JP2000507237A - 高度に精製されたシクロスポリンａおよび関連シクロスポリン類を得るためのクロマトグラフィー方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、工業的規模でシクロスポリン含有粗製抽出物の精製のために適当な新規クロマトグラフィー方法に関する。その際、慣例の分取クロマトグラフィー分離法は全部または少なくとも部分的にシミュレート移動層法（ＳＭＢ）により代えられる。得られるシクロスポリンＡは、ＵＳＰＸＸＩＩＩならびにヨーロッパ薬局方２版１９９５年の品質要求に合致する。

Description

【発明の詳細な説明】 高度に精製されたシクロスポリンＡおよび関連シクロスポリン類を得るためのク ロマトグラフィー方法 本発明は、製薬工業における適用に適当な、シクロスポリンＡ（ＣｙＡ）およ び関連シクロスポリン類のクロマトグラフによる新規精製方法に関する。その際 、作用物質は経済的に有利な条件下で医薬的に許容しうる純度で得られる、つま りシクロスポリンＡの場合にはたとえばファルムヨーロッパ（ＰＨＡＲＭＥＵＲ ＯＰＡ）（ＰＨＡＲＭＥＵＲＯＰＡ Ｖｏｌ．４、Ｎｏ．４、２７０ページ、１ ９９２年１２月）の純度要求を満足する。 トリコデルマ・ポリスポルム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｐｏｌｙｓｐｏｒｕ ｍ）（Ｌｉｎｋ ｅｘ Ｐ ｇｅｒ）および協同研究者［Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ５９、１１２（１ ９７６）］によるシクロスポリンＡの有効な単離で、初めて新規強力な免疫抑制 剤が利用できた。とかくする内に、集中的研究により、免疫抑制および抗菌活性 を有する２５以上の関連シクロスポリンが公知になった［Ｒ．Ｔｒａｂｅｒ ｅ ｔ ａｌ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０、 １３（１９８７）］。 今日、臓器移植による免疫防御の抑圧における選択剤としてのシクロスポリン Ａの顕著な重要性は明白である。従って過去において、製造方法の改善によりこ れらの人命救助医薬の量および品質に関する不断に増加する要求を満足するため の努力が無くはなかった。 シクロスポリンＡ含有粗製抽出物を精製するための従来公知の技術的解決法は 、溶離剤として有機溶媒を使用する若干のクロマトグラフィー工程を包含する。 研究においては、差当たりシリカゲル６０メルク（Ｍｅｒｃｋ）（０．０６３〜 ０．２ｍｍ）上でクロロホルムを用いメタノール量を増加させてクロマトグラフ ィーを実施した。引き続き、得られた生成物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ ｘ）ＬＨ２０上でメタノール中でゲルクロマトグラフィーにかけ、次いで最後に 酸化アルミニウム（Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ）Ａｋｔ．Ｉ）上でトルエン中酢酸エチ ルの分量を増加させてクロマトグラフィーを実施した。 後の研究も類似の方法を使用する（第１表）。吸着剤セファデックス（Ｓｅｐ ｈａｄｅｘ）ＬＨ２０、シリカゲル６０メルク（Ｍｅｒｃｋ）（０．０６３〜０ ．２ｍｍ）および酸化アルミニウム（中性）が屡々使用される。溶離剤として、 たいてい有機溶媒の混合物が使用される。 その際、その高い毒性に基づき、クロロホルムおよ び塩化メチレンは、作用物質中の残留溶媒残量に関しならびにそれから生じる、 大量のこれら物質を処理する際（蒸留、廃棄物処理）の安全技術上の問題のため に不適当である さらに、勾配混合物または複雑な、たとえば三元の無勾配混合物を適用する場 合、溶離液の蒸留後、溶離剤の新規調節は面倒で高価である。 粗製抽出物にクロマトグラフィー前に熱処理を加える、ビオガル（ＢＩＯＧＡ Ｌ）によりカナダ国特許（ＣＡ）２０９６８９２号に記載された方法も同様に評 価される。ここで、粗生成物は約１時間約１１０℃に加熱され、引き続き定義さ れた条件下に５時間にわたり室温に冷却される。高割合の塩素化炭化水素を使用 すると、２つの順次に使用される溶離剤系で、シリカゲル６０上の１工程クロマ トグラフィーにおいて装入量のシクロスポリンＡの約１５％が約９７．６％の純 度で単離される。しかしこの結果は、工業的利用に関し得られる作用物質の収率 および純度の点で満足できない。さらに、これらの複雑な天然物質はその熱不安 定性および可能な異性化のため、経験によれば熱応力を受けてはならない。 従来の知識レベルによれば、藤沢の出願（ＷＯ９２１３０９４号）およびビオ ガル（ＢＩＯＧＡＬ）の出願（ＣＡ２０９６８９２号）だけが１工程のクロマト グラフィー精製を使用する。しかしこのために、費用 のかかる溶離剤組合わせないしは勾配が必要であり、これは溶離剤の再生を困難 にする。これらの方法の正確な判断のためには、たいてい収率および達成された 生成物純度に関する記載が欠けている。 シクロスポリンＡに対する若干の従来公知のクロマトグラフィー精製法の例 ＳＭＢ技術自体の短い記述は、たとえばニクー（Ｒ．Ｍ．Ｎｉｃｏｕｄ）、Ｌ Ｃ−ＧＣ ＩＮＴＬ Ｖｏｌ．５、Ｎｏ．５、４３〜４７ページおよびアンガー （Ｋ．Ｋ．Ｕｎｇｅｒ）（編）、Ｈａｎｄｂｕｃｈｄｅｒ ＨＰＬＣ［ＨＰＬＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ］、Ｐａｒｔ２、ＧＩＴ出版、ダルムスタット、１９９４年 に存在する（図１をも参照）。 ここに記述した技術水準から出発して、生成物純度および収率の高い要求を有 するクロマトグラフィーによるシクロスポリンＡ精製の本発明による解決法に対 し次ぎの課題が生じる： ・新規方法は、使用したシクロスポリンＡ量の７０％以上をＰＨＡＲＭＥＵＲ ＯＰＡに合致する品質で供給すべきである（クロマトグラフィー精製工程に関し て）。 ・方法は、年間処理量に関する最高の要求を満足し、同時に固定相に対する溶 媒および材料の必要量を劇的に減少すべきである。 ・技術的解決法は、簡単、迅速および頑丈であるべきである、つまり溶媒およ び吸着剤はできるだけ長い期間にわたり再使用できねばならない。それと共に、 調節ないしは再生困難で無勾配適用される溶媒混合物および勾配の使用もなくな る。 ・塩素化炭化水素を使用してはならない。 ・方法は、自動化、つまり連続的操作のための可能 性を提供し、同時にＧＭＰに応じる生産の要求を満足すべきである。 クロマトグラフィー精製のための出発物質として、たとえば公知方法（たとえ ばＤＤ２９５８７２Ａ５号）により、シクロスポリンＡ含有乾燥菌糸体から抽出 （酢酸エチル）および脱脂（石油ベンジン／メタノール／水）により得られる、 たいていは一連の黄および赤に着色した物質ならびに油状生成物のほかに、たと えば次のシクロスポリンの組成を有する粗製抽出物が使用される： ¹)PHARMEUROPA Vol.4,No.4,270ページ以降によるＨＰＬＣ分析測定 第１クロマトグラフィー工程において、極性シクロスポリン（Ｃ、Ｂ、Ｌ、Ｕ ）が無極性シクロスポリン（Ｇ、Ｄ）から分離され、それでシクロスポリンＡの ほかに極性不純物のみまたは無極性不純物のみを含有する２つの有用画分（Ｗｅ ｒｔｆｒａｋｔｉｏｎ）が生じる。これにより、第２クロマトグラフィー工程に おいてシクロスポリンＡからその都度の不純物を除去精製することができる。 本発明により、クロマトグラフィー精製によるシクロスポリンＡの高度精製（ Ｈｏｃｈｒｅｉｎｉｇｕｎｇ）は、慣例のＨＰＬＣをシミュレート移動相技術（ ＳＭＢ）と組合せて次のように実施される： 第１クロマトグラフィーＨＰＬＣまたはＳＭＢ技術 第２クロマトグラフィー ＳＭＢ技術 図表１〜４参照 より正確に言えば、本発明は吸着剤としてシリカゲルを用いるクロマトグラフ ィー法の適用下にシクロスポリン含有粗製抽出物からシクロスポリンＡおよび関 連シクロスポリン類を精製する方法に関し、シクロスポリン含有粗製抽出物から シクロスポリンＡおよび関連シクロスポリン類を、吸着剤としてシリカゲルを用 いるクロマトグラフィー方法の適用下に ａ）第１クロマトグラフィー工程において分取ＨＰＬＣまたはＳＭＢ技術を用い 、粗製抽出物を分離された濃度プロフィルでの画分カットにより無極性随伴物質 を含有する有用画分１およびより極性の随伴物質を含有する有用画分２に分離し 、 ｂ）有用画分１（ラフィネート）および有用画分２（エキストラクト）を次のＳ ＭＢ技術による第２クロマトグラフィー工程にかける。その際、第１クロマトグ ラフィー工程ならびに第２クロマトグラフィー工程は 、順相系（酢酸エチル）または逆相系（アセトニトリル／水）中で実施すること ができる。 殊に、ＳＭＢ技術の使用により次の利点が達成される： ・絶対連続的作業法が実現できる、つまり新規クロマトグラフィーモードによ り離散的物質注入がなくなる。かかる連続作業のクロマトグラフィーは、就中工 業的適用に対し有利である。 ・ＳＭＢ技術は、従来よりも濃厚な溶液を用いる作業を可能にする。これによ り、溶媒消費量、それと同時に溶媒回収のために必要な時間も減少する。 これらの有利な経済的パラメーターに基づき、ＳＭＢ技術は、生物工学により 生産されたタンパク質（Ｎａｄｌｅｒ、Ｔ．Ｋ．、Ｆ．Ｅ．Ｓｃｈ．Ｓｃｉ．、 Ｐｒｕｄｕｅ Ｕｎｉｖ．Ｅａｓｔ．Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ４７９０７ＵＳ Ａ）およびアミノ酸（Ａｄａｃｈｉ、Ｓ．および協力者．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．１９９１年、５５巻、９２５〜３２ページ）のクロマトグラフィー 分離にも益々多く使用される。 シクロスポリンＡ含有生成物を精製するこの場合においても、通常のクロマト グラフィー法と比較してＳＭＢの卓越性を確認することができた。 ・ＳＭＢ技術とＨＰＬＣ技術との比較 ＳＭＢ分離実現のための最も重要な技術的前提条件は、溶離前線のいわば定常 状態を切替え時間に依存して保証するために、種々の個々の流れ（例参照）の正 確な調節である。 さらに、ＳＭＢ分離の最適調節のためには、使用したクロマトグラフィー系に おける有用生成物ならびに不純物の吸着等温線の正確な認識が必要である。これ らは、予め分析により決定しなければならない。 さらに、いわゆる第５ゾーンの導入により、古典的４ゾーンＳＭＢの従来通例 の２成分分離を破棄することに成功した。この付加的ゾーン内に設置された洗浄 設備により、今や同じ作業中に、シクロスポリンＡに関し極端なｋ’値を有する 不純物の除去も可能になる 。それと共に、有用生成物における品質をさらに改善することが可能である。 通常、標準ＳＭＢ技術を用いて０．６および２．０の間のｋ’値を有する混合 物はたいてい良好に分離することができる（ｋ’＝１は有用生成物を表わす）。 しかし、この範囲外にある成分は、一般にエキストラクト中では不完全にしか洗 浄除去されないので、装入物（フィード）と比較してラフィネート中に濃縮され る（図１）。 本発明による新規方法によれば、カラムは第４ゾーンおよび第１ゾーンの間で 強い溶離力の溶媒（たとえばメタノール）で洗浄することにより切替える際に定 義された状態にもたらされる。この第５ゾーン中に存在する装置の当該カラムは 、１サイクルの期間の間、他の４つのゾーンの閉じた環状ユニットから完全に切 断される（図１）。 その際、この第５ゾーンは２つの部分工程に細分される： １．第１部分工程の間、第５ゾーンのカラムは、固定相からなお付着する不純 物を除去精製するために、高い溶離力の適当な溶媒で洗浄される。 洗浄剤としては、好んでメタノールが使用される。ＲＰ材料の洗浄の場合には 、純アセトニトリルも使用することができ、これにより溶媒回収の問題は付加的 溶媒の廃止により簡単になる。 ２．第２部分工程において、洗浄剤からその都度の分離に必要な溶離剤に切替 えられる。 カラムがゾーン中に、第５ゾーン中に数個のカラムが存在するように分配され ている場合、洗浄工程を、これらのカラムが洗浄の間並列接続される場合に激し くすることができる。 他の方法最適化は、第１クロマトグラフィー工程のいわゆる有用画分２の高度 精製において達成された。この画分は、シクロスポリンＡのほかに就中シクロス ポリンＵおよびＬのような極性不純物を含有する。ここで意外にも、ＳＭＢプラ ントにおけるエキストラクトおよびラフィネートの抜取り位置を交換した後、こ の有用画分２は非常に良好に分離できることを確認することができた。この場合 、極性不純物は有用生成物シクロスポリンＡの前に溶離される、つまり該不純物 はより短い滞留時間を有する。これは、第２クロマトグラフィー工程においてこ の特殊なＳＭＢ技術を使用する場合、この工程においては専らＲＰ−１８系を用 いて作業することができることを意味し、これにより溶媒回収が著しく簡単にな る（図表２）。 第２クロマトグラフィー工程に対するＳＭＢ技術の適性を証明する次の３つの 例において、使用した出発物質はその不純物プロフィルが、慣例の分取ＨＰＬＣ を用いて実施した第１クロマトグラフィー工程後に存在するような典型的有用画 分に一致する。 例１において、第１クロマトグラフィー工程の中間生成物の、順相系（シリカ ゲルＳｉ６０／酢酸エチル）中でＳＭＢ技術を用いる高度精製を説明する。使用 した中間生成物はシクロスポリンＡのほかに主として極性不純物を含有する。結 果物中に、極性シクロスポリン（殊にＵおよびＬならびにＢおよびＣ）の明瞭な 減少が認められ、これによりＳＭＢと結合した分離系の原則的適性が説明される 。 例２は、有用画分１として主として無極性不純物を含有する中間生成物の、Ｒ Ｐ−１８逆相系（アセトニトリル、水（６０：４０、ｖ／ｖ））中でＳＭＢ技術 を用いる高度精製を記載する。ＳＭＢ分離後、無極性シクロスポリン（殊にＧお よびＤ）の明瞭な減少が観察される。 例３には、主として無極性不純物を有する有用画分１を含有する中間生成物の 、順相系（シリカゲル、酢酸エチル）中でＳＭＢ技術を用いる高度精製を記載す る。例１と比較して、エキストラクト／ラフィネートの抜取り位置を交換するこ とにより、無極性不純物の明らかな減少ならびに溶媒節約が達成される。この精 密分離は、数年前までまだ、むしろ分析ＨＰＬＣによって、これらのクロマトグ ラフィー的に極めて類似の随伴物質をシクロスポリンＡから分離することは不可 能であったので、その限りでは驚異的である。得られるシクロスポリンＡは再結 晶後、ＵＳＰＸＸＩＩＩな らびにヨーロッパ薬局方（ＥＵＲＯＰＥＡＮ ＰＨＡＲＭＡＣＯＰＯＥＩＡ）、 ２版１９９５年の品質要求に合致する。 図１：５ゾーンＳＭＢの原理模式図 図１の記載 溶離剤は、ゾーン１および４の間で循環して案内される。試料の供給は、ゾー ン２および３の間で行われる。新しい溶離剤は、ゾーン４および１の間で供給さ れる。ラフィネート（シクロスポリンＡ）はゾーン３ および４の間で抜取られ、エクストラクト（シクロスポリンＡ＋不純物）はゾー ン１および２の間で抜取られる。統合されたシステム中で、各カラムはフィード （物質装入）、溶離剤、エクストラクト（有用物質＋不純物）およびラフィネー ト（有用物質）用の４つの弁を備えている。支持体材料の“移動”は、捕集およ び供給個所を溶離方向に向かってずらすことによりシミュレートされる。これに より、カラムシステム中の相間の連続的物質分配を達成し、抜取り個所における 溶離液濃度を一定に出現させることができる。 さらに、実験的試験において意外にも、ＳＭＢ技術による二次的シクロスポリ ン（一方でＵおよびＬならびに他方でＧおよびＤ）の分離は通常のクロマトグラ フィーを用いるよりも完全に行われ、同時に各工程においてより高い収率が達成 できることを見出すことができた。この結果として、比較可能な生産性に対して 小型プラントが可能になり、それで該プラントは僅かなカラム充填材ならびに溶 離剤の必要量を有する。 もちろん、原則的には第１クロマトグラフィー工程においてもＳＭＢ技術の適 用は可能である（図表３及び４）。その際、原則的には適当な粗製抽出物（就中 親油性の不活性材料による僅かな負荷）が存在する場合、第１工程においても、 逆相系（アセトニトリル、水）中でＳＭＢ分離を実施することができる（図表４ ）。さらに見出したように、極性不純物も逆相系（ア セトニトリル、水）中で、シクロスポリンＡのラフィネート／エキストラクトの 位置を交換した後に分離することができるので、シクロスポリンＡ精製は単に逆 相系（アセトニトリル、水）の使用下にＳＭＢ技術を用い２工程で実施すること も可能であるかまたは無極性不純物も順相系（酢酸エチル）中でシクロスポリン Ａのラフィネート／エキストラクトの位置を交換した後に分離することができ、 それでシクロスポリンＡ精製を単に順相系（酢酸エチル）の使用下にＳＭＢ技術 を用い２工程で実施することも可能である。 例１ 順相系（酢酸エチル）中でＳＭＢ技術を用いる第２クロマトグラフィーにおい てシクロスポリンＡからの主として極性シクロスポリン（シクロスポリンＣ、Ｂ 、Ｌ、Ｕ）の分離 例２ ＲＰ−１８系（アセトニトリル、水中）でＳＭＢ技術を用いるシクロスポリン Ａからの主として無極性シクロスポリン（シクロスポリンＧＮＤ）の分離 例３ エキストラクトおよびラフィネート抜取り位置の交換による順相系（酢酸エチ ル）中でＳＭＢ技術を用いる第２クロマトグラフィーにおけるシクロスポリンＡ からの主として無極性シクロスポリン（シクロスポリンＣ、Ｇ、Ｄ）の分離

【手続補正書】 【提出日】１９９８年１１月１９日（１９９８．１１．１９） 【補正内容】 (1)明細書中第５頁第１行目から２行目の 「シクロスポリンＡに対する若干の従来公知のクロマトグラフィー精製法の例」 を 「シクロスポリンＡに対する若干の従来公知のクロマトグラフィー精製法の例 第１表」と補正する。 (2)同第１３頁第９行目から１４行目の「例２は、有用画分１として主として無 極性不純物を含有する中間生成物の、ＲＰ−１８逆相系（アセトニトリル）、水 （６０：４０、ｖ／ｖ））中でＳＭＢ技術を用いる高度精製を記載する。ＳＭＢ 分離後、無極性シクロスポリン（殊にＧおよびＤ）の明瞭な減少が観察される。 」を「例２は、有用画分１として主として無極性不純物を含有する中間生成物の 、ＲＰ−１８逆相系（アセトニトリル）、水（６０：４０、ｖ／ｖ））中でＳＭ Ｂ技術を用いる高度精製を記載する。ＳＭＢ分離後、無極性シクロスポリン（殊 にＧおよびＤ）の明瞭な減少が観察される。同時にこの例を使用して、高い最終 純度および乾燥後に達成されたシクロスポリンＡの高い含有量の両方から、前記 の相系のより高い効率が証明される。」と補正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヨアヒム キンケル ドイツ連邦共和国 グルデンタール ヴァ ルトヒルバースハイマー シュトラーセ ４ (72)発明者 ロジェ―マルク ニクゥ フランス国 ヴァンドーヴル―レ―ナンシ ー セデックス リュ デュ ブワ―ド― ラ―シャンペル ノヴァセ 15

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 吸着剤としてシリカゲルを用いるクロマトグラフィー方法の適用下にシクロ スポリン含有粗製抽出物からのシクロスポリンＡおよび関連シクロスポリン類を 精製する方法において、 ａ）第１クロマトグラフィー工程において分取ＨＰＬＣまたは“シミュレート 移動層”技術を用いて粗製抽出物を分離された濃度プロフィルでの画分カットに より無極性随伴物質を含有する有用画分１およびより大きい極性の随伴物質を含 有する有用画分２に分離し、 ｂ）有用画分１（ラフィネート）および有用画分２（エキストラクト）を、次 の第２クロマトグラフィー工程においてＳＭＢ技術を用いさらに精製することを 特徴とする高度に精製されたシクロスポリンＡおよび関連シクロスポリンを得る ためのクロマトグラフィー方法。 2. ａ）第１クロマトグラフィー工程ならびに第２クロマトグラフィー工程を順 相系（酢酸エチル）または逆相系（アセトニトリル／水）中で実施し、 ｂ）有用画分１（ラフィネート）をＳＭＢ技術によって逆相系（アセトニトリ ル／水）中で第２クロマトグラフィー工程にかけ、有用画分２（エキストラクト ）を順相系（酢酸エチル）中で第２クロマトグ ラフィー工程にかけ、 ｃ）有用画分２（エキストラクト）をＳＭＢ技術によって逆相系（アセトニト リル／水）中で第２クロマトグラフィー工程にかけ、有用画分１（ラフィネート ）を順相系（酢酸エチル）中で第２クロマトグラフィー工程にかけることを特徴 とする請求項１記載の方法。 3. 第５ゾーンの導入により洗浄工程を初めにアルコールを用い、引き続き溶離 剤を用いて実施し、第５ゾーン中に数個のカラムが存在する場合、これらのカラ ムを並列接続で流過させることを特徴とする請求項１記載の方法。 4. 第２クロマトグラフィー工程における分離を、逆相系（アセトニトリル／水 ）中で、アセトニトリル／水の４０〜８０：２０〜６０、とくに６０：４０（ｖ ／ｖ）の比を用いて実施することを特徴とする請求項２記載の方法。 5. ＳＭＢプラント中のカラムおよび溶離剤を４０〜８０℃の温度範囲内、とく に６０℃に保つことを特徴とする請求項１または２記載の方法。 6. 逆相系（アセトニトリル、水）中で、溶離剤のｐＨ値を２〜５の範囲内、と くに３に調節することを特徴とする請求項２記載の方法。