CN114653350A - 一种环孢素a层析硅胶的再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环孢素A层析硅胶的再生方法，包括以下步骤：(1)将经分离提纯环孢素A后硅胶柱内残留的溶剂排干；使用含非离子表面活性剂的高级性溶剂从硅胶柱底部进行冲洗；(2)然后先使用含双氧水的去离子水，再使用去离子水进行冲洗；(3)排干水分，取出硅胶，烘干后重新装柱。本发明再生硅胶不仅在物理性质上与原硅胶相比没有差异，而且再生硅胶重复使用多次后，合格环孢素A的收率可以达到60％‑70％。
Description
技术领域
本发明涉及硅胶再生的方法，特别涉及一种环孢素A层析硅胶的再生方法。
背景技术
1983年，环孢素A作为第一个真正有选择性的免疫抑制剂被人们发现。环孢素A是一种由11个氨基酸组成的环肽，从雪白白僵菌的培养物中分离得到，除了环孢素A外还有B、C、D等20多种同系物。环孢素A可以用来治疗一些例如类风湿性关节炎、慢性肾炎等自身免疫疾病，也可以用于肝脏、肾脏移植后的免疫抑制治疗。近几年，环孢素A还用于治疗干眼症等疾病。
现有的环孢素A工业生产工艺路线是先将发酵液预处理、有机溶剂提取、结晶后得到环孢素A粗品，再通过不同类型的柱层析进行分离纯化。专利US5382655A公开了一种用氯仿、二氯甲烷和乙醇用作流动相分离纯化环孢素A的硅胶柱层析法；专利US5976381A公开了一种利用高压二氧化碳作为流动载体通过硅胶柱层析获得环孢素A的方法；以上专利均没有涉及到环孢素A柱层析硅胶的再生。
现有工艺主要特点是需要使用硅胶进行一次或多次的柱层析进行分离纯化。硅胶作为一种吸附剂，具有比表面积大、吸附能力强的特点，广泛应用于医药、化工等行业的柱层析分离。硅胶在柱层析过程中，会吸附一些强极性的杂质，活性降低，吸附能力变差，同时强极性杂质还会污染产物。为了保证产物的纯度，通常硅胶使用一次后丢弃，使得实际生产过程中产生了大量的废旧硅胶，这些硅胶吸附着部分溶剂和环孢素A残留，废弃处理困难，提高了生产成本。
发明内容
发明目的：本发明提供一种经分离提纯环孢素A后的硅胶柱的再生方法。
技术方案：一种环孢素A层析硅胶的再生方法，包括以下步骤：
(1)将经分离提纯环孢素A后硅胶柱内残留的溶剂排干；使用含非离子表面活性剂的高级性溶剂从硅胶柱底部进行冲洗；
(2)然后先使用含双氧水的去离子水，再使用去离子水进行冲洗；
(3)排干水分，取出硅胶，烘干后重新装柱。
本发明研究发现，高级性溶剂可以最大限度的溶解吸附在硅胶上的杂质，同时添加非离子表面活性剂可以进一步提高非极性物质的溶解度，显著增加环孢素层析过程中残留在硅胶上的物质在再生溶剂中的溶解度，减少溶剂的使用量。另外，先使用含双氧水的去离子水进行冲洗，不仅可以去除残留的上述溶剂，还可以氧化一部分死吸附在硅胶上的物质，避免残留溶剂影响后续操作；最后通过去离子水冲洗，使得硅胶再生更彻底。
优选的，步骤(1)中，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯、乙二醇聚氧乙烯醚中的一种或几种。
优选的，步骤(1)中，所述高级性溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种或几种。
优选的，步骤(1)中，所述含非离子表面活性剂的高级性溶剂中非离子表面活性剂终浓度为0.1-0.5g/L。
优选的，步骤(1)中，所述冲洗为反向冲洗。
经研究，由于柱头部分的硅胶吸附了大部分的杂质，采用反向冲洗的方式能够减少再生溶剂的用量，进一步提高再生效果。
优选的，上述反向冲洗的流速0.5-1.5cm/min。
优选的，步骤(2)中，所述含双氧水的去离子水中双氧水终浓度为0.1％-0.5％。
优选的，步骤(2)中，所述含双氧水的去离水的冲洗流速0.5-1.5cm/min。
优选的，步骤(3)中，所述烘干的温度为80-105℃，烘干后的水分含量为3％-8％。
优选的，上述硅胶为200目-300目、300目-400目中的一种。
本发明所述的再生硅胶分离纯化环孢素A的方法，具体过程为：将再生硅胶装柱、敲实、上样；上样结束后使用平衡液平衡，洗脱液洗脱并分段收集，取样检测每份洗脱液，合并收集合格部分。
优选的，所述再生硅胶柱层析径高比为1:8-1:10。
优选的，所述的平衡液为乙酸乙酯、石油醚、丙酮的混合溶液。
优选的，所述的平衡液为乙酸乙酯、石油醚，配比为3:7，平衡流速0.5-3cm/min。
优选的，所述的洗脱液为丙酮、乙酸乙酯、石油醚的一种或几种。
优选的，所述的洗脱液为乙酸乙酯、石油醚，配比为7:3，洗脱流速0.5-1.5cm/min。
优选的，所述的上样液体积为柱床体积的30％—50％，环孢素A粗品上样浓度为80—160g/L，上样流速为0.5-3cm/min。
经研究，使用本发明再生硅胶分离纯化环孢素A，得到的环孢素A总杂质少于1.5％，最大杂质小于0.7％，单个未知杂质小于0.1％，符合多个国家的药典标准；合格环孢素A的收率可以达到60％-70％，硅胶再生次数可以达到三次。
有益效果：与现有技术相比，本发明有以下显著效果：1、本发明的硅胶再生方法简单，先使用含非离子表面活性剂的高级性溶剂对硅胶柱进行冲洗；然后再使用含双氧水的去离子水，最后使用去离子水进行冲洗，所得到的再生硅胶不仅在物理性质上与原硅胶相比没有差异，而且使用再生硅胶分离纯化环孢素A，可得到高纯度的环孢素A；2、本发明中选择的溶剂与现有工艺兼容性好、毒性低、环保、可以蒸馏回收套用，含非离子表面活性剂的高级性溶剂经蒸馏后的废液中还含有部分环孢素A，可以通过结晶等手段回收，不仅提高物料利用率，而且可降低成本；3、根据环孢素A的特性与柱层析硅胶的理化性质，采用反向洗柱的方法，有效将柱头部分的色素和吸附紧密的强极性物质清除，避免污染其他部分的硅胶，减少再生硅胶时消耗的溶剂，提高了再生硅胶的分离纯化效果；4、在拆柱前经过水洗，柱内无有机溶剂残留，防止工厂生产时由于拆柱静电引发火灾的危险，确保了生产的安全；5、采用柱内在线清洗的方式替代传统锅内搅拌洗涤，节约人力，大大提高洗柱效率。
附图说明
图1为本发明硅胶再生及使用再生硅胶分离提纯环孢素A的方法工艺流程图；
图2为再生硅胶使用去离子水冲洗完毕后，取样HPLC检测图；
图3为再生硅胶层析合并液检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
如图1所示，一种环孢素A层析硅胶的再生方法，包括以下步骤：
(1)含非离子表面活性剂的高级性溶剂配置：精确称取无水乙醇5L，加入5g乙二醇聚氧乙烯醚400(SIGMA)。充分混匀，静置30min等待溶液稳定。
层析柱内径40mm，柱长450mm，柱中装载已经使用过一次的环孢素A层析硅胶250g。从柱顶部压入压缩空气排除柱中残留的洗脱液。当柱底无洗脱液流出时，将上述配置的溶剂从柱底以3.6ml/min反向冲洗2个柱体积。冲洗过程结束时取样柱顶部流出的上述配置的溶剂，HPLC检测应当无峰出现。
(2)含双氧水的去离子水配置：在4.5L的去离子水中加入0.5L 1％的双氧水，充分混合均匀。检测溶液pH，溶液为中性或者弱酸性；静置30min等待溶液稳定。
将配置好的含双氧水的去离子水从柱顶部以3.6ml/min的流速泵入冲洗硅胶，1个柱体积冲洗结束后再使用去离子水冲洗一个柱体积。柱底部流出的去离子水应当无明显的含非离子表面活性剂的高级性溶剂的气味。
(3)冲洗结束后，使用压缩空气将水排出，拆下硅胶，置于105℃鼓风烘箱烘干至水分含量达到3％。烘干后的硅胶降至室温，呈现出灰白色。
对比例1
与实施例相同，区别在于步骤(1)中，无水乙醇中不添加乙二醇聚氧乙烯醚400(SIGMA)，HPLC检测发现依然有杂质峰出现。继续冲洗3个柱体积后，取样柱顶部流出的再生溶液，HPLC检测无峰出现。
实施例2
(1)含非离子表面活性剂的高级性溶剂配置：精确称取无水乙醇5L，加入5g乙二醇聚氧乙烯醚400(SIGMA)。充分混匀，静置30min等待溶液稳定。
层析柱内径20mm，柱长200mm，柱中装载已经使用过一次的环孢素A层析硅胶35g。从柱顶部压入压缩空气排除柱中残留的洗脱液，当柱底无洗脱液流出时，将上述配置好的溶剂从柱底以6.0ml/min反向冲洗2个柱体积。冲洗过程结束时取样柱顶部流出的上述配置的溶剂，HPLC检测应当无峰出现，如图2所示。
(2)含双氧水的去离子水配置：在4.5L的去离子水中加入0.5L 1％的双氧水，充分混合均匀。检测溶液pH，溶液为中性或者弱酸性；静置30min等待溶液稳定。
将配置好的含双氧水的去离子水从柱顶部以6.0ml/min的流速泵入冲洗硅胶，1个柱体积冲洗结束后使用去离子水冲洗一个柱体积。柱底部流出的去离子水应当无明显的含非离子表面活性剂的高级性溶剂的气味。冲洗结束使用压缩空气将水压干，拆下硅胶，置于105℃真空干燥箱烘干至水分含量达到8％。烘干后的硅胶降至室，呈现出灰白色。
实施例3
如图1所示，本发明所述的再生硅胶分离纯化环孢素A的方法，具体为：
(1)使用再生硅胶装柱，层析柱内径40mm，柱长400mm，采用干法装柱；称取再生后的硅胶36g装入柱体，使用橡皮锤敲打柱体，排除柱体空气，使硅胶装的紧密；装好的硅胶柱子应当紧密，柱子上端口应当平整。
(2)装好的柱子使用乙酸乙酯：石油醚＝3:7的平衡液平衡2个柱体积，平衡流速5ml/min。
(3)取22g环孢素A粗品溶解于20ml平衡液，充分搅拌溶解后上样，上样结束使用平衡液平衡1.5个柱体积。使用乙酸乙酯：石油醚＝7:3配比的洗脱液洗脱并分段收集，使用HPLC检测收集的洗脱液，合并合格部分。
如图3所示，再生硅胶层析合并液检测，主峰峰面积占比99.2％，两个已知杂质占比分别为0.3％与0.4％；合并液主峰HPLC面积归一法含量98.5％以上。
一共收集约5个柱体积的合格洗脱液，结果如表1所示，合格环孢素A层析收率为69.3％。
表1再生硅胶分离纯化环孢素A主要流份效价、含量
实施例4
如图1所示，使用再生两次的硅胶分离纯化环孢素A，具体为：
(1)层析柱内径40mm，柱长400mm，采用干法装柱再生两次的硅胶35g，使用橡皮锤敲打柱体，使硅胶装的紧密。装好的柱子使用乙酸乙酯：石油醚＝3:7的平衡液平衡2.5个柱体积，平衡流速5ml/min。
(2)取23.5g环孢素A粗品溶解于20ml平衡液，充分搅拌溶解后上样，上样结束使用平衡液平衡2个柱体积。使用乙酸乙酯：石油醚＝6.5:3.5配比的洗脱液洗脱并分段收集，使用HPLC检测收集的洗脱液，合并合格部分。
合并液主峰HPLC面积归一法含量98.5％以上。
一共收集约5个柱体积的合格洗脱液，结果如表2所示，合格环孢素A层析收率为68.3％。
表2再生两次的硅胶分离纯化环孢素A层主要流份效价、含量
Claims (9)
1.一种环孢素A层析硅胶的再生方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将经分离提纯环孢素A后硅胶柱内残留的溶剂排干；使用含非离子表面活性剂的高级性溶剂从硅胶柱底部进行冲洗；
(2)然后先使用含双氧水的去离子水，再使用去离子水进行冲洗；
(3)排干水分，取出硅胶，烘干后重新装柱。
2.根据权利要求1所述的一种环孢素A层析硅胶的再生方法，其特征在于：步骤(1)中，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯、乙二醇聚氧乙烯醚中的一种或两者的混合液。
3.根据权利要求1或2所述的一种环孢素A层析硅胶的再生方法，其特征在于：所述含非离子表面活性剂的高级性溶剂中非离子表面活性剂终浓度为0.1-0.5g/L。
4.根据权利要求1所述的一种环孢素A层析硅胶的再生方法，其特征在于：步骤(1)中，所述高级性溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种环孢素A层析硅胶的再生方法，其特征在于：步骤(1)中，所述冲洗为反向冲洗。
6.根据权利要求5所述的一种环孢素A层析硅胶的再生方法，其特征在于：所述反向冲洗的流速0.5-1.5cm/min。
7.根据权利要求1所述的一种环孢素A层析硅胶的再生方法，其特征在于：步骤(2)中，所述含双氧水的去离子水中双氧水终浓度为0.1％-0.5％。
8.根据权利要求1所述的一种环孢素A层析硅胶的再生方法，其特征在于：步骤(2)中，所述含双氧水的去离子水的冲洗流速0.5-1.5cm/min。
9.根据权利要求1所述的一种环孢素A层析硅胶的再生方法，其特征在于：步骤(3)中，所述烘干的温度为80-105℃，烘干后的水分含量为3％-8％。
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