CZ299998A3 - Způsob chromatografického získávání velmi čistého cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů - Google Patents
Způsob chromatografického získávání velmi čistého cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ299998A3 CZ299998A3 CZ982999A CZ299998A CZ299998A3 CZ 299998 A3 CZ299998 A3 CZ 299998A3 CZ 982999 A CZ982999 A CZ 982999A CZ 299998 A CZ299998 A CZ 299998A CZ 299998 A3 CZ299998 A3 CZ 299998A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- chromatography
- smb
- acetonitrile
- cyclosporin
- extract
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 title claims abstract description 44
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 title claims abstract description 42
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 title claims abstract description 32
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title claims description 28
- 108010036941 Cyclosporins Proteins 0.000 title claims description 22
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 5
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 78
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 claims description 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 abstract description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 25
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 19
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 11
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 7
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 3
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000123975 Trichoderma polysporum Species 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- OJCSPXHYDFONPU-UHFFFAOYSA-N etoac etoac Chemical compound CCOC(C)=O.CCOC(C)=O OJCSPXHYDFONPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- JQOAQUXIUNVRQW-UHFFFAOYSA-N hexane Chemical compound CCCCCC.CCCCCC JQOAQUXIUNVRQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
- C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Description
Oblast techniky
Tento vynález se týká novézo způsobu chromatografického čistění cyklosporinů A (Cy A) a příbuzných cyklosporinů, který je vhodný pro použití ve farmaceutickém průmyslu.
Přitom jsou účinné látky získávány za ekonomicky výhodných podmínek v dostatečné čistotě pro farmaceutické potřeby, to znamená, že například v případě cylkosporinu A jsou dodrženy požadavky na čistotu podle evropského lékopisu (PHARMEUROPA svazek 4, číslo 4, strana 270, prosinec 1992).
Dosavadní stav techniky
S úspěšnou izolací cyklosporinů A z Trichoderma polysporum (LINK EX PERS.) Rafai A. Rúeggerem a spolupracovníky [Helv. Chim. Acta .59, 112 (1976)] byl poprvé otevřen přístup k nové skupině silně imunosupresivních látek. Díky intenzivnímu výzkumu bylo zatím objeveno více než 25 příbuzných cyklosporinů s imunosupresivním a antifungálním účinkem [R. Traber a kolektiv, Helv. Chim. Acta 70, 13 (1987)].
Dnes je stěžejní význam cyklosporinů A jako prostředku volby při potlačování imunitní odpovědi po orgánových transplantacích nesporný. V důsledku toho nechyběla v minulosti snaha o to se zlepšením výrobního postupu vyrovnat se stále stoupajícími nároky na množství a kvalitu tohoto život zachraňujícího léku.
9
9 9 « ·
«· »♦ ·· • · 9 · · * • 9 9 9 9
9 999 ··· • · · 9999 99 99
Dosud známé technické řešení čistění cyklosporin
A obsahujících surových extraktů zahrnují většinou několik stupňů chromatografie za použití organických rozpouštědel jako elučních prostředků.
Ve výše zmíněné práci A. Rúeggera byla nejdříve prováděna chromatografie na silikagelu Kieselgel 60 Merck (0,063 až 0,2 mm) jako absorbentu s chloroformem při stoupajícím množství methanolu. Následovně byl získaný produkt podroben gelové chromatografii na Sephadex LH 20 v methanolu a poté chromatografii na oxidu hlinitém (Brockmann, Akt. I) v toluenu se stoupajícím podílem etylacetátu.
Podobné postupy používají i pozdější práce (tabulka l). Hojně našly využití adsorbenty Sephadex LH 20, Kieselgel 60 Merck (0,063 až 0,2 mm) a oxid hlinitý. Jako tekuté fáze byly většinou použity směsi organických rozpouštědel.
Z důvodu vysoké toxicity, vzhledem ke zbylým stopám rozpouštědel v účinné látce, a také, jak z tohoto vyplývá, kvůli bezpečnostně technickým problémům při zpracování větších množství těchto látek (destilace, odstraňování) jsou chloroform a metylenchlorid nevhodné.
Dále při použití gradientů nebo složitějších, například ternárních isokratických směsí, je nové nastavení tekuté fáze po destilaci eluátů zdlouhavé a drahé.
Podobně lze hodnotit i- metodu popsanou firmou BIOGAL v kanadském patentu CA 2 096 892, při které je surový extrakt před chromatografii podroben tepelnému zpracování. Polotovar je zde zahříván asi 1 hodinu na přibližně 110 °C a následně více než 5 hodin chlazen na teplotu místnosti. Při nasazení
* ·· · * · ♦ * • · · · · « · « · · · ···«·· • · · · · • · ··«· · · ·· vysokého podílu chlorovaných uhlovodíků je ve dvou po sobě jdoucích jednostupňových chromatografických postupech na silikagelu Kieselgel 60 jako absorbentu izolováno asi 15 % podaného množství cyklosporinu A o čistotě asi 97,6 %. Tento výsledek však vzhledem k velikosti výtěžku a čistotě získané účinné látky není s ohledem na průmyslové využití uspokojivý. Mimo to by tyto složité přírodní látky neměly být vystavovány teplotním změnám kvůli své teplotní nestabilitě a možné izomerizaci.
Podle dosavadního stavu znalostí se zdají jako vhodné pouze přihlášené postupy firem FUJISAWA (WO 9 213094) a BIOGAL (CA 2 096 892) a jednostupňovým chromatografikcým čištěním.
K tomu je však nutná nákladná kombinace tekutých fází popřípadě gradient, což regeneraci tekuté fáze ztěžuje.
K přesnějšímu posouzení těchto postupů však často chybí údaje o jejich výtěžnosti a dosahované čistotě produktů.
• ·· ·· ·· « 4 4 · · · ·
4 4 4 4 *
444 4 4 4 · • 4 4 4 4
444 44 44 4444
44
4 4
4 4
444 444
4
4«
Příklady některých dosud známých metod chromatografického čistění cyklosporinu A
Patent Firma Stupně čistění
US 4 117 118
US 4 215 199
SANDOZ 1
SANDOZ 1
Sephadex LH, metanol neutrální oxid hlinitý, toluen/etylacetát, gradient Kieselgel 60, chloroform/metanol 98:2
Kieselgel 60, chloroform/methanol 98:2
Sephadex LH 20, metanol
Kieselgel 60, chloroform/metanol 98:2
BE 879 402
WO 9 213 094
SANDOZ 1
FUJISAWA 1
GB 2 227 489
BIOGAL 1
CA 2 096 892
BIOGAL 1
Sephadex LH 20, metanol
Kieselgel 60, hexan/aceton 66:33 krystalizace, aceton, -15 °C
Kieselgel, hexan hexan/etylacetat, gradient aceton
Kieselgel 60,chloroform/metanol/ aceton 92:4:4
Kieselgel 60, hexan/aceton, gradient
Kieselgel 60,chloroforra/dichlormethan/etanol 48:50:2 chloroform/etylacetát/etanol 48:50:2 • ·· · · ·· · * · · • · · · · » · · · ·· ♦ • · · · · · · · · · • ··· · · · * ♦ ······ • · · · · · · ··» *· ·· ···· ·* ··
Krátký popis SMB - techniky lze najít například v R.M.
Nicoud, LC-GC INTL sv. 5, č. 5, str. 43 až 47. a K.K. Unger (red.), Handbuch der HPLC, díl 2, GIT Verlag, Darmstadt,
1994 ( viz také obr. 1).
Podstata vynálezu
Vycházíme-li ze zde nastíněného stavu techniky, vyplývají pro řešení chromatografického čistění cyklosporinu A s vysokými nároky na čistotu produktu a výtěžnost následující požadavky:
. Nový postup by měl produkovat více než 70% vloženého množství cyklosporinu A v kvalitě odpovídající evropskému lékopisu (PHARMEUROPA) (vztaženo stupně chromatograf ického čistění).
. Postup by měl dostačovat nejvyšším nárokům na roční výkon a zároveň drasticky snížit potřebu rozpouštědel a materiálu pro stacionární fázi.
. Technické řešení by mělo být jednoduché, rychlé a robustní, to znamená, že rozpouštědla a adsorbenty musí být pokud možno po dlouhou dobu opětovně použitelné. Tím odpadá také nasazení těžko nastavitelných popřípadě těžko regenerovatelných, isokraticky používaných směsí rozpouštědel a gradientů.
. Neměly by být používány chlorované uhlovodíky.
. Postup by měl mít možnost automatizace, to znamená poskytovat možnost kontinuálního provozu a zároveň vyhovovat požadavkům GMP produkce.
44 44 44 ·· ·· • ••4 4 4 4 4 4 44 4 · 4 44 4 4444
444 444 · 4 ·44 444
4 4 4 4 · »
444 44 ·· 4444 ·· ··
Jako výchozí bod pro chromatografické čistění slouží například surový extrakt, získaný pomocí známých metod (např. DD 295 872 A5) z cyklosporin A obsahujícího suchého mycelia extrakcí (etylacetát) a odstraněním tuků (petrolbenzen/metanol/voda), který vedle řady většinou neznámých žlutě a červeně zabarvených substancí a olejovitých produktů vykazuje například i následující složení cyklosporinů:
Cyklosporiny Nestandardizovaná relace
C 14,9
B 13,7
L 0,2
A 65,1
G 1,2
D 1,2 ostatní 3,7 ) ' ' HPLC-analyticke stanoveni podle evropského lékopisu (PHARMEUROPA, sv. 4, č. 4, str. 270 a dále)
V prvním stupni chromatografie jsou polární cyklosporiny (C, B, L, U) odděleny od nepolárních (G, D), takže vzniknou dvě hodnotné frakce, které kromě cyklosporinu A obsahují buď pouze polární nebo pouze nepolární znečištění. Proto může být v druhém stupni chromatografie cyklosporin A tohoto znečištění výhodně zbaven.
Podle vynálezu je ultračistění cyklosporinu A pomocí
4 4 4
4 4 4
4 4
4
(náhradní stráija}..
444 444 • 44 44 chromatografické metody čistění za použití konvenční HPLC v kombinaci s technikou simulované pohyblivé vrstvy (Simulated Moving Bed - SMB) prováděno následovně:
1. Chromatografie HPLC nebo SMB-technikou
2. Chromatografie SMB-technika
Viz schéma 1 až 4.
Přesněji řečeno vynález představuje způsob čistění cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů ze surového extraktu obsahujícího cyklosporin za použití chromatografického postupu se silikagelem jako adsorbentem, vyznačující se tím, že se cyklosporin A a příbuzné cyklosporiny separují ze surového extraktu obsahujícího cyklosporin za použití chromatografického postupu se silikagelem jako adsorbentem
a) v prvním stupni chromatografie pomocí preparativní HPLC nebo SMB-techniky surový extrakt frakčními kroky v oddělených koncentračních profilech rozdělí na hodnotnou frakci 1 obsahující nepolární doprovodné látky a hodnotnou frakci 2 obsahující doprovodné látky více polární a
b) hodnotná frakce 1 (rafinát) a hodnotná frakce 2 (extrakt) podrobí následnému druhému stupni chromatografie pomocí SMB-techniky.
Přitom lze první i druhý stupeň chromatografie provádět v systému normální fáze/etylacetát nebo obrácená fáze, acetonitril/voda.
Zejména nasazením SMB-techniky je dosaženo následujících výhod:
(náhradní strá>i4) ί ί X * ϊ X ϊ ϊ X • · 9 · · 9 9 · * · · · · · · • · · · · · ♦ «99 9« ·· *··· ·· ··
- 8 . Lze realizovat naprosto kontinuální pracovní proces, to znamená, že s novým způsobem chromatografie odpadnou diskrétní injekce substancí. Takováto kontinuálně pracující chromatografie je výhodná především pro průmyslové využití.
. SMB technika umožňuje práci s koncentrovanějšími roztoky než doposud. Tím klesnou náklady na rozpouštědla a zároveň se zkrátí čas nutný na jejich zpětné získávání.
Na základě těchto příznivých ekonomických parametrů se SMB-technika ve vzrůstajícím měřítku nasazuje také k chromatografickému dělení proteinů produkovaných biotechnologicky (Nadler T.K., Sch. Sci., Purdue Univ. East Lafayette, IN 479907, USA) a aminokyselin (Adachi S. se spolupracovníky, Agric. Biol. Chem. 55, 925-932 (1991)).
Také v předloženém případě čištění produktů obsahujících cyklosporin A by mohla být zjištěna převaha SMB ve srovnání s konvenčními chromatografickými způsoby.
·· ·
• * • 44 • t *· • · · · * · • · · · • · · ·· <*···
4« *· • 4 · · • 4 4 · • ·S 4 ··4 • 4 ·· (náhradní strana) - 8a . Srovnání SMB techniky s technikou HPLC
Fázový systém Parametr Poměr (SMB:HPLC) normální fázový spotřeba etylacetátu 0,7 systém spotřeba materiálu Si 60 0,25 produktivita 2,5 (g vložené/d/kg adsorbens) obrácený fázový spotřeba acetonitril/voda 0,15 systém spotřeba materiálu RP-18 0,15 produktivita 10 (g vložené/d/kg adsorbens)
Nejdůležitějším technickým předpokladem pro realizaci SMB-dělení je přesné nastavení různých dílčích toků (viz příklady), aby bylo možné zajistit takřka stacionární stav elučních front v závislosti na spínacích časech.
Dále je pro optimální nastavení SMB-dělení nutná přesná znalost adsorpční isotermy žádaného produktu stejně jako φφφ • ·· • · · · • · · • φ·· · • · • ΦΦ ·· znečisťujících látek v používaném chromatografickém systému. Toto musí být předem analyticky stanoveno.
Také se, díky zavedení takzvané páté zóny, podařilo vypustit obvyklé dvoukomponentní dělení klasické čtyřzónové SMB.
Pomocí promývacího systému instalovaného v přídavné zóně je umožněna souběžná eliminace znečistění, která ve vztahu k cyklosporinu A vykazuje vysoké hodnoty k'. Tím je dosaženo dalšího zvýšení kvality produktu.
Obvykle mohou být standartní SMB-technikou dobře rozděleny směsi s hodnotami k' mezi 0,6 a 2,0 (k'=l odpovídá žádanému produktu). Avšak běžně jsou komponenty, které leží mimo toto rozmezí, odstraněny pouze neúplně, takže dojde k obohacení v rafinátu oproti vloženému materiálu (feed) (obr. 1).
Při přepínání mezi čtvrtou a první zónou se podle nově vynalezeného postupu kolony dostanou do definovaného stavu promýváním rozpouštědlem o silné eluční síle (např. metanol). Příslušné kolony aparatury, které se nacházejí v této páté zóně, jsou tak po dobu jednoho taktu úplně vyřazeny z uzavřeného kruhu ostatních čtyř zón (obr. 1).
Tato pátá zóna je rozdělena do dvou dílčích kroků:
1. Během trvání prvního dílčího kroku se kolony páté zóny propláchnou vhodným rozpouštědlem o vysoké eluční síle, aby se stacionární fáze očistila od zbylých nečistot.
Jako promývací prostředek je přednostně využíván metanol. V případě promývání RP-materiálu může být nasazen čistý acetonitril, čímž se díky odpadnutí
• *· • · · | ·· | ·· • · | ·· * · · | |
• | • | |||
• · ·· · | • | • | • | • ··· |
• · »« ·· | • • · | • | • ···· | • ·· |
jednoho přídavného rozpouštědla zjednoduší problém zpětného získávání rozpouštěcích prostředků.
2. Ve druhém dílčím kroku se promývacím prostředkem oplachuje eluční prostředek nutný pro oddělování.
Jsou-li kolony rozděleny do zón tak, že se jich v páté zóně nachází víc, může být promývací proces zintenzivněn, když se tyto kolony během promývání zapojí paralelně.
Další optimalizace postupu bylo dosaženo při ultračistění takzvané hodnotné frakce 2 prvního stupně chromatografie.
Tato frakce obsahuje kromě cyklosporinu A především polární nečistoty jako cyklosporin U a L. Zde bylo překvapivě zjištěno, že tato hodnotná frakce 2 může být velmi dobře oddělena po záměně místa odběru pro extrakt a rafinát na SMB-zařízení. Přitom jsou polární nečistoty eluovány před hodnotným produktem, cyklosporinem A, to znamená, že vykazují kratší retenční časy. Toto znamená, že při použití tohoto speciálního SMB-režimu ve druhém stupni chromatografie pak lze v tomto stupni pracovat se systémem RP-18, čímž se velmi zjednoduší zpětné získávání rozpouštěcích prostředků (schéma 1).
Výchozí substance použité v následujících třech příkladech, které dokládají vhodnost SMB-techniky pro druhý stupeň chromatografié, odpovídají svým profilem znečistění typickým hodnotným frakcím vzniklým z prvního stupně chromatografie při použití konvenční preparativní HPLC.
Příklady provedení vynálezu
V příkladu 1 se demonstruje ultračistění meziproduktu prvního ·· w · · · · ·♦ ·· • · · · * • · · e • · · · • · · • · · • · ·
stupně chromatografie pomocí SMB-techniky v běžném fázovém systému Si 60/etylacetát. Použitá látka obsahuje kromě cyklosporinu A převážně polárnější nečistoty.
Jako výsledek lze pozorovat zřetelné ochuzení polárních cyklosporinů (zejména U a L stejně jako B a C), tím se zdůrazní principielní vhodnost dělícího systému ve spojení se SMB-technikou.
Příklad 2 popisuje ultračistění meziproduktu, který jako hodnotnou frakci 1 obsahuje převážně nepolární nečistoty, pomocí SMB-techniky v systému obrácené fáze RP-18/ acetonitril, voda (60:40, objemově). Po dělení SMB lze pozorovat zřetelné ochuzení nepolárních cyklosporinů (především G a D).
V příkladu 3 se popisuje ultračistění meziproduktu, který obsahuje hodnotnou frakci 1 s nepolárním znečištěním, pomocí SMB-techniky v systému normální fáze/etylacetát.
Ve srovnání s příkladem 1 se při'záměně míst odběru pro extrakt/rafinát dosáhne výraznějšího ochuzení nepolárních nečistot, a také úspory rozpouštěcích prostředků.
Možnost takto jemného dělení je do té míry překvapivá, protože v minulých letech nebylo ani pomocí analytické HPCL možné tyto chromatograficky výjimečně podobné doprovodné substance od-cyklosporinů A oddělit.
Získaný cylosporin A odpovídá po rekrystalizaci požadavkům na kvalitu jak USP XXIII, tak evropského lékopisu (EUROPEAN PHARMACOPOEIA, 2. vydání, 1995).
- 12 ·· . 1
t v
• · · ·>
Přehled obrázku na výkrese
Schéma principu pětizónové SMB je uvedeno na obr. 1.
Popis obrázku 1
Tekutý prostředek je veden v kruhu mezi zónami 1 a 4. Přidání vzorku se děje mezi zónami 2 a 3.· Čerstvý eluent se přidává mezi zónami 4. a .1. Rafinát (cyklosporin A) se odebírá mezi zónami 3 a 4 a extrakt (cyklosporin A + nečistoty) mezi zónou 1 a 2. Každá kolona je opatřena čtyřmi ventily pro přidání substance (feed), eluent, extrakt (hodnotný produkt + nečistoty), a rafinát (hodnotný produkt). Pohyb nosného materiálu je simulován posunem sběrných a vstupních bodů proti směru eluce. Tím se docílí kontinuální rozložení substance mezi fázemi v systému kolon a koncentrace eluátu se na sběrných bodech zdají konstantním
Dále bylo v pokusném testu překvapivě zjištěno, že oddělení vedlejších cyklosporinů U a L na jedné straně a G a D na druhé straně se daří lépe SMB technikou než konvenční chromatografií a zároveň jsou v jednotlivých stupních dosažitelné vyšší výtěžky. Z toho vyplývá, že je při srovnatelné produktivitě možné využit menších zařízení, která mají také menší spotřebu náplně kolon a elučních prostředků.
Principielně je možné využít SMB techniky také v prvním stupni chromátografie (schéma 3). Přitom může být v podstatě za použití vhodných surových extraktů (s malým obsahem balastních látek především lipofilního charakteru) provedeno SMB dělení také v prvním stupni v systému obrácená fáze/acetonitril, voda (schéma 4). Jak bylo dále zjištěno, mohou být po záměně pozic rafinátu a extraktu v systému • *
- 13 obrácená fáze/acetonitril, voda od cyklosporinu A odděleny také polární nečistoty. Proto je také možné provést čistění cyklosporinu A za použití systému obrácená fáze/acetonitril, voda dvoustupňové pomocí SMB techniky nebo mohou být také nepolární nečistoty odděleny od cyklosporinu A systémem normální fáze/etylacetát po záměně pozic rafinátu a extraktu; je také potom možné provést čistění cyklosporinu A za použití systému normální fáze/etylacetát dvoustupňové pomocí SMB techniky.
Schéma 1 . ‘ cyklosporin A - surový extrakt
V
1. chromatografický konv. prep. HPLC | stupeň | Kieselgel Si 60 'etylacetát | |
Hodnotná frakce 1 nepolární Cy A + Cy G, Cy D atd. | Hodnotná frakce 2 polární Cy A + Cy Cy U atd. | ||
5' | y | ||
2. chromatografický | stupeň | Si 60 | Si 60 |
SMB | etylacetát | etylacetát |
Schéma 2
1. chromatograf. stupeň konv. prep. HPLC
2. chromatograf. stupeň SMB ·· » « »
·« cyklosporin A - surový extrakt
Hodnotná frakce 1 nepolární Cy A + Cy Cy D atd.
Kieselgel Si 60 etylacetát
Hodnotná frakce 2 polární
G, . Cy A + Cy L,
Cy U atd.
RP-18 Si 60 acetonitril, voda etylacetát nebo po záměně pozic extrakt/rafinát: RP-18/ acetonitril, voda » · a *·
Schéma 3 *· »4» ·· • ta··* i « a · * 5 · «« < a ·* cyklosporin A - surový extrakt
1»
1. chromatograf. SMB | stupeň | Si 60 etylacetát | |
Rafinát Cy A + nepolární nečistoty | Extrakt obohacení polárních nečistot (příklad 1) | ||
2. chromatograf. | stupeň | RP-18 | |
SMB ' | acetonitril, | voda | |
Rafinát | Extrakt | ||
Cy A | obohacení | ||
nepolárních | |||
nečistot | |||
(příklad 2) |
• · * · i
• · « i ··
4·
Schéma 4 cyklosporin A - surový extrakt v
1 chromatograf. stupeň SMB | RP-18 | |
Rafinát Cy A + polární nečistoty | Extrakt obohacení nepolárních nečistot (příklad 2) | |
'5 | ||
2. chromatograf. stupeň | RP-18 | |
SMB | acetonitril, | voda |
Rafinát | Extrakt | |
obohacení | Cy A | |
polárních nečistot |
• · * · · «ι · 8 · 9 I * 4 « · · 9 · >· «· «· «·· ··
-- *
Á · · · « Μ» * 8· • e « » .· ·
Příklad 1
Oddělení převážně polárních cyklosporinů (cyklosporiny C, B, L, U) od cyklosporinu A ve druhé chromatografii pomocí SMB
techniky v systému | normální fáze/etylacetát. | |
Zařízení | LiChrosep(R) 8-50, pilotní zařízení | |
Kolona | 8 kolon, délka 100 mm x 50 mm vnitřní průměr axiální komprese | |
Stacionární fáze | LiChrosespher'R' Si 60, 15 μπι | |
Mobilní fáze | etylacetát | |
Surová substance | # 011194 cyklosporin | čistota |
C | 2,3 | |
B | 6,9 | |
L | 0,7 | |
U | 1,2 | |
A | 86,2 | |
G | 1,0 | |
D | 0,1 | |
souhrn znečistění | 13,8 % | |
Vklad substance | roztok v etylacetátu 5,8 g/1 | |
Vkládaný materiál | 5,3 ml/min | |
Eluent | 100 ml/min | |
Recyklace | 151 ml/min | |
Detekce Výsledky | HPLC - analýza v proudu extraktu a | rafinátu |
9 9 · * » ·* *·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9*99
99999 9 Λ 9 999999 • 9 9 9 9 9 9
9»9 9.9. 99 · · ·# * · ♦ ·
- 18 Rafinát
Extrakt cyklosporiny
C
B
L
U
A
G
D souhrn znečistění výtěžnost, cyklosporin A:
cyklosporin A souhrn znečistění čistota [%] 0,2 0,4 0,0 0,4
97,4 1,1 0,1 2,6 % >95 %
75.5 %
24.5 %
Výsledek pokusu ukazuje principielní možnost oddělení převážně polárních nečistot z cyklosporinu A v systému Si 60/etylacetát.
ť ··
9 «9 ·· • 9 · 9 · • « 9·· 999
9 · •999 ·· *9
Příklad 2
Oddělení převážně nepolárních cyklosporinů (cyklosporiny G, D) od cyklosporinů A pomocí SMB techniky v systému RP-18/acetonitril, voda.
Zařízení | LiChrosep(R) 8-50, pilotní | zařízení |
Kolona | 8 kolon, délka 100 mm x 50 mm | vnitřní průměr |
axiální komprese | ||
Stacionární fáze | LiChrospherRP-18, 15 um | |
Mobilní fáze | acetonitril/voda - 60/40, objemově | |
Surová substance | # 251094 cyklosporiny | čistota [% |
L | 0,3 | |
U | 0,8 | |
A | 92,5 | |
G | 4,1 | |
D | 1,6 | |
souhrn znečistění | 7,5 % | |
Přívod substance | roztok v acetonitrilu | |
Vkládaný materiál | i g/i | |
12,7 ml/min | ||
Eluent | 81 ml/min | |
Recyklace | 151 ml/min | |
Detekce | HPLC analýza v proudu extraktu | a rafinátu |
Výsledky | ||
Rafinát | cyklosporiny | čistota [% |
neznámé (a =3,4) 0,1
L | 0,2 | |
U | 0,5 | |
A | 99,1 | |
G | 0,0 | |
D | 0,0 |
neznámé (a =20,1) 0,1 ··« · · * * * * * ·>· ·· * ♦ ··· • 999 9 9 9 9 ¢ 99 9 9 99 • « 9 · 4 · · « « « » · 49 999 9 9 9 ·9 souhrn znečistění 0,9 % obsah, cyklosporin A (sušina) 99,4 % stupňová výtěžnost, cyklosporin A >95 %
V pokusu dosažená čistota rafinátu činí 99,1 % . Po usušení této substance byl stanoven obsah cyklosporinu A na 99,4
Výsledek ukazuje možnost oddělení nepolárních nečistot od cyklosporinu A v systému RP-18/acetonitril, voda (60:40, objemově).
Příklad 3
Oddělení převážně nepolárních cyklosporinu (cyklosporiny C, G, D) od cyklosporinu A ve druhé chromatografií pomocí SMB
techniky v systému normální fáze/etylacetát při záměně místa odběru pro extrakt a rafinát. | ||
Zařízení | LiChrosep^R) 12 - | 96, pilotní zařízení |
Kolona | 8 kolon, délka 100 axiální komprese | mm x 26 mm vnitřní průměr, |
Stacionární fáze | LiChrospher(R) | Si 60, 15 - 25 μπι |
Mobilní fáze | etylacetát | |
Surová substance | cyklosporiny | čistota [%] |
C | 0,04 | |
B | 0,122 | |
L | 0,075 | |
A | 92,462 | |
G | 2,934 | |
D | 4,177 | |
souhrn znečistění | 7,538 % |
«· · • *
Přívod substance Vkládaný materiál Eluent
Detekce
Výsledky
Extrakt roztok v etylacetátu 28 g/1
1,5 ml/min
16,4 ml/min
HPLC analýza v proudu extraktu a rafinátu cyklosporiny
C
B
L
A neznámé
G souhrn znečistění výtěžnost, cyklosporin A čistota [%] 0,02 0,075 0,063
99,364 0,219 0,175 0,636 % >95 %
Výsledek ukazuje, že pomocí výše zmíněného režimu zapojení SMB technikou mohou být v systému Si 60/etylacetát velmi dobře odděleny také nepolární nečistoty.
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob čistění cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů z cyklosporin A obsahujícího surového extraktu, který využívá chromátogafický postup se silikagelem jako adsorbentem, vyznačující se tím, že sea) v prvním stupni chromatografie pomocí preparativní HPLC nebo techniky simulated moving bed surový extrakt frakčních kroků v odělených koncentračních profilech rozdělí na nepolární doprovodné látky obsahující hodnotnou frakci 1 a polárnější látky obsahující hodnotnou frakci 2 ab) hodnotná frakce 1 (rafinát) a hodnotná frakce 2 (extrakt) v následujícím druhém stupni chromatografie podrobí dalšímu čistění pomocí SMB techniky.
- 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m, že sea) jak pryní, tak také druhý stupeň chromatografie provádí v systému normální fáze/etylacetát nebo obrácená fáze/ acetonitril, voda,b) hodnotná frakce 1 (rafinát) pomocí SMB techniky v systému obrácená fáze, acetonitril/voda a hodnotná frakce 2 (extrakt) podrobí druhému stupni chromatografie v systému normální fáze/etylacetát,c) hodnotná frakce 2 (extrakt) pomocí SMB techniky v systému obrácená fáze/acetonitril, voda a hodnotná frakce 1 (rafinát)
• • · • · 9 • a • · 44 • • · t> 9 • « 9 4 • 4 · • 4 4 • 9 * 4 • 4 4 » · 4 « 4 9 9 4 4 4 * podrobí druhému stupni chromatografie v systému normální fáze/etylacetát. - 3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se zavedením páté zóny provede promývání nejprve alkoholem a následně tekutým prostředkem a že se více kolon v páté zóně takto promývá v paralelním zapojení.
- 4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se dělení ve druhém stupni chromatografie provádí v systému obrácená fáze acetonitril/voda v poměru acetonitril/voda 40 až 80 k 20 až 60, přednostně 60:40, kde poměry jsou uvedeny objemově.
- 5. Způsob podle nároku la2, vyznačující se tím, že se kolony a tekutý prostředek v SMB zařízení udržují v rozmezí teplot od 40 do 80 °C, přednostně ale při 60 °C.
- 6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se v systému obrácená fáze/acetonitril, voda hodnota pH tekutého prostředku nastavuje v rozmezí 2 až 5, přednostně ale na 3.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1996111094 DE19611094C2 (de) | 1996-03-21 | 1996-03-21 | Verfahren zur Reinigung von Cyclosporin A und/oder verwandten Cyclosporinen aus einem Cyclosporin-haltigen Rohextrakt unter Anwendung chromatographischer Verfahren mit Kieselgel als Adsorbens |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ299998A3 true CZ299998A3 (cs) | 1999-10-13 |
CZ293243B6 CZ293243B6 (cs) | 2004-03-17 |
Family
ID=7788939
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19982999A CZ293243B6 (cs) | 1996-03-21 | 1997-03-14 | Způsob chromatografického získávání velmi čistého cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6306306B1 (cs) |
EP (1) | EP0888382B1 (cs) |
JP (1) | JP3408818B2 (cs) |
KR (1) | KR100467127B1 (cs) |
CN (1) | CN1196711C (cs) |
AT (1) | ATE210146T1 (cs) |
CZ (1) | CZ293243B6 (cs) |
DE (3) | DE19611094C2 (cs) |
DK (1) | DK0888382T3 (cs) |
ES (1) | ES2169384T3 (cs) |
HK (1) | HK1015382A1 (cs) |
HU (1) | HU222200B1 (cs) |
IL (1) | IL125807A (cs) |
NO (1) | NO321570B1 (cs) |
PL (1) | PL187763B1 (cs) |
PT (1) | PT888382E (cs) |
RU (1) | RU2163607C2 (cs) |
SK (1) | SK282836B6 (cs) |
WO (1) | WO1997034918A1 (cs) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19858892A1 (de) | 1998-12-19 | 2000-06-21 | Merck Patent Gmbh | Kontinuierliches Verfahren zur Trennung von Stoffen nach Molekülgröße |
WO2000040219A1 (en) | 1998-12-30 | 2000-07-13 | Dexcel Ltd. | Dispersible concentrate for the delivery of cyclosporin |
US7732404B2 (en) | 1999-12-30 | 2010-06-08 | Dexcel Ltd | Pro-nanodispersion for the delivery of cyclosporin |
PL210795B1 (pl) | 2001-10-19 | 2012-03-30 | Isotechnika Inc | Sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E), sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (Z), sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (Z) ISATX247 i sposób wytwarzania mieszaniny izomerów ISATX247 |
US6843854B2 (en) | 2002-05-31 | 2005-01-18 | Purdue Research Foundation | Method and apparatus for separating a component from a mixture |
SI1545574T1 (sl) * | 2002-09-13 | 2014-10-30 | Biogen Idec Inc. | Postopek za čiščenje polipeptidov s simulirano "moving bed" kromatografijo |
CN1763084B (zh) * | 2005-10-11 | 2010-04-21 | 山东新时代药业有限公司 | 高纯度环孢菌素a的制备方法 |
EP2151450A1 (de) | 2008-07-29 | 2010-02-10 | Sandoz AG | Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden |
CN102086226B (zh) * | 2009-12-04 | 2012-10-10 | 山东新时代药业有限公司 | 一种制备环孢菌素a的方法 |
US9428711B2 (en) | 2013-05-07 | 2016-08-30 | Groupe Novasep | Chromatographic process for the production of highly purified polyunsaturated fatty acids |
US8802880B1 (en) | 2013-05-07 | 2014-08-12 | Group Novasep | Chromatographic process for the production of highly purified polyunsaturated fatty acids |
EP3118186B1 (fr) | 2013-12-11 | 2022-02-09 | Novasep Process | Installation chromatographique de production d acides gras polyinsatures |
US10975031B2 (en) | 2014-01-07 | 2021-04-13 | Novasep Process | Method for purifying aromatic amino acids |
HUP1500502A2 (en) * | 2015-10-26 | 2017-04-28 | Rotachrom Tech Kft | Process for the purification of cyclosporin-a |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB568698A (en) | 1943-05-26 | 1945-04-17 | M O Valve Co Ltd | Improvements in the capping of thermionic valves, electric lamps and like devices |
US2985589A (en) * | 1957-05-22 | 1961-05-23 | Universal Oil Prod Co | Continuous sorption process employing fixed bed of sorbent and moving inlets and outlets |
US4117118A (en) | 1976-04-09 | 1978-09-26 | Sandoz Ltd. | Organic compounds |
US4215199A (en) | 1978-06-05 | 1980-07-29 | Sandoz Ltd. | Antibiotic production |
SE448386B (sv) | 1978-10-18 | 1987-02-16 | Sandoz Ag | Nya cyklosporinderivat, forfarande for framstellning av dem samt farmaceutisk komposition innehallande dem |
US4402832A (en) * | 1982-08-12 | 1983-09-06 | Uop Inc. | High efficiency continuous separation process |
US4923616A (en) * | 1987-09-24 | 1990-05-08 | Mitsubishi Petrochemical Company, Ltd. | Method of separating chemical components in simulated moving bed |
HU201577B (en) | 1988-12-20 | 1990-11-28 | Gyogyszerkutato Intezet | Process for producing cyclosporin antibiotics |
DE69222150T2 (de) * | 1991-01-25 | 1998-01-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Prozess zur produktion von cyclosporin-a und/oder c |
HU213553B (en) | 1992-05-25 | 1997-07-28 | Biogal Gyogyszergyar | Process for isolating of cyclosporin-a |
US5709797A (en) * | 1996-06-05 | 1998-01-20 | Poli Industria Chimica S.P.A. | Method of isolating cyclosporins |
-
1996
- 1996-03-21 DE DE1996111094 patent/DE19611094C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-03-14 CZ CZ19982999A patent/CZ293243B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-03-14 KR KR10-1998-0707580A patent/KR100467127B1/ko active IP Right Grant
- 1997-03-14 ES ES97920517T patent/ES2169384T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-14 SK SK1222-98A patent/SK282836B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-03-14 HU HU9901801A patent/HU222200B1/hu active IP Right Grant
- 1997-03-14 DE DE59705670T patent/DE59705670D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-14 EP EP97920517A patent/EP0888382B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-14 PT PT97920517T patent/PT888382E/pt unknown
- 1997-03-14 RU RU98119067/12A patent/RU2163607C2/ru active
- 1997-03-14 WO PCT/DE1997/000525 patent/WO1997034918A1/de active IP Right Grant
- 1997-03-14 PL PL32911397A patent/PL187763B1/pl unknown
- 1997-03-14 JP JP53303697A patent/JP3408818B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-14 CN CNB971927049A patent/CN1196711C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-14 IL IL12580797A patent/IL125807A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-03-14 AT AT97920517T patent/ATE210146T1/de active
- 1997-03-14 DK DK97920517T patent/DK0888382T3/da active
- 1997-03-21 US US08/821,823 patent/US6306306B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-18 DE DE19716167A patent/DE19716167C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-09-08 NO NO19984133A patent/NO321570B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-02-10 HK HK99100547A patent/HK1015382A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6306306B1 (en) | 2001-10-23 |
EP0888382B1 (de) | 2001-12-05 |
CZ293243B6 (cs) | 2004-03-17 |
IL125807A (en) | 2003-10-31 |
DE19716167C2 (de) | 2000-06-29 |
RU2163607C2 (ru) | 2001-02-27 |
HU222200B1 (hu) | 2003-05-28 |
KR20000064784A (ko) | 2000-11-06 |
NO984133D0 (no) | 1998-09-08 |
SK122298A3 (en) | 1999-08-06 |
NO984133L (no) | 1998-09-08 |
HUP9901801A3 (en) | 2001-01-29 |
SK282836B6 (sk) | 2002-12-03 |
HUP9901801A2 (hu) | 1999-09-28 |
DE59705670D1 (de) | 2002-01-17 |
CN1196711C (zh) | 2005-04-13 |
DE19611094C2 (de) | 1999-06-17 |
ATE210146T1 (de) | 2001-12-15 |
NO321570B1 (no) | 2006-06-06 |
DE19716167A1 (de) | 1998-10-22 |
KR100467127B1 (ko) | 2005-05-27 |
PL329113A1 (en) | 1999-03-15 |
PL187763B1 (pl) | 2004-10-29 |
JP2000507237A (ja) | 2000-06-13 |
DE19611094A1 (de) | 1997-09-25 |
DK0888382T3 (da) | 2002-04-02 |
HK1015382A1 (en) | 1999-10-15 |
JP3408818B2 (ja) | 2003-05-19 |
PT888382E (pt) | 2002-05-31 |
WO1997034918A1 (de) | 1997-09-25 |
IL125807A0 (en) | 1999-04-11 |
EP0888382A1 (de) | 1999-01-07 |
CN1212703A (zh) | 1999-03-31 |
ES2169384T3 (es) | 2002-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Omata et al. | A rapid and efficient method to prepare chlorophyll a and b from leaves | |
CZ299998A3 (cs) | Způsob chromatografického získávání velmi čistého cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů | |
KR20090080110A (ko) | 순수형태의 라파마이신 그리고 그의 회수 및 정제 방법 | |
CZ285518B6 (cs) | Způsob čištění cyklosporinu A | |
RU98119067A (ru) | Хроматографический способ получения высокочистого циклоспорина a и родственных циклоспоринов | |
Chicarelli et al. | High-performance liquid chromatographic analysis of free-base porphyrins: II. Structure effects and retention behaviour | |
US6706192B2 (en) | Purification process | |
EP0920447B1 (en) | Process of purification of cyclosporin | |
Báthori et al. | Preparative scale purification of shidasterone, 2-deoxy-polypodine B and 9α, 20-dihydroxyecdysone from Silene italica ssp. nemoralis | |
RU1655115C (ru) | Способ выделения циклоспорина а | |
KR100496929B1 (ko) | 시클로스포린의정제방법 | |
Strickler et al. | Strategy for the preparative-scale high-performance liquid chromatographic isolation of kadsurenone and futoquinol from the medicinal plant Piper futokadsura | |
HRP980604A2 (en) | Purification process | |
Sogn et al. | Separation of amino acid mixtures enriched in stable isotopes | |
Eng et al. | Purification of neuropeptides: Cholecystokinin and vasoactive intestinal peptide | |
KR960031583A (ko) | 신규의 c_22 지방산락톤 유도체 및 그 추출방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20170314 |