CZ293243B6

CZ293243B6 - Způsob chromatografického získávání velmi čistého cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů

Info

Publication number: CZ293243B6
Application number: CZ19982999A
Authority: CZ
Inventors: Ullrich Voigt; Roland Hempel; Joachim Kinkel; Roger-Marc Nicoud
Original assignee: Arzneimittelwerk Dresden Gmbh
Priority date: 1996-03-21
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 2004-03-17
Also published as: EP0888382A1; DE19611094A1; EP0888382B1; ES2169384T3; JP2000507237A; IL125807A0; CN1212703A; NO984133L; DE19611094C2; DE19716167C2; KR100467127B1; ATE210146T1; PT888382E; JP3408818B2; US6306306B1; HK1015382A1; IL125807A; DE19716167A1; WO1997034918A1; RU2163607C2

Abstract

Předložené řešení se týká nového chromatografického způsobu, který je vhodný k čistění cyklosporiny obsahujících surových extraktů v průmyslovém měřítku. Přitom jsou konvenční preparativní chromatografické dělicí metody úplně nebo alespoň částečně nahrazeny metodou "technicky napodobující pohyblivé lože (SMB)". Získaný cyklosporin A odpovídá požadavkům na kvalitu.ŕ

Description

Způsob chromatografického získávání velmi čistého cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů

Oblast techniky

Tento vynález se týká nového způsobu chromatografického čištění cyklosporinu A (Cy A) a příbuzných cyklosporinů, který je vhodný pro použití ve farmaceutickém průmyslu.

Přitom jsou účinné látky získávány za ekonomicky výhodných podmínek v dostatečné čistotě pro farmaceutické potřeby, to znamená, že například v případě cyklosporinu A jsou dodrženy požadavky na čistotu podle evropského lékopisu (PHARMAEUROPA svazek 4, číslo 4, strana 270, prosinec 1992).

Dosavadní stav techniky

S úspěšnou izolací cyklosporinu A z Trichoderma polysporum (LINK EX PERS.) Rafai A. Růeggerem a spolupracovníky [Helv. Chim. Acta 59, 112 (1976)] byl poprvé otevřen přístup k nové skupině silně imunosupresivních látek. Díky intenzivnímu výzkumu bylo zatím objeveno více než 25 příbuzných cyklosporinů s imunosupresivním a antifungálním účinkem [R. Traber a kolektiv, Helv. Chim. Acta 70.13 (1987)].

Dnes je stěžejní význam cyklosporinu A jako prostředku volby při potlačování imunitní odpovědi po orgánových transplantacích nesporný. V důsledku toho nechyběla v minulosti snaha o to se zlepšením výrobního postupu vyrovnat se se stále stoupajícími nároky na množství a kvalitu tohoto život zachraňujícího léku.

Dosud známé technické řešení čištění cyklosporin A obsahujících surových extraktů zahrnují většinou několik stupňů chromatografie za použití organických rozpouštědel jako elučních prostředků.

Ve výše zmíněné práci A. Riieggera byla nejdříve prováděna chromatografie na silikagelu Kieselgel 60 Měrek (0,063 až 0,2 mm) jako absorbentu s chloroformem při stoupajícím množství methanolu. Následovně byl získán produkt podroben gelové chromatografii na Sephadex LH 20 v methanolu a poté chromatografii na oxidu hlinitém (Brockmann, Akt. I) v toluenu se stoupajícím podílem ethylacetátu.

Podobné postupy používají i pozdější práce (tabulka 1). Hojně využití našly adsorbenty Sephadex LH 20, Kieselgel 60 Měrek (0,063 až 0,2 mm) a oxid hlinitý. Jako tekuté fáze byly většinou použity směsi organických rozpouštědel.

Z důvodu vysoké toxicity, vzhledem ke zbylým stopám rozpouštědel v účinné látce, a také, jak z tohoto vyplývá, kvůli bezpečnostně technickým problémům při zpracování větších množství těchto látek (destilace, odstraňování) jsou chloroform a metylenchlorid nevhodné.

Dále při použití gradientů nebo složitějších, například temámích izokratických směsí, je nové nastavení tekuté fáze po destilaci eluátů zdlouhavé a drahé.

Podobně lze hodnotit i metodu popsanou firmou BIOGAL v kanadském patentu CA 2 096 892, při které je surový extrakt před chromatografií podroben tepelnému zpracování. Polotovar je zde zahříván asi 1 hodinu na přibližně 110 °C a následně více než 5 hodin chlazen na teplotu místnosti. Při nasazení vysokého podílu chlorovaných uhlovodíků je ve dvou po sobě jdoucích jednostupňových chromatografických postupech na silikagelu Kieselgel 60 jako absorbentu izolováno asi 15 % podaného množství cyklosporinu A o čistotě asi 97,6 %. Tento výsledek však

-1 CZ 293243 B6 vzhledem k velikosti výtěžku a čistotě získané účinné látky není s ohledem na průmyslové využití uspokojivý. Mimo to by tyto složité přírodní látky neměly být vystavovány teplotním změnám kvůli své teplotní nestabilitě a možné izomerizaci.

Podle dosavadního stavu znalostí se zdají jako vhodné pouze přihlášené postupy firem FUJISAWA (WO 9 213 094) a BIOGAL (CA 2 096 892) a jednostupňovým chromatografickým čištěním. K tomu je však nutná nákladná kombinace tekutých fází popřípadě gradient, což regeneraci tekuté fáze ztěžuje.

K přesnějšímu posouzení těchto postupů však často chybí údaje o jejich výtěžnosti a dosahované čistotě produktů.

Příklady některých dosud známých metod chromatografíckého čištění cyklosporinu A.

Patent	Firma	Stupně čištění
US4 117 118	SANDOZ	1. Sephadex LH, metanol 2. neutrální oxid hlinitý, toluen/etylacetát, gradient 3. Kieselgel 60, chloroform/metanol 98 : 2
US 4 215 199	SANDOZ	1. Kiesegel 60, chloroform/metanol 98 : 2 2. Sephadex LH 20, metanol 3. Kiesegel 60, chloroform/metanol 98 : 2
BE 879 402	SANDOZ	1. Sephadex LH 20, metanol 2. Kiesegel 60, hexan/aceton 66 : 33 3. krystalizace, aceton, -15 °C
WO 9 213 094	FUJISAWA	1. Kiesegel, hexan, hexan/etylacetát, gradient, aceton
GB 2 227 489	BIOGAL	1. Kiesegel 60, chloroform/metanol/ aceton 92 : 4 : 4 2. Kiesegel 60, hexan/aceton, gradient
CA 2 096 892	BIOGAL	1. Kieselgel 60, chloroform/dichlormethan/etanol 48 : 50 : 2 chloroform/etylacetát/etanol 48 : 50 :2

Krátký popis SMB - techniky lze najít například v R.M. Nicoud, LC-GC INTL sv. 5, č. 5, str.

až 47. a K.K. Unger (red.), Handbuch der HPLC, díl 2, GIT Verlag, Darmstadt, 1994 (viz také obr. 1).

Podstata vynálezu

Vycházíme-li ze zde nastíněného stavu techniky, vyplývají pro řešení chromatografíckého čištění cyklosporinu A s vysokými nároky na čistotu produktu a výtěžnost následující požadavky:

• Nový postup by měl produkovat více než 70 % vloženého množství cyklosporinu A v kvalitě odpovídající evropskému lékopisu (PHARMEUROPA) (vztaženo stupně chromatografíckého čištění).

• Postup by měl dostačovat nejvyšším nárokům na roční výkon a zároveň drasticky snížit potřebu rozpouštědel a materiálu pro stacionární fázi.

-2CZ 293243 B6 • Technické řešení by mělo být jednoduché, rychlé a robustní, to znamená, že rozpouštědla a adsorbenty musí být pokud možno po dlouhou dobu opětovně použitelné. Tím odpadá také nasazení těžko nastavitelných popřípadě těžko regenerovatelných, izokraticky používaných směsí rozpouštědel a gradientů.

• Neměly by být používány chlorované uhlovodíky.

• Postup by měl mít možnost automatizace, to znamená poskytovat možnost kontinuálního provozu a zároveň vyhovovat požadavkům produkce s řádně fungující praxí.

Jako výchozí bod pro chromatografické čištění slouží například surový extrakt, získaný pomocí známých metod (např. DD 295 872 A5) z cyklosporin A obsahujícího suchého mycelia extrakcí (etylacetát) a odstraněním tuků (petrolbenzen/metanol/voda), který vedle řady většinou neznámých žlutě a červeně zabarvených substancí a olejovitých produktů vykazuje například i následující složení cyklosporinů:

Cyklosporiny	Nestandardizovaná relace
C B L A G D ostatní	14,9 13.7 0,2 65,1 1,2 1,2 3.7

HPLC-analytické stanovení podle evropského lékopisu (PHARMAEUROPA svazek 4, číslo 4, strana 270 a dále)

V prvním stupni chromatografie jsou polární cyklosporiny (C, B, L, U) odděleny od nepolárních (G, D), takže vzniknou dvě hodnotné frakce, které kromě cyklosporinů A obsahují buď pouze polární nebo pouze nepolární znečištění. Proto může být v druhém stupni chromatografie cyklosporin A tohoto znečištění výhodně zbaven.

Podle vynálezu je ultračištění cyklosporinů A pomocí chromatografické metody čištění za použití obvyklé vysokotlaké kapalinové chromatografie v kombinaci s technikou simulované pohyblivé vrstvy (Simulated Moving Bed - SMB) prováděno následovně:

1. Chromatografie HPLC nebo SMB-technikou

2. Chromatografie SMB-technika viz schéma 1 až 4.

Přesněji řečeno vynález představuje způsob čištění cyklosporinů A a příbuzných cyklosporinů ze surového extraktu obsahujícího cyklosporin za použití chromatografického postupu se silikagelem jako adsorbentem, vyznačující se tím, že se cyklosporin A a příbuzné cyklosporiny separují ze surového extraktu obsahujícího cyklosporin za použití chromatografického postupu se silikagelem jako adsorbentem

a) v prvním stupni chromatografie pomocí preparativní HPLC nebo SMB-techniky surový extrakt frakčními kroky v oddělených koncentračních profilech rozdělí na hodnotnou frakci 1 obsahující nepolární doprovodné látky a hodnotnou frakci 2 obsahující doprovodné látky více polární a

-3CZ 293243 B6

b) hodnotná frakce 1 (rafinát) a hodnotná frakce 2 (extrakt) podrobí následnému druhému stupni chromatografie pomocí SMB-techniky.

Přitom lze první i druhý stupeň chromatografie provádět v systému normální fáze/etylacetát nebo reverzní fáze, acetonitril/voda.

Zejména nasazením SMB-techniky je dosaženo následujících výhod:

• Lze realizovat naprosto kontinuální pracovní proces, to znamená, že s novým způsobem chromatografie odpadnou diskrétní injekce substancí. Takováto kontinuálně pracující chromatografie je výhodná především pro průmyslové využití.

• SMB technika umožňuje práci s koncentrovanějšími roztoky než doposud. Tím klesnou náklady na rozpouštědla a zároveň se zkrátí čas nutný na jejich zpětné získávání.

Na základě těchto příznivých ekonomických parametrů se SMB-technika ve vzrůstajícím měřítku nasazuje také k chromatografickému dělení proteinů produkovaných biotechnologicky (Nadler T.K., Sch. Sci., Purdue Univ. East Lafayette, IN 47 99 07, USA) a aminokyselin (Adachi S. se spolupracovníky, Agric. Biol. Chem. 55, 925-932 (1991)).

Také v předloženém případě čištění produktů obsahujících cyklosporin A by mohla být zjištěna převaha SMB ve srovnání s konvenčními chromatografickými způsoby.

• Srovnání SMB techniky s technikou HPLC

Fázový systém Parametr Poměr (SMB :HPLC)

Normální fázový systém	spotřeba etylacetátu spotřeba materiálu Si 60 produktivita (g vložené/d/kg adsorbens)	0,7 0,25 2,5
Obrácený fázový systém	spotřeba acetonitril/voda	0,15
	spotřeba materiálu RP-18 produktivita	0,15
	(g vložené/d/kg adsorbens)	10

Nejdůležitějším technickým předpokladem pro realizaci SMB-dělení je přesné nastavení různých dílčích toků (viz příklady), aby bylo možné zajistit takřka stacionární stav elučních front v závislosti na spínacích časech.

Dále je pro optimální nastavení SMB-dělení nutná přesná znalost adsorbční izotermy žádaného produktu stejně jako znečišťujících látek v používaném chromatografickém systému. Toto musí být předem analyticky stanoveno.

Také se, díky zavedení takzvané páté zóny, podařilo vypustit obvyklé dvoukomponentní dělení klasické čtyřzónové SMB. Pomocí promývacího systému instalovaného v přídavné zóně je umožněna souběžná eliminace znečištění, která ve vztahu k cyklosporinu A vykazuje vysoké hodnoty k. Tím je dosaženo dalšího zvýšení kvality produktu.

Obvykle mohou být standardní SMB-technikou dobře rozděleny směsi s hodnotami k mezi 0,6 a 2,0 (k=l odpovídá žádanému produktu). Avšak běžně jsou komponenty, které leží mimo toto rozmezí, odstraněny pouze neúplně, takže dojde k obohacení v rafinátu oproti vloženému materiálu („feed“) (obr. 1).

Při přepínání mezi čtvrtou a první zónou se podle nově vynalezeného postupu kolony dostanou do definovaného stavu promývání rozpouštědlem o silné eluční síle (např. metanol). Příslušné

-4CZ 293243 B6 kolony aparatury, které se nacházejí v této páté zóně, jsou tak po dobu jednoho taktu vyřazeny z uzavřeného kruhu ostatních čtyř zón (obr. 1).

Tato pátá zóna je rozdělena do dvou dílčích kroků:

1. Během trvání prvního dílčího kroku se kolony páté zóny propláchnou vhodným rozpouštědlem o vysoké eluční síle, aby se stacionární fáze očistila od zbylých nečistot.

Jako promývací prostředek je přednostně využíván metanol. V případě promývání RP-materiáhi může být nasazen čistý acetonitril, čímž se díky odpadnutí jednoho přídavného rozpouštědla zjednoduší problém zpětného získávání rozpouštěcích prostředků.

2. Ve druhém dílčím kroku se promývacím prostředkem oplachuje eluční prostředek nutný pro oddělování.

Jsou-li kolony rozděleny do zón tak, že se jich v páté zóně nachází víc, může být promývací proces zintenzivněn, když se tyto kolony během promývání zapojí paralelně.

Další optimalizace postupu bylo dosaženo při ultračištění takzvané hodnotné frakce 2 prvního stupně chromatografie. Tato frakce obsahuje kromě cyklosporinu A především polární nečistoty jako cyklosporin U a L. zde bylo překvapivě zjištěno, že tato hodnotná frakce 2 může být velmi dobře oddělena po záměně místa odběru pro extrakt a rafinát na SMB-zařízení. Přitom jsou polární nečistoty eluovány před hodnotným produktem, cyklosporinem A, to znamená, že vykazují kratší retenční časy. Toto znamená, že při použití tohoto speciálního SMB-režimu ve druhém stupni chromatografie pak lze v tomto stupni pracovat se systémem RP-18, čímž se velmi zjednoduší zpětné získávání rozpouštěcích prostředků (schéma 1).

Výchozí substance použité v následujících třech příkladech, které dokládají vhodnost SMB-techniky pro druhý stupeň chromatografie, odpovídají svým profilem znečištění typickým hodnotným frakcím vzniklým z prvního stupně chromatografie při použití konvenční preparativní HPLC.

Příklady provedení vynálezu

V příkladu 1 se demonstruje ultračištění meziproduktu prvního stupně chromatografie pomocí SMB-techniky v běžném fázovém systému Si 60/etylacetát. Použitá látka obsahuje kromě cyklosporinu A převážně polárnější nečistoty.

Jako výsledek lze pozorovat zřetelné ochuzení polárních cyklosporinů (zejména U a L stejně jako B a C), tím se zdůrazní principielní vhodnost dělicího systému ve spojení se SMB-technikou.

Příklad 2 popisuje ultračištění meziproduktu, který jako hodnotnou frakci 1 obsahuje převážně nepolární nečistoty, pomocí SMB-techniky v systému reverzní fáze RP-18/acetonitril, voda (60 : 40, objemově). Po dělení SMB lze pozorovat zřetelně ochuzení nepolárních cyklosporinů (především G a D).

V příkladu 3 se popisuje ultračištění meziproduktu, který obsahuje hodnotnou frakci 1 s nepolárním znečištěním, pomocí SMB-techniky v systému normální fáze/etylacetát.

Ve srovnání s příkladem 1 se při záměně míst odběru pro extrakt/rafmát dosáhne výraznějšího ochuzení nepolárních nečistot, a také úspory rozpouštěcích prostředků.

-5CZ 293243 B6

Možnost takto jemného dělení je do té míry překvapivá, protože v minulých letech nebylo ani pomocí analytické HPLC možné tyto chromatograficky výjimečně podobné doprovodné substance od cyklosporinu A oddělit.

Získaný cyklosporin A odpovídá po rekrystalizací požadavkům na kvalitu jak USP ΧΧΠΙ, tak evropského lékopisu (EUROPEAN PHARMACOPOEITA, 2. vydání, 1995).

Přehled obrázků na výkrese

Schéma principu pětizónové SMB je uvedeno na obr. 1.

Popis obrázku 1

Tekutý prostředek je veden v kruhu mezi zónami 1 a 4. Přidání vzorku se děje mezi zónami 2 a 3. Čerstvý eluent se přidává mezi zónami 4 a L Rafinát (cyklosporin A) se odebírá mezi zónami 3 a 4 a extrakt (cyklosporin A + nečistoty) mezi zónou 1 a 2. Každá kolona je opatřena čtyřmi ventily pro přidání substance (“freed“), eluent, extrakt (hodnotný produkt + nečistoty), a rafinát (hodnotný produkt). „Pohyb“ nosného materiálu je simulován posunem sběrných a vstupních bodů proti směru eluce. Tím se docílí kontinuální rozložení substance mezi fázemi v systému kolon a koncentrace eluátu se na sběrných bodech zdají konstantní.

Dále bylo v pokusném testu překvapivě zjištěno, že oddělení vedlejších cyklosporinů U a L na jedné straně a G a D na druhé straně se daří lépe SMB technikou než konvenční chromatografíí a zároveň v jednotlivých stupních dosažitelné vyšší výtěžky. Z toho vyplývá, že je při srovnatelné produktivitě možné využít menších zařízení, která mají také menší spotřebu náplně kolon a elučních prostředků.

Principielně je možné využít SMB techniky také v prvním stupni chromatografie (schéma 3). Přitom může být v podstatě za použití vhodných surových extraktů (s malým obsahem balastních látek především lipofilního charakteru) provedeno SMB dělení také v prvním stupni v systému reverzní fáze/acetonitril, voda (schéma 4). Jak bylo dále zjištěno, mohou být po záměně pozic rafmátu a extraktu v systému reverzní fáze/acetonitril, voda od cyklosporinu A odděleny také polární nečistoty. Proto je také možné provést čištění cyklosporinu A za použití systému reverzní fáze/acetonitril, voda dvoustupňové pomocí SMB techniky nebo mohou být také nepolární nečistoty od cyklosporinu A systémem normální fáze/acetylacetát po záměně pozic rafmátu a extraktu; je také potom možné provést čištění cyklosporinu A za použití systému normální fáze/etylacetát dvoustupňové pomocí SMB techniky.

-6CZ 293243 B6 cyklosporin A - surový extrakt

Schéma 1

1. chromatografický stupeň konv. prep. HPLC

Kieselgel Si 60 etylacetát

Hodnotná frakce 1 nepolární Cy A + Cy G, Cy D atd.

Hodnotná frakce 2 polární Cy A + Cy L, Cy U atd.

2. chromatografický stupen

SMB

Si 60 etylacetát

Schéma 2 cyklosporin A - surový extrakt

1. chromatograf, stupeň kohv. prep. HPLC

Kieselgel Sl 60 etylacetát

Hodnotná frakce 1 nepolární Cy A + Cy G, cy D atd.

Hodnotná frakce 2 polární Cy A + Cy L, Cy U atd.

2. chromatograf. stupeň SMB

RP-18 Sl 60 acetonitríl, voda etylacetát nebo po záměně pozic extrakt/rafinát: RP-18/ acetonitríl, voda

-8CZ 293243 B6

Schéma 3 cyklosporin A - surový extrakt

1. chromatograf. stupeň Sřffi

Si 60 etylacetát

Rafinát

Cy A + nepolární nečistoty

Extrakt obohacení polárních nečistot (příklad 1)

2. chromatograf. stupeň

SMB

RR-18 acetonitril, voda

Rafinát Cy A

Extrakt obohacení nepolárních nečistot (příklad 2)

-9CZ 293243 B6 cyklosporin A - surový extrakt

Schéma 4

1 chromátograf. stupeň SMB	RP-18
Rafinát Cy A + polární nečistoty	Extrakt obohacen: nepolárn: nečistot (příklad

2. chromátograf. stupeň	RP-18
SMB	acetonitri1,	voda
	Rafinát	Extrakt
	obohaceni	Cy A
	polárních nečistot

2)

- 10CZ 293243 B6

Příklad 1

Oddělení převážně polárních cyklosporinů (cyklosporiny C, B, L, U) od cyklosporinu A ve druhé 5 chromatografii pomocí SMB techniky v systému normální fáze/etylacetát.

Zařízení	LiChrosep^(R) 8-50, pilotní zařízení
Kolona	8 kolon, délka 100 mm x 50 mm vnitřní průměr, axiální komprese
Stacionární fáze	LiChrosespheA Si 60,15 pm
Mobilní fáze	etylacetát
Surová substance	#011194 cyklosporin	čistota [%]
	C	2,3
	B	6,9
	L	0,7
	U	1,2
	A	86,2
	G	1,0
	D	0,1
	souhrn znečištění	13,8%
Vklad substance	Roztok v etylacetátu 5,8 g/1
Vkládaný materiál	5,3 ml/min
Eluent	100 ml/min
Recyklace	151 ml/min
Detekce	HPLC - analýza v proudu extraktu a rafmátu
Výsledky
Rafinát	cyklosporiny	čistota [%]
	C	0,2
	B	0,4
	L	0,0
	U	0,4
	A	97,4
	G	1,1
	D	0,1
	souhrn znečištění	2,6 %
	výtěžnost, cyklosporin A:	> 95 %
Extrakt	cyklosporin A	75,5 %
	souhrn znečištění	24,5 %

Výsledek pokusu ukazuje principielní možnost oddělení převážně polárních nečistot zcyklosporinu A v systému Si 60/etylacetát.

-11 CZ 293243 B6

Příklad 2

Oddělení převážně nepolárních cyklosporinů (cyklosporiny G, D) od cyklosporinu A pomocí SMB techniky v systému RP-18/acetonitril, voda.

Zařízení LiChrosep 8-50, pilotní zařízení

Kolona kolon, délka 100 mm x 50 mm vnitřní průměr, axiální komprese

Stacionární fáze Mobilní fáze Surová substance

Přívod substance Vkládaný materiál

Eluent

Recyklace Detekce Výsledky Rafinát

LiChrosespher^ Si 60,15 pm acetonitril/voda - 60/40, objemově #251094 cyklosporiny

L U A

G

D souhrn znečištění roztok v acetonitrilu g/1

12,7 ml/min ml/min

151 ml/min

HPLC - analýza v proudu extraktu a rafinátu čistota [%]

0,3

0,8

92,5

4,1

1,6

7,5%

cyklosporiny	čistota [%]
neznámé (a = 3,4)	0,1
L	0,2
U	0,5
A	99,1
G	0,0
D	0,0
neznámé (a = 20,1)	0,1
souhrn znečištění	0,9 %
obsah, cyklosporin A (sušina)	99,4 %
stupňová výtěžnost, cyklosporin A	>95 %

V pokusu dosažená čistota rafinátu činí 99,1 %. Po usušení této substance byl stanoven obsah cyklosporinu A na 99,4 %.

Výsledek ukazuje možnost oddělení nepolárních nečistot od cyklosporinu A v systému RP-18/acetonitril, voda (60 : 40, objemově).

- 12CZ 293243 B6

Příklad 3

Oddělení převážně nepolárních cyklosporinů (cyklosporiny C, G, D) od cyklosporinu A ve druhé chromatografií pomocí SMB techniky v systému normální fáze/etylacetát při záměně místa odběru pro extrakt a rafinát.

Zařízení	LiChrosep ^w 12-96, pilotní zařízení
Kolona	8 kolon, délka 100 mm x 26 mm vnitřní průměr, axiální komprese
Stacionární fáze	LiChrosespher^ Si 60,15 - 25 pm
Mobilní fáze	etylacetát
Surová substance	cyklosporiny	čistota [%]
	C	0,04
	B	0,122
	L	0,075
	A	92,462
	G	2,934
	D	4,177
	souhrn znečištění	7,538 %
Přívod substance	roztok v etylacetátu 28 g/1
Vkládaný	1,5 ml/min
materiál
Eluent	16,4 ml/min
Detekce	HPLC - analýza v proudu extraktu a rafmátu
Výsledky
Extrakt	cyklosporiny	čistota [%]
	C	0,02
	B	0,075
	L	0,063
	A	99,364
	neznámé	0,219
	G	1,175
	souhrn znečištění	0,636 %
	výtěžnost, cyklosporin A:	> 95 %

Výsledek ukazuje, že pomocí výše zmíněného režimu zapojení SMB technikou mohou být 10 v systému Si 60/etylacetát velmi dobře odděleny také nepolární nečistoty.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob čištění cyklosporinu A a/nebo příbuzných cyklosporinů z cyklosporin obsahujícího surového extraktu za využití chromatografického postupu se silikagelem jako adsorbentem, vyznačující se tím,že se

a) v prvním stupni chromatografie pomocí preparativní vysokotlaké kapalinové chromatografie nebo techniky napodobující pohyblivé lože surový extrakt frakčních kroků v oddělených koncentračních profilech rozdělí na nepolární doprovodné látky obsahující hodnotnou frakci 1-rafinát a polárnější doprovodné látky obsahující hodnotnou frakci 2-extrakt a

b) hodnotná frakce 1-rafinát a hodnotná frakce 2-extrakt v následujícím stupni chromatografie podrobí dalšímu čištění pomocí techniky napodobující pohyblivé lože.
2. Způsob podle nároku 1, vy značu j ící se tím, že se

a) jak první, tak druhý stupeň chromatografie provádí v systému normální fáze - etylacetát nebo reverzní fáze - acetonitril/voda,

b) hodnotná frakce 1-rafinát pomocí techniky napodobující pohyblivé lože v systému reverzní fáze - acetonitril/voda a hodnotná frakce 2-extrakt druhému stupni chromatografie v systému normální fáze - etylacetát a

c) hodnotná frakce 2-extrakt pomocí techniky napodobující pohyblivé lože v systému reverzní fáze - acetonitril/voda a hodnotná frakce 1 -rafinát druhému stupni chromatografie v systému normální fáze - etylacetát.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije zónová technika, přičemž promývání se provede nejprve alkoholem a následně eluentem a při více kolonách tyto proudí do páté zóny v paralelním zapojení.
4. Způsob podle nároku2, vyznačující se tím, že se dělení ve druhém stupni chromatografie provádí v systému reverzní fáze - acetonitril/voda s poměrem acetonitril/voda 40 až 80 k 20 až 60, přednostně 60 : 40, kde poměry jsou uvedeny objemově.
5. Způsob podle nároku la 2, vyznačující se tím, že se kolony a eluenty v zařízení napodobujícím pohyblivé lože udržují v rozmezí teplot od 40 do 80 °C, přednostně ale při 60 °C.
6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se v systému reverzní fáze - acetonitril/voda hodnota pH eluentu nastavuje v rozmezí 2 až 5, přednostně však na 3.
7. Způsob podle nároků 3, 5a 6, vyznačující se tím, že se jako eluent v případě normální fáze používá ethylacetát a v případě reverzní fáze směs acetonitrilu a vody.