CN114405063B - 一种在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，包括：（a）MOF材料的合成；（b）MOF材料的衍生化；（c）整体柱的制备；（d）在线富集纯化香叶木素；（e）分离香叶木素。本发明中制备的MOF/聚合物整体柱，改善了传统聚合物整体柱比表面积小、孔隙率低的不足，增强了其对香叶木素的吸附性能，此材料能对香叶木素实现有效的分离和富集。同时，采用正相色谱和反相色谱相结合的方式，增强了香叶木素与杂质的分离效果，能够有效制得高纯度香叶木素。此方法具有操作简单、经济有效的优点。

Description

一种在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法
技术领域
本发明涉及香叶木素分离纯化技术领域，具体地说是涉及一种在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法。
背景技术
香叶木素(Diosmetin)是一种来自天然中草药中的黄酮类化合物，在柑橘类的水果中含量丰富，也存在于一些蔷薇科和十字花科的药用植物中。其具有抗炎、抗菌、抗氧化、抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡的作用，在多种疾病的治疗方面拥有广泛的应用。
香叶木素具有多种药理活性，应用前景十分广泛，其主要从药用植物中提取，但是中草药的提取液组分复杂，杂质较多，通常采用萃取、层析、重结晶等一系列方式来获取香叶木素。此种方式使用大量有机溶剂，污染较大，且成本较高。因此，开发一种便捷高效的新方法从天然药用植物中富集和分离香叶木素是十分有意义的。
高效液相色谱法（HPLC）是一种重要的分离分析技术，它是利用不同物质在流动相和固定相中具有不同的分配系数，当流动相流过固定相时，物质在其中进行反复多次的分配，从而使各物质得到分离。按照固定相和流动相的相对极性，可以分为正相色谱和反相色谱两种，由于两者的分离对象不同，对于成分复杂的样品来说，采用两者结合的方式往往能得到更好的分离效果。
聚合物整体柱虽然是用作固相萃取的常用材料，但其本身存在比表面积小，孔隙率低的不足。而MOFs材料用于固相萃取领域时亦存在孔隙不均匀，难回收，机械稳定性差等问题。为了解决上述问题，本发明研究一种MOF/聚合物复合材料，有望在提高聚合物整体柱的孔隙率和比表面积的同时也加强了MOFs材料的机械稳定性，为从天然药用植物中富集和分离香叶木素提供一种有效可行的方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，以解决现有香叶木素的分离纯化方法使用大量有机溶剂，污染较大，且成本较高的问题。
本发明技术方案为：一种在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，包括以下步骤：
（a）MOF材料的合成
将2-氨基对苯二甲酸和九水合硝酸铬加入到去离子水中，在130-170℃下反应10-14h，将所得反应液进行离心，所得固体经洗涤后置于无水乙醇中，然后在90-110℃下钝化10-14h，再经离心、干燥，得到MOF材料；
（b）MOF材料的衍生化
依次将2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、甲基丙烯酸、三乙胺和MOF材料加入到N,N-二甲基甲酰胺中，25-35℃下搅拌反应8-12h，将所得反应液进行离心，所得固体经洗涤、干燥后得到衍生化的MOF材料；
（c）整体柱的制备
将衍生化的MOF材料、甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TMPTMA）、过氧化二苯甲酰（BPO）、二元致孔剂加入到反应器中，混合均匀并超声震荡0.5-1.5h，之后加入N,N-二甲基苯胺，混合均匀后倒入干净的空柱管中，密封，在25-35℃水浴下反应3-4h，取出经冲洗后得到MOF/聚合物整体柱；
（d）在线富集纯化香叶木素
将MOF/聚合物整体柱接入高效液相色谱仪中，在富集流动相下将蒲公英提取液注入，经MOF/聚合物整体柱进行富集并去除部分杂质，然后将C18分析柱接在MOF/聚合物整体柱后面，使用洗脱流动相将吸附在整体柱上的香叶木素洗脱并进行分析；
（e）分离香叶木素
将MOF/聚合物整体柱富集纯化后的洗脱液浓缩，浓缩液依次经反相色谱柱、正相色谱柱分离后，得到高纯度的香叶木素。
步骤（a）中，2-氨基对苯二甲酸和九水合硝酸铬的质量比为1.80 g : 3.80 ~4.20 g。
步骤（a）中，在去离子水中加入氢氧化钠，所述氢氧化钠与2-氨基对苯二甲酸的质量比为0.9 ~ 1.0 g : 1.80 g。
步骤（b）中，2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、甲基丙烯酸、三乙胺、MOF材料和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为2.3 ~ 2.5 g : 0.50 ~ 0.60 mL :1.30 ~ 1.40 mL : 0.45 ~ 0.50 g : 30 mL。步骤（a）和（b）中，洗涤操作为：用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和无水乙醇分别洗涤2-4次。
步骤（c）中，衍生化的MOF材料、甲基丙烯酸缩水甘油酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、过氧化二苯甲酰、二元致孔剂和N,N-二甲基苯胺的用量比为0.002 g : 0.25 ~ 0.28mL : 0.25 ~ 0.35 mL : 0.003 ~ 0.004 g : 1.7 mL : 25 ~ 35 µL。
步骤（c）中，所述二元致孔剂为聚乙二醇、正丙醇、异丙醇中的两种。
步骤（c）中，所述冲洗操作为：用甲醇先以0.1 mL/min的流速冲洗，然后逐渐升高流速至1.0 mL/min，并在此流速下继续冲洗30 min。
步骤（d）中，蒲公英提取液制备为：将蒲公英粉碎，置于水和乙醇的混合提取液中，在65-75℃下提取50-90min，过滤，取滤液进行浓缩，经0.45um滤膜过滤后得到蒲公英提取液。
步骤（d）中，所述富集流动相为乙腈/水，比例为15/85（v/v）~ 10/90（v/v），所述洗脱流动相为乙腈/水，比例为60/40（v/v）~ 65/35（v/v）；步骤（e）中，反相色谱柱为5 C18-MS-Ⅱ（250 × 10 mm i.d.），流动相为乙腈/水（40/60, v/v），正相色谱柱为HPLCONE 5SIL（250 × 10 mm i.d.），流动相为正己烷/异丙醇（80/20, v/v）。
本发明中制备的MOF/聚合物整体柱，改善了传统聚合物整体柱比表面积小、孔隙率低的不足，增强了其对香叶木素的吸附性能，此材料能对香叶木素实现有效的分离和富集。同时，采用正相色谱和反相色谱相结合的方式，增强了香叶木素与杂质的分离效果，能够有效制得高纯度香叶木素。此方法具有操作简单、经济有效的优点。
附图说明
图1是MOF材料（a）与使用方法1（b）和方法2（c）得到的衍生化MOF材料的红外光谱对比图。
图2是不同整体柱对香叶木素的在线固相萃取的结果对比。
图3是MOF/聚合物整体柱电镜图。
图4是流动相中乙腈含量对香叶木素富集时的回收率（A）和洗脱时回收率（B）的影响。
图5是 MOF/聚合物整体柱（a）和未添加MOF材料的聚合物整体柱（b）对香叶木素的吸附量对比。
图6是富集流动相中乙腈含量对蒲公英中香叶木素的富集及杂质去除能力的影响。其中，A：对香叶木素进行富集；B：将富集后的香叶木素进行洗脱；a、b、c、d所用富集流动相的乙腈含量分别为0%、5%、10%、15%，洗脱流动相均为乙腈/水（60/40，v/v）。
图7是不同进样体积下蒲公英中香叶木素的富集效果。a、b、c的进样体积分别为40µL、20µL、10µL。
图8是制备反相色谱中流动相组成对香叶木素纯化效果的影响。a：乙腈/水（40/60，v/v）；b：甲醇/水（70/30，v/v）；c：乙腈/水（60/40，v/v）；d：甲醇/水（60/40，v/v）。
图9是制备正相色谱中流动相组成对香叶木素纯化效果的影响。a：乙酸乙酯/环己烷（60/40，v/v）；b：异丙醇/环己烷（30/70，v/v）；c：异丙醇/环己烷（20/80，v/v）；d：对照品。
图10 是最优条件下分离得到的香叶木素（a）与对照品（b）在相同条件下的对比色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用原料或试剂除另有说明外均为市售品，可通过商业渠道购得。
实施例1 MOF材料的合成
依次将2-氨基对苯二甲酸（1.80 g）、九水合硝酸铬（4.0 g）和氢氧化钠（0.9 g）加入75 mL去离子水中并转移至反应釜，150 °C反应12 h，将反应所得混合物离心，将得到的固体用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和无水乙醇分别洗涤三次，洗涤后的沉淀放入75 mL无水乙醇中并转移至反应釜，100 °C反应12 h对材料进行纯化，离心，干燥，得MOF材料。
实施例2 MOF材料的衍生化（方法1）
依次将甲基丙烯酸（0.50 mL）、实施例1制备的MOF材料（0.20 g）加入20 mL去离子水中，超声30 min，待MOF材料均匀分散在溶液中后，在搅拌的条件下60℃水浴加热12 h，所得沉淀用无水乙醇洗涤三次，干燥，得固体材料。
实施例3 MOF材料的衍生化（方法2）
依次将2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（2.3 g）、甲基丙烯酸（0.50 mL）、三乙胺（1.39 mL）和0.5 g实施例1制得的MOF材料加入30 mL DMF中，30°C下搅拌反应10 h，所得沉淀用DMF和无水乙醇分别洗涤三次，干燥，得固体材料。
使用方法1和方法2衍生化后得到的MOF材料与原MOF材料的红外光谱对比图如图1所示，可以看出使用方法2得到的衍生化材料的红外光谱图在1680 cm-1处出现了C=C的伸缩振动峰，而使用方法1得到的衍生化材料的红外光谱图在1600~1700 cm-1范围内并没有出现C=C的伸缩振动峰，因此，方法1衍生化失败，方法2衍生化成功。
实施例4 MOF/聚合物整体柱的制备（a）
将衍生化的MOF材料（0.002 g）、BPO（3 mg）、GMA（0.25 mL）、TMPTMA（0.30 mL），聚乙二醇200（0.90 mL）、正丙醇（0.80 mL）依次加入干净的离心管中，涡旋2 min以混匀，超声震荡1 h，随后加入30 µL DMA，震荡混匀，将混合溶液倒入事先包好的干净的空柱管中，密封，在30 °C水浴下反应3.5 h后取出，用甲醇先以0.1 mL/min的流速冲洗，然后逐渐升高流速至1.0 mL/min，并在此流速下继续冲洗30 min，以除去整体柱中未反应的单体、交联剂以及致孔剂。
实施例5 MOF/聚合物整体柱的制备（b）
将衍生化的MOF材料（0.002 g）、BPO（3 mg）、GMA（0.25 mL）、TMPTMA（0.30 mL）、十二醇（0.25 mL）、环己醇（0.60 mL）依次加入干净的离心管中，后续处理如实施例4。
实施例6 MOF/聚合物整体柱的制备（c）
将衍生化的MOF材料（0.002 g）、BPO（3 mg）、N-异丙基丙烯酰胺（0.1 g）、TMPTMA（0.30 mL）、聚乙二醇200（0.90 mL）、正丙醇（0.80 mL）依次加入干净的离心管中，后续处理如实施例4。
实施例7 MOF/聚合物整体柱的制备（d）
将衍生化的MOF材料（0.002 g）、BPO（3mg）、GMA（0.25 mL）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（0.60 mL）、聚乙二醇200（0.90 mL）、正丙醇（0.80 mL）依次加入干净的离心管中，后续处理如实施例4。
将上述四种整体柱分别用于香叶木素的在线固相萃取并经C18柱在线分析，分析结果对比如图2所示，可以看出，整体柱a对香叶木素的富集分析效果最好，整体柱b和d可能因为结构不均匀或柱体塌陷等原因导致香叶木素的色谱峰出现分叉现象，整体柱c对香叶木素没有吸附能力导致香叶木素无法富集在整体柱上，因此富集过程完成后没有香叶木素从整体柱被洗脱下来。整体柱a的电镜图如图3所示。
实施例8 不加MOF材料的聚合物整体柱的制备及与MOF/聚合物整体柱的对比
BPO（3 mg）、GMA（0.25 mL）、TMPTMA（0.30 mL）、聚乙二醇200（0.90 mL）和正丙醇（0.80 mL）依次加入干净的离心管中，后续处理同实施例4中MOF/聚合物整体柱的制备。
通过氮吸附/脱附法测出不加MOF材料的聚合物整体柱的比表面积为10.4861m2/g，MOF/聚合物整体柱的比表面积为21.2293m2/g，证明MOF材料的添加增加了聚合物整体柱的比表面积。
实施例9 固相萃取过程
将MOF/聚合物整体柱作为SPE柱接入高效液相色谱中，将1mg/mL的香叶木素对照品溶液注入，使用富集流动相对香叶木素进行富集，富集完成后，将C18柱接在MOF/聚合物整体柱后，使用洗脱流动相将富集在整体柱上的香叶木素进行洗脱并分析。图4为流动相中乙腈含量对香叶木素富集时的回收率（A）和洗脱时的回收率（B）影响，可以看出，当富集流动相为100%水时，香叶木素的回收率最高；当洗脱流动相为乙腈/水（60/40，v/v）时，香叶木素的回收率最高，所以分别选定100%水和乙腈/水（60/40，v/v）为流动相对香叶木素进行富集和洗脱。
为了测试整体柱对香叶木素的吸附容量，使用100%水为富集流动相，将不同量的香叶木素标准溶液注入整体柱中。然后将C18柱连接在整体柱后面并用乙腈/水（60/40，v/v）为流动相洗脱。由图5可以看出，随着注射量的增大，香叶木素吸附在整体柱上的量相应增大，当整体柱对香叶木素的吸附达到饱和后，吸附量不再增加。结果表明，不加MOF材料的聚合物整体柱对香叶木素的最大吸附量为14.93 mg/g，MOF/聚合物整体柱对香叶木素的最大吸附量为19.43 mg/g，证明MOF材料的添加可以增加聚合物整体柱对香叶木素的吸附能力。
实施例10 蒲公英中香叶木素的富集纯化
MOF/聚合物整体柱作为SPE柱接入高效液相色谱中，将蒲公英提取液注入，分别使用不同的流动相将香叶木素在整体柱上进行富集纯化，随后将C18柱接在SPE柱后面，使用洗脱流动相将富集在整体柱上的物质洗脱并进行分析。由图6A可以看出，在保证香叶木素不被冲下来的情况下，当富集流动相中乙腈含量越高，洗脱下来的杂质越多。对应地，当用洗脱流动相洗脱时，跟香叶木素一起洗脱下来的杂质就越少（图6B）。因此，综合考虑富集和纯化的效果，选择乙腈/水（15/85，v/v）作为蒲公英中香叶木素富集的流动相。
在富集流动相下将不同量的蒲公英提取液注入高效液相色谱仪中，富集完成后进行洗脱并用C18柱进行分析以考察整体柱的实际应用能力。由图7可以看出，随着进样量的增加，整体柱上富集的香叶木素的量也随之增加，证明此MOF/聚合物整体柱成功应用于蒲公英中香叶木素的富集纯化。
实施例11 高纯度香叶木素的制备
将固相萃取过程中得到的洗脱液浓缩、过滤，得到溶液1，将制备反相色谱柱接入高效液相色谱系统中，使用不同的流动相对溶液1进行分离，当香叶木素出峰时，接取含有香叶木素的流出液并浓缩，得到溶液2，用C18分析柱对其进行分析，结果如图8所示，可以看出，当反相制备色谱的流动相为乙腈/水（40/60，v/v）时，接出液中香叶木素峰附近杂质最少，因此，选择乙腈/水（40/60，v/v）作为反相制备色谱流动相对香叶木素进行初步分离。
将制备正相色谱柱接入高效液相色谱系统中，使用不同的流动相将溶液2在制备正相色谱柱上分离，当香叶木素出峰时，接取含有香叶木素的流出液并浓缩，得到溶液3，随后用C18分析柱对其进行分析，结果如图9所示，可以看出当正相制备色谱流动相为异丙醇/环己烷（20/80，v/v）时，得到的香叶木素纯度最高，接近香叶木素对照品，因此，选择异丙醇/环己烷（20/80，v/v）作为制备正相色谱流动相对香叶木素进行分离。
实施例12 自制香叶木素的纯度验证
将最优条件下制得的溶液3烘干，加入甲醇配制成香叶木素溶液，另外配制香叶木素对照品溶液，使用C18分析柱在相同条件下分别进样分析，得到的结果对比如图10所示，可以看出，使用上述方法分离得到的香叶木素与对照品相比无其它杂质峰出现，纯度达到98%。

Claims (10)

1.一种在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）MOF材料的合成
将2-氨基对苯二甲酸和九水合硝酸铬加入到去离子水中，在130-170℃下反应10-14h，将所得反应液进行离心，所得固体经洗涤后置于无水乙醇中，然后在90-110℃下钝化10-14h，再经离心、干燥，得到MOF材料；
（b）MOF材料的衍生化
依次将2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、甲基丙烯酸、三乙胺和MOF材料加入到N,N-二甲基甲酰胺中，25-35℃下搅拌反应8-12h，将所得反应液进行离心，所得固体经洗涤、干燥后得到衍生化的MOF材料；
（c）整体柱的制备
将衍生化的MOF材料、甲基丙烯酸缩水甘油酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、过氧化二苯甲酰、二元致孔剂加入到反应器中，混合均匀并超声震荡0.5-1.5h，之后加入N,N-二甲基苯胺，混合均匀后倒入干净的空柱管中，密封，在25-35℃水浴下反应3-4h，取出经冲洗后得到MOF/聚合物整体柱；
（d）在线富集纯化香叶木素
将MOF/聚合物整体柱接入高效液相色谱仪中，在富集流动相下将蒲公英提取液注入，经MOF/聚合物整体柱进行富集并去除部分杂质，然后将C18分析柱接在MOF/聚合物整体柱后面，使用洗脱流动相将吸附在整体柱上的香叶木素洗脱并进行分析；
（e）分离香叶木素
将MOF/聚合物整体柱富集纯化后的洗脱液浓缩，浓缩液依次经反相色谱柱、正相色谱柱分离后，得到高纯度的香叶木素。
2.根据权利要求1所述的在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，其特征在于，步骤（a）中，2-氨基对苯二甲酸和九水合硝酸铬的质量比为1.80 : 3.80 ~ 4.20 。
3.根据权利要求1所述的在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，其特征在于，步骤（a）中，在去离子水中加入氢氧化钠，所述氢氧化钠与2-氨基对苯二甲酸的质量比为0.9 ~1.0 g : 1.80 g。
4.根据权利要求1所述的在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，其特征在于，步骤（b）中，2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、甲基丙烯酸、三乙胺、MOF材料和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为2.3~2.5g:0.50~0.60 mL:1.30~1.40 mL:0.45~0.50g:30 mL。
5.根据权利要求1所述的在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，其特征在于，步骤（a）和（b）中，洗涤操作为：用N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醇分别洗涤2-4次。
6.根据权利要求1所述的在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，其特征在于，步骤（c）中，衍生化的MOF材料、甲基丙烯酸缩水甘油酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、过氧化二苯甲酰、二元致孔剂和N,N-二甲基苯胺的用量比为0.002 g : 0.25 ~ 0.28 mL : 0.25~ 0.35 mL : 0.003 ~ 0.004 g : 1.7 mL : 25 ~ 35 µL。
7.根据权利要求1所述的在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，其特征在于，步骤（c）中，所述二元致孔剂为聚乙二醇、正丙醇、异丙醇中的两种。
8.根据权利要求1所述的在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，其特征在于，步骤（c）中，所述冲洗操作为：用甲醇先以0.1 mL/min的流速冲洗，然后逐渐升高流速至1.0 mL/min，并在此流速下继续冲洗30 min。
9.根据权利要求1所述的在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，其特征在于，步骤（d）中，蒲公英提取液制备为：将蒲公英粉碎，置于水和乙醇的混合提取液中，在65-75℃下提取50-90min，过滤，取滤液进行浓缩，经0.45um滤膜过滤后得到蒲公英提取液。
10.根据权利要求1所述的在线富集纯化蒲公英中香叶木素的方法，其特征在于，步骤（d）中，所述富集流动相为乙腈/水，体积比为15/85~ 10/90，所述洗脱流动相为乙腈/水，体积比为60/40~ 65/35；步骤（e）中，反相色谱柱为5 C18-MS-Ⅱ，流动相为乙腈/水，体积比为40/60，正相色谱柱为HPLCONE 5SIL，流动相为正己烷/异丙醇，体积比为80/20。
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