CN109053433B - 一种组合制备银杏酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用pH‑区带逆流色谱法分离总银杏酸提取物中银杏酸单体的方法，通过β‑环糊精包合银杏酸的方式提高亲水性，从而改善提取物在两相中的分配比例，采用的两相溶剂体系为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水(2:1:1.5:1，v/v)。本发明方法能够实现一次性分离出白果新酸、白果酸、十七烷二烯银杏酸、氢化白果酸、十七烷一烯银杏酸，五种高纯度的银杏酸单体化合物，制备方法简便高效，成本经济，适用于工业生产，具有重要的经济意义。

Description

一种组合制备银杏酸的方法

技术领域

本发明涉及一种中药有效成分的分离纯化方法，具体为应用pH-区带逆流色谱分离银杏酸类单体化合物(白果新酸、白果酸、十七烷二烯银杏酸、氢化白果酸、十七烷一烯银杏酸)的方法。

背景技术

银杏酸类化合物是银杏中叶、白果和果皮中除了黄酮和内酯外的另一类重要的药效成分，是6-烯基水杨酸的衍生物。现代药理研究表明，银杏酸类成分具有抗病毒、抑菌、抗炎、抗癌、抗寄生虫等多种药理活性。由于银杏酸成分是一种低极性结构类似物，分离难度高。传统的单体成分的分离方法包括硅胶柱色谱、制备液相色谱、大孔树脂等，其局限性是费时费力、污染环境、样品纯度低，而且反复柱层析对样品有不可逆性吸附作用，分离得到银杏酸类化合物单体制备效率低、成本较高。

高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是近30年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液-液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的样品易被死吸附、损耗和变性等各种问题，使用其它液相色谱法进行制备型分离时，其分配效率会显著降低，溶剂消耗量大，HSCCC保证较高峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。高速逆流色谱能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。pH-区带逆流色谱是在逆流色谱基础上发展起来的一种新型制备型分离技术，利用物质解离常数和疏水性的不同进行分离，具有分离量大、分离效果好等优点，广泛的应用于生物碱和有机酸类成分的分离。

虽然现有技术中有利用pH-区带精制逆流色谱分离中药中生物碱的报道，本领域公知，pH-区带精制逆流色谱分离中所用到的溶剂系统是影响分离结果的关键因素之一，常用到的溶剂有甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、氯仿、乙腈等，每一溶剂系统中所使用的溶剂至少为两种。中药的提取分离，其中所包含的化合物成分复杂、含量也不明确。因此，溶剂体系的探索是一项复杂、艰巨的工作，现有技术中的提取方式往往不具备借鉴意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种成本经济、操作简便、高效、可工业转化的，从银杏果皮中分离制备出多种高纯度银杏酸类单体化合物的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供一种分离总银杏酸中单体化合物的方法，包括以下步骤：

(1)将银杏果外种皮与白果分离，外种皮置于阴凉处干燥，干燥后的外种皮采用石油醚提取，得到总银杏酸提取物。

优选的，干燥后的外种皮，用石油醚(沸程60-90℃)回流提取3次，每次2-3h，然后将提取物使用真空过滤装置过滤。合并所有提取液，在55±5℃下旋转蒸发至干，得到总银杏酸提取物，将其储存在4℃的冰箱中进行进一步的区带逆流色谱分离纯化。

进一步的，银杏外种皮与石油醚的配比为，每1kg外种皮需要加入2-2.5L石油醚。

(2)将总银杏酸提取物进行β-环糊精包合，提高银杏酸的亲水性，得到β-环糊精-银杏酸包合物。

优选的，取蒸馏水加入β-环糊精于60±5℃进行磁力搅拌，转速为1000转/分钟，至完全溶解，再加入所述银杏酸总提取物，避光60±5℃搅拌48h，将溶液于40±5℃蒸干水分，得β-环糊精-银杏酸包合物。

进一步的，上述操作中蒸馏水：β-环糊精：银杏酸总提取物的配比为1L：15g：5g。

(3)将上述β-环糊精-银杏酸包合物采用pH-区带逆流色谱进行分离和富集，得到相应的组分，所述pH-区带逆流色谱采用的两相溶剂体系为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水。

优选的，将两相溶剂体系正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水，摇匀后置于分液漏斗中平衡一段时间，待分层后将上下两相分开，上相中加入盐酸当成保留酸，下相加三乙胺当做洗脱碱，取所述β-环糊精-银杏酸包合物，溶解于10mL酸化的上相和10mL未碱化的下相待用；采用半制备型高速逆流色谱仪，由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成。首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵；开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱；设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵送流动相，然后根据紫外光谱检测结果，对各组分进行接收，得到混合组分I和IV，单体组分2，3，4。

优选的，两相溶剂体系为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为2:1:0.5-1.5:1；进一步优选的，体积比为2:1:1.5:1。

进一步的，上述盐酸与三乙胺的毫摩尔比为8:1。

(4)将富集组分进行循环逆流色谱模式分离纯化，制得β-环糊精-银杏酸包合物单体，所述循环逆流色谱采用的两相溶剂体系为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸。

本发明中，循环逆流方法较常规逆流色谱增加了一个六通阀或者两个三通阀，可以实现常规分离模式和循环分离模式的切换。

优选的，步骤(4)的操作为：

1)切换六通阀至常规分离模式，将逆流色谱两相溶剂体系进行流体动力学平衡，平衡好后，将组分I或IV进样，所述两项溶剂体系为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸，体积比为5:4:1:1；

进一步的，切换六通阀至常规分离模式，将两相溶剂体系正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸(5:3.5-4.5:0.5-1.5:0.5-1.5，v/v)按比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后平衡一段时间，待将上下两相分开，取组分I或IV粗品，溶解于5mL和5mL下相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。

进一步优选的，两相溶剂体系为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸，体积比为5:4:1:1。

2)切换六通阀，进行样品的循环逆流色谱，实现样品的内循环分离；

3)待分离的样品充分分离后，切换六通阀，进入常规洗脱模式，依据紫外光谱检测结果依次对分离组分进行接收；高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量500mg，转速800转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min，检测波长254nm。

进一步的，所述组分I经过11次内循环得到单体组分1和单体组分2；所述组分IV经过8次内循环得到单体组分4和单体组分5。最终得到单体组分1-5五种单体化合物包合物。

(5)向上述包合物单体溶液中加入盐溶液，将β-环糊精与银杏酸单体解离，再加入低极性溶剂萃取，减压干燥即得银杏酸单体。

优选的，所述步骤(5)的具体操作为：向所述单体组分1-5的溶液中加入0.1M氯化钠溶液，于55±5℃加热15min，再加入正己烷萃取，将正己烷层转移并减压浓缩干燥，即得银杏酸单体化合物1-5。

本发明的有益效果

银杏酸成分作为一种低极性结构类似物，分离难度高，现有技术中没有较为有效的分离方法。本发明的制备方法成本经济，操作简便，效率高，可以较大批量从中药银杏果中，分离制备出纯度大于95％的白果新酸、白果酸、十七烷二烯银杏酸、氢化白果酸、十七烷一烯银杏酸，五种单体化合物，大大提高了提取分离的效率。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1本发明的工艺流程图；

图2银杏酸总样的区带逆流色谱分离图；

图3组分I的循环逆流色谱图；

图4组分IV的循环逆流色谱图；

图5银杏酸类粗提物与逆流色谱各部分的高效液相色谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

下面结合具体实施例及附图对本发明进行说明。

实施例1：

1.样品提取

将银杏果外种皮与白果分离，外种皮置于阴凉处干燥，干燥后的外种皮5kg，用10L石油醚(沸程60-90℃)回流提取3次，每次2h，然后将提取物使用真空过滤装置过滤。合并所有提取液，在55℃下旋转蒸发至干，得到总银杏酸提取物247g，将其储存在4℃的冰箱中进行进一步的区带逆流色谱分离纯化。

2.β-环糊精-银杏酸包合物

取2L蒸馏水加入β-环糊精30g于60℃进行磁力搅拌，转速为1000转/分钟，至完全溶解，再加入10g银杏酸总提取物，避光60℃搅拌48h，将溶液于40℃蒸干水分，得β-环糊精-银杏酸包合物。

3.应用pH-区带逆流色谱对总银杏酸提取物进行分离和富集

将两相溶剂体系正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水(2:1:1.5:1，v/v)按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，上相中加入40mmol盐酸当成保留酸，下相加入5mmol三乙胺当成洗脱碱，取β-环糊精-银杏酸包合物2.0g，溶解于10mL酸化的上相和10mL未碱化的下相待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，然后根据检测器紫外光谱图接收图2中组分I-V。经检测，组分II为总样中峰2，组分III为总样中的峰3，组分V为总样中的峰5，组分I为总样中的峰1和2的混合物，组分IV为总样中的峰4和5的混合物，最终将各部分浓缩，组分I和IV进行进一步的循环逆流色谱分离。峰2，3，5即单体化合物2，3，5。

4.应用循环逆流色谱模式分离纯化银杏酸单体

在本发明中，使用循环逆流色谱的分离方法，从组分I和IV中分离四个银杏酸单体。循环逆流方法较常规逆流色谱增加了一个六通阀或者两个三通阀，可以实现常规分离模式和循环分离模式的切换，具体分为3个步骤：1)切换六通阀至常规分离模式，将逆流色谱两相溶剂体系进行流体动力学平衡，平衡好后，先将图2中组分I或IV样品进样；2)切换六通阀，进行样品的循环逆流色谱，实现样品的内循环分离；3)待分离的样品充分分离后，切换六通阀，进入常规洗脱模式，依据紫外检测结果依次将分离得到的峰分管收集。高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量500mg，转速800转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min，检测波长254nm。

具体操作步骤：切换六通阀至常规分离模式，按上述步骤1，将两相溶剂体系正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸(5:4:1:1，v/v)按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取组分I活IV粗品，溶解于5mL和5mL下相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。切换六通阀至循环分离模式，然后根据图3或图4中紫外检测器结果决定是否需要进行常规逆流色谱的切换。待需要分离的峰实现完全分离后，切换六通阀，进行色谱峰的收集，依次得到组分I经过11次内循环得到峰1和2单体，组分IV经过8次内循环得到峰4和5单体。最终分离得到峰1、峰2、峰3、峰4和峰5，五个高纯度单体，液相色谱检测纯度超过95％，检测结果见图5。

5.银杏酸单体的解离

将上述包合物单体溶液加入0.1M氯化钠溶液，于55℃加热15min，再用正己烷萃取，将正己烷层转移并减压浓缩干燥，得高纯度银杏酸单体。

结构鉴定：对分离得到的银杏酸类成分单体与中检所银杏酸混合标样进行高效液相色谱出峰时间比对(图5)。同时采用Agilent 5973N质谱仪获得质谱信息，峰1：319.2[M-H]-1为白果新酸(GA13:0)；峰2：347.3[M-H]-1为白果酸(GA15:1)；峰3：345.3[M-H]-1为十七烷二烯银杏酸(GA17:2)；峰4：373.3[M-H]-1为氢化白果酸(GA15:0)；峰5：371.3[M-H]-1为十七烷一烯银杏酸(GA17:1)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种分离总银杏酸中单体化合物的方法，包括以下步骤：

(1)将银杏果外种皮与白果分离，外种皮置于阴凉处干燥，干燥后的外种皮采用石油醚提取三次，得到总银杏酸提取物；

(2)将总银杏酸提取物进行β-环糊精包合，得到β-环糊精-银杏酸包合物；

(3)将所述β-环糊精-银杏酸包合物采用pH区带逆流色谱进行分离和富集，得到相应组分，所述pH区带逆流色谱采用的两相溶剂体系为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水；

(4)将富集组分进行循环逆流色谱模式分离纯化，制得β-环糊精-银杏酸包合物单体，所述循环逆流色谱采用的两相溶剂体系为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸；

(5)将上述包合物单体溶液加入盐溶液，将β-环糊精与银杏酸单体解离，加入低极性溶剂萃取，减压干燥即得银杏酸单体；

步骤(3)中，所述pH区带逆流色谱两相溶剂体系中正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水的体积比为2:1:0.5-1.5:1；将两相溶剂体系正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水，摇匀后置于分液漏斗中平衡一段时间，待分层后将上下两相分开，上相中加入盐酸进行酸化，下相加三乙胺进行碱化，所述盐酸与三乙胺的毫摩尔比为8:1；

步骤(4)中，正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸的体积比为5:3.5-4.5:0.5-1.5:0.5-1.5。

2.如权利要求1所述的一种分离总银杏酸中单体化合物的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作为：将银杏果外种皮与白果分离，外种皮置于阴凉处干燥，干燥后的外种皮，用石油醚回流提取3次，每次2-3h，然后将提取物使用真空过滤装置过滤，合并所有提取液，55±5℃旋蒸除去溶剂，得到总银杏酸提取物。

3.如权利要求2所述的一种分离总银杏酸中单体化合物的方法，其特征在于，所述外种皮与石油醚的配比为，1kg外种皮需要加入2-2.5L石油醚。

4.如权利要求1所述的一种分离总银杏酸中单体化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作为：取蒸馏水加入β-环糊精于60±5℃进行磁力搅拌，转速为1000转/分钟，至完全溶解，再加入所述银杏酸总提取物，避光60±5℃搅拌48h，将溶液于40±5℃蒸干水分，得β-环糊精-银杏酸包合物。

5.如权利要求4所述的一种分离总银杏酸中单体化合物的方法，其特征在于，所述蒸馏水：β-环糊精：银杏酸总提取物的配比为1L：15g：5g。

6.如权利要求1所述的分离总银杏酸中单体化合物的方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作为：将两相溶剂体系正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水，摇匀后置于分液漏斗中平衡一段时间，待分层后将上下两相分开，上相中加入盐酸进行酸化，下相加三乙胺进行碱化，取所述β-环糊精-银杏酸包合物，溶解于10mL酸化的上相和10mL未碱化的下相待用；采用半制备型高速逆流色谱仪，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵；开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱；设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，然后根据紫外光谱检测结果，对各部分组分进行接收，得到混合组分I和IV，单体组分2，3，4；所述固定相为上相，流动相为下相。

7.如权利要求1所述的分离总银杏酸中单体化合物的方法，其特征在于，所述步骤(4)的操作为：

1)切换六通阀至常规分离模式，将逆流色谱两相溶剂体系进行流体动力学平衡，平衡好后，将组分I或IV进样；

2)切换六通阀，进行样品的循环逆流色谱，实现样品的内循环分离；

3)待分离的样品充分分离后，切换六通阀，进入常规洗脱模式，依据紫外光谱检测结果依次对分离组分进行接收；高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量500mg，转速800转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min，检测波长254nm。

8.如权利要求7所述的分离总银杏酸中单体化合物的方法，其特征在于，所述组分I经过11次内循环得到单体组分1和单体组分2；所述组分IV经过8次内循环得到单体组分4和单体组分5。

9.如权利要求1所述的一种分离总银杏酸中单体化合物的方法，其特征在于，所述步骤(5)的具体操作为：向所述单体组分1-5的溶液中加入0.1M氯化钠溶液，于55±5℃加热15min，加入正己烷萃取，将正己烷层转移并减压浓缩干燥，即得银杏酸单体化合物1-5；所述银杏酸单体化合物1为白果新酸；所述银杏酸单体化合物2为白果酸；所述银杏酸单体化合物3为十七烷二烯银杏酸；所述银杏酸单体化合物4为氢化白果酸；所述银杏酸单体化合物5为十七烷一烯银杏酸。

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