/PL194252B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-03-23 EP EP98913969A patent/EP0920447B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-23 DE DE69807635T patent/DE69807635T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-23 IL IL12687198A patent/IL126871A0/xx unknown
- 1998-03-23 AU AU68482/98A patent/AU737260B2/en not_active Ceased
- 1998-03-23 UA UA98116251A patent/UA58511C2/uk unknown
- 1998-03-23 CA CA002255062A patent/CA2255062C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-10 BG BG102911A patent/BG64215B1/bg unknown
- 1998-11-24 NO NO19985483A patent/NO322211B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-12-09 HK HK99105786A patent/HK1020740A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BG102911A (en) | 1999-09-30 |
| ATE223434T1 (de) | 2002-09-15 |
| CZ293687B6 (cs) | 2004-07-14 |
| PT920447E (pt) | 2002-11-29 |
| CA2255062C (en) | 2008-06-17 |
| HU223054B1 (hu) | 2004-03-01 |
| HU9700645D0 (en) | 1997-05-28 |
| ES2180159T3 (es) | 2003-02-01 |
| EP0920447B1 (en) | 2002-09-04 |
| CA2255062A1 (en) | 1998-10-01 |
| EP0920447A1 (en) | 1999-06-09 |
| NO985483D0 (no) | 1998-11-24 |
| NO322211B1 (no) | 2006-08-28 |
| PL194252B1 (pl) | 2007-05-31 |
| HK1020740A1 (en) | 2000-05-19 |
| SK161898A3 (en) | 1999-05-07 |
| PL330142A1 (en) | 1999-04-26 |
| NZ332718A (en) | 2000-04-28 |
| WO1998042734A1 (en) | 1998-10-01 |
| RU2182577C2 (ru) | 2002-05-20 |
| AU737260B2 (en) | 2001-08-16 |
| SK283672B6 (sk) | 2003-11-04 |
| DE69807635T2 (de) | 2003-08-07 |
| BG64215B1 (bg) | 2004-05-31 |
| DE69807635D1 (de) | 2002-10-10 |
| IL126871A0 (en) | 1999-09-22 |
| YU53598A (en) | 1999-11-22 |
| JP2000511939A (ja) | 2000-09-12 |
| YU49468B (sh) | 2006-05-25 |
| DK0920447T3 (da) | 2002-12-16 |
| NO985483L (no) | 1998-11-24 |
| HUP9700645A3 (en) | 2001-11-28 |
| HUP9700645A2 (hu) | 1999-06-28 |
| AU6848298A (en) | 1998-10-20 |
| CZ381498A3 (cs) | 1999-02-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2257271C (en) | Method of isolating cyclosporins | |
| AU1014500A (en) | Isolation and purification of paclitaxel and other related taxanes by industrial preparative low pressure chromatography on a polymeric resin column | |
| AU760242B2 (en) | Method for high yield extraction of paclitaxel from paclitaxel-containing material | |
| AU784323B2 (en) | Production of taxol and taxanes | |
| CZ299998A3 (cs) | Způsob chromatografického získávání velmi čistého cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů | |
| UA58511C2 (uk) | Способи очищення циклоспорину а та циклоспорин а високої чистоти | |
| US6423233B1 (en) | Purification process | |
| WO1996012031A1 (en) | Process for preparing cyclosporin a | |
| JPS617285A (ja) | 精製サポニン抽出方法 | |
| KR100496929B1 (ko) | 시클로스포린의정제방법 | |
| HRP980604A2 (en) | Purification process | |
| RU2138509C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ РАСТЕНИЯ РОДА SERRATULA αЭКДИЗОНА, βЭКДИЗОНА И ИНОКОСТЕРОНА | |
| CN111909176B (zh) | 一种从他克莫司分离废液中回收子囊霉素、他克莫司8-丙基类似物的方法 | |
| CN115785006A (zh) | 环（酪氨酸-缬氨酸）的制备方法 | |
| CN117820440A (zh) | 一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法 | |
| RU2186069C1 (ru) | Способ получения технического дигоксина |