CN1763084B - 高纯度环孢菌素a的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的高纯度环孢菌素A的制备方法，该方法适用于医药工业中。根据该方法可以经济有利地制备医药上可接受的高纯度的生物活性物质即环孢菌素A，其完全符合美国药典USP 27，欧洲药典等的纯度要求。

Description

高纯度环孢菌素A的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗生素的制备方法，该方法适用于医药工业领域中

背景技术

本发明涉及一种新的高纯度环孢菌素A的制备方法，该方法适用于医药工业中。根据该方法可以经济有利地制备医药上可接受的高纯度的生物活性物质即环孢菌素A(结构式见下图)，其完全符合美国药典USP 27，欧洲药典等的纯度要求。

环孢菌素A

环孢菌素是一类由真菌产生的环状寡肽，其除了有环孢菌素A外还有B、C、D、U、L等20多种化合物，可以用字母A-Z来表示(Helv.Chim.Acta 70，1987)。环孢菌素这类化合物最早是在瑞士专利CH 589,716和CH 603,790中报道用Cylindrocarpon lucidum Booth和Trichoclerma polysporum Rifai发酵产生的。在所有的环孢菌素当中，环孢菌素A(CsA)是首先从真菌培养物中分离出来的环孢菌素(Helv.Chim.Acta.59，1976)，起先它是因为具有抗菌活性而被关注，后来又发现其具有很强的免疫抑制活性(J.F.Borel et al.Immunology.32，1977)，这具有划时代的意义，后来还陆续证明，CsA还具有抗炎症、杀虫等功效。

目前，CsA作为一种突出的免疫抑制剂已经广为接受，因此对于CsA的制备工艺革新也是人们不遗余力的追求。

当前CsA主要是通过微生物发酵的方法获得，其产生菌除了上述两篇瑞士专利所提的菌外，还有Tolypocladium varium(HU 201,577)，Beaurveria nivea，Fusarium nivale(US2003/0,186,856A1)等多种微生物。在含有活性物质CsA的发酵液中除了含有CsA外，还含有B、C、D等其它几种环孢菌素以及培养基成分、消泡剂、各种菌体代谢物等其它杂质。怎样获得高纯度、高收率的CsA的分离提取工艺革新则是CsA制备工作的重点。

通常，从发酵液中获得产品是通过一系列的溶剂萃取来实现的，可以先将发酵液经过离心、膜分离等使得固液分离，然后用溶剂(通常是甲醇、丙酮等)将活性成分从菌丝体萃取至溶剂中。另外还有一种方法是发酵液无需固液分离而直接加入与水不互溶的溶剂进行萃取。这两种方法各有优缺点，前一种方法可以驱除大部分的水溶性色素以及其它水溶性杂质，后一种方法则是可以节约一步操作，从而节约成本。但是往往在操作过程中易形成乳化给后续操作带来一定的难度，而且因为没有驱除水分，也在一定程度上增加了溶剂的消耗。

在活性成分萃取至有机相后，通常需要进行脱脂等操作，可参见瑞士专利CH 589,716和德国专利DD 2,455,859。然后再经一系列的萃取反萃操作后，将其活性成分真空干燥得到主要含有环孢菌素类物质的CsA粗品。

CsA粗品中主要杂质就是与其结构上异常相似的B、C、D等环孢菌素，为此通常需要经过一系列的层析分离才能得到纯度较高的CsA产品。这些步骤不仅增加了工艺的复杂性而且也大大增加了成本。此外，使用的层析溶剂有许多是氯仿、甲苯等物质，同时也给环境保护带来了很大的压力。层析过程使用的介质除了硅胶外，还有许多工艺采用了十分昂贵的SephadexLH20(US 5,656,459、US 2003/0,186,856A1等)以及采用材质较脆难于工业化使用的氧化铝(US 4,117,118、DD298,276等)。当然，也有只采用一次层析分离CsA的专利报道，如US 5,382,655和WO 92/13094以及WO 96/12031等。但是有些是粗提液需要在上柱前进行热处理，而且最后产品的纯度也达不到要求。因为缺乏翔实的数据资料，目前仍不能精确的对这些方法进行判断。

在CsA的粗品提纯工艺中，除了采用硅胶60、氧化铝或者Sephadex LH20作为介质的层析工艺外，还有用超临界流体萃取(参见US 5,976,381等)，吸附树脂XAD系列(参见WO97/46575)等进行分离的报道。但是往往因为成本高或产品回收率低而不能得到广泛认同。

通常医药级的CsA在经过色谱分离后，往往需要经过结晶或重结晶等步骤才可以得到成品。通常CsA的固态存在形式有无定形和晶体形态两种。而其晶体形态又有四角锥形和斜方晶形两种(参见加拿大专利CA 1,341,396)。四角锥形晶体含有两个分子的结晶水，参见奥地利专利AT 353,961。斜方晶体是通过一系列的重结晶步骤后再通过较长时间的结晶而得到的，这种晶体中有许多溶剂存在。

发明内容

我们在长期的实践过程中发现，CsA经过几步简单的前期处理后，可在浓度很高的情况下在丙酮/己烷/水的环境中结晶出无色的，得率纯度均较高的斜方晶体。为此，本发明综合现有专利的优缺点，以结晶为主要突破点，设计一条十分简单的工艺路线。首先结合了现有路线的特点，直接用丙酮对发酵液进行溶剂萃取。这与以往工艺相比节省了固液膜分离操作，同时也无须用无水硫酸镁等进行脱水，大大节约了成本。在将CsA转移至丙酮后，驱除出部分丙酮后采用不溶于水的己烷进行萃取，再经过两步操作后，基本将产品转移至有机相。这步操作不光驱除了大部分的色素还同时驱除了水以及许多水溶性的杂质。将得到的己烷相经过浓缩，再加入一定体积的丙酮与水，在-5℃左右进行结晶。经过约3天左右的时间可以得到无色的斜方晶体。将晶体过滤同时用水、己烷进行洗涤然后溶于一定体积的乙酸乙酯，而后直接用硅胶60一步柱层析进行分离杂质。在取得CsA的洗脱级份后，将之进行浓缩加入一定体积的丙酮在-15℃的环境中进行重结晶即可获得符合USP27等药典要求的CsA产品。

本发明的核心部分就是路线中间的结晶操作，通过此操作不仅可以驱除大部分的色素及脂肪，还可以驱除部分其它分离方法很难分离的环孢菌素杂质，为下一单元的一步柱层析分离创造了条件。本工艺路线同以往的路线相比，做到了一步色谱分离得到纯品，并大大简化了工艺步骤，同时都使用了常规溶剂减少了对环境的危害，同时因为溶剂类别少也方便了其回收再利用，从而大大节约了成本。

具体实施方式

本发明由下述实施例进一步说明，但不仅限于以下实施例所表述的内容。

实施例1

5L丙酮加入至2L的发酵液中(CsA的浓度为5.104mg/ml)，过滤得到含CsA的丙酮溶液。真空浓缩完全驱除出丙酮，加入1.5倍体积的乙酸乙酯进行萃取，然后蒸干有机相。将其溶于100ml的丙酮并加入一定体积的水和正己烷，经过两次正己烷萃取后合并己烷相并浓缩至一定体积。加入一定体积的丙酮与水，将其置于-5℃的环境下静置约3天，即可见到大量无色斜方形晶体。在过滤洗涤完晶体后，将其溶于50ml的乙酸乙酯中，并将其进行硅胶60的柱层析分离驱除其它环孢菌素类杂质。在得到约2L的乙酸乙酯洗脱级份后，加入一定量的活性炭进行脱色。脱色完液体进行真空干燥并溶于约30ml的丙酮置于-15℃的环境里结晶，将晶体过滤洗涤后即是可以达到要求的CsA产品(5.62g，纯度高于98.5％)。

实施例2

5L丙酮加入至2L的发酵液中(CsA的浓度为5.363mg/ml)，过滤得到含CsA的丙酮溶液。真空浓缩至一定体积后，加入等体积的正己烷萃取两次，合并正己烷相并浓缩至一定体积。其后操作同实施例1，最后得到达到纯度的CsA产品(6.96g，纯度高于98.5％)。

实施例3

5L丙酮加入至2L的发酵液中(CsA的浓度为4.852mg/ml)，过滤得到含CsA的丙酮溶液。其后操作同实施例2。最后得到6.02g CsA产品，纯度高于98.5％。

Claims (7)

1.一种从含有环孢菌素A的发酵液中提取纯化纯度高于98.5％的环孢菌素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)在所述发酵液中加入丙酮，使环孢菌素A从发酵液中转移至丙酮中；

2)浓缩驱除全部丙酮，先用乙酸乙酯将环孢菌素A转移至有机相，浓缩后用丙酮溶解，再用正己烷将环孢菌素A萃取至有机相；或浓缩驱除部分丙酮，直接用正己烷将环孢菌素A转移至有机相。

3)浓缩后加入丙酮与水，静置结晶；

4)用乙酸乙酯溶解所述晶体，硅胶柱层析纯化，脱色洗脱液后重结晶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述1)步骤中丙酮的加入量与发酵液的量的体积比为5∶2。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2)步骤中乙酸乙酯的用量为浓缩驱除全部丙酮后的浓缩液体积的1.5倍。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2)步骤中正己烷萃取次数为2次。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3)步骤中静置时间为3天。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述4)步骤中环孢菌素A重结晶的条件为：温度为-15℃，溶剂为丙酮。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述4)步骤中硅胶柱层析的洗脱溶剂为乙酸乙酯。