CN105732611B - 应用高速逆流色谱分离功劳木中生物碱类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了应用高速逆流色谱分离功劳木中生物碱类化合物的方法，所述分离所用到的条件是：溶剂系统为氯仿：甲醇：0.5mol·L‑1盐酸溶液=3.5‑4.5:1‑2:1.5‑2.5，高速逆流色谱仪柱体积为200‑400，上样量200‑500，转速300‑1000rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速1.5‑2.5 mL/min，检测波长250‑260nm。本发明的方法制备成本低于现有技术，操作简便，效率高，可以较大批量从中药功劳木中，分离制备出纯度大于96%的药根碱、小檗碱、巴马汀、非洲防己碱单体化合物的分离制备方法，本发明首次从中药功劳木中分离出非洲防己碱。

Description

应用高速逆流色谱分离功劳木中生物碱类化合物的方法
技术领域
本发明涉及中药有效成分的分离纯化方法，具体为应用高速逆流色谱分离功劳木中生物碱类化合物(药根碱、小檗碱、巴马汀、非洲防己碱单体)的方法。
技术背景
功劳木为小檗科植物阔叶十大功劳Mahoniabealei(Fort.)Carr或细叶十大功劳Mahoniafortunei(Lindl.)Fedde的干燥茎，其性味苦，寒，具有清热燥湿、泻火解毒之功效。主治湿热泻痢、黄疸尿赤、目赤肿痛、胃火牙痛，疮疖痈肿。功劳木中生物碱类化合物主要为异喹啉类生物碱，包括药根碱、巴马汀和小檗碱，研究结果表明异喹啉类生物碱可以抑制自由基和脂氧合酶活性从而达到抗炎的作用。此外，生物碱的抗氧化能力还与其抗病性、抗逆性及延缓衰老有关。现代药理研究表明，功劳木还具有一定的逆转肿瘤细胞耐药的作用。
现有关于功劳木中生物碱类单体化合物分离制备的文献方法主要采用反复硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱色谱，其局限性是费时费力、污染环境、样品纯度低，而且反复柱层析对样品有不可逆性吸附作用，分离得到生物碱单体制备效率低、成本较高，难以发展成为制备量大的分离技术。
高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是近30年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的样品易被死吸附、损耗和变性等各种问题，使用其它液相色谱法进行制备型分离时，其分配效率会显著降低，溶剂消耗量大，HSCCC保证较高峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。高速逆流色谱能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
虽然现有技术中有利用高速逆流色谱分离中药中生物碱的报道，本领域公知，高速逆流色谱分离中所用到的溶剂系统是影响分离结果的关键因素之一，常用到的溶剂有甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、氯仿、乙腈等，每一溶剂系统中所使用的溶剂至少为两种，不同中药成分所具有的成分，以及生物碱的种类和数量不一样，中药经过提取得到的生物碱总样的成分不同，所以针对不同的中药如何选择溶剂系统的溶剂种类、各溶剂之间的用量比例以及配合该溶剂系统选择怎样的流速、上样量、转速等等才能得到纯度较高的生物碱单体是没有参考价值的。
非洲防己碱具有兴奋子宫的作用，目前已知的来源为小檗科植物日本小檗Berberis thunbergii DC根茎、毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch根茎、防己科植物黄藤Fibraurea tinetoria Lour根、非洲掌叶防己Jatrorrhiza palmata(DC.)Miers(J.columba.Miers)、罂粟科植物博克尼木Bocconia frutesces Linn叶、番荔枝科植物依南木Enantia chlorantha Oliver根。
目前，还没有从功劳木中分离出非洲防己碱的有关报道，也没有利用高速逆流色谱分离功劳木中生物碱的记载。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种应用高速逆流色谱分离功劳木中生物碱类化合物的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种分离功劳木中生物碱类化合物的方法，应用高速逆流色谱分离，所述分离中所用到的条件是：溶剂系统为氯仿：甲醇：0.5mol·L-1盐酸溶液＝3.5-4.5:1-2:1.5-2.5(优选：4:1.5:2)，高速逆流色谱仪柱体积为200-400(优选300mL)，上样量200-500(优选300mg)，转速300-1000rpm(优选800rpm)，上相为固定相，下相为流动相，流速1.5-2.5mL/min(优选2.0mL/min)，固定相保留率71.67％，检测波长250-260nm(优选254nm)。
所述：功劳木中生物碱类化合物的提取方法：(1)采用乙醇对功劳木药材进行提取，将提取液真空浓缩至无醇味，得总提取物；(2)将总提取物调至酸性，石油醚萃取脱脂后，调整至碱性，搅拌沉淀，即为功劳木生物碱粗提物。
应用高速逆流色谱分离的具体步骤如下：
(1)将溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相；
(2)取功劳木生物碱粗提物溶解于体积比为1:1的上相和下相的混合液中待用，所述功劳木生物碱粗提物与混合液的用量关系为20:1(g/L)；
(3)首先使半制备型高速逆流色谱仪进样阀处于进样状态，将固定相用泵以20mL·min-1流速灌满色谱分离柱，停泵，开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，达到设定转速时，设置流动相流速为1.5-2.5mL/min(优选2.0mL/min)，开始泵流动相，达到流体动力学平衡后，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据检测器紫外光谱图接收目标组分，经旋转蒸发，冷冻干燥得固体粉末。
本发明的有益效果：
本发明的方法制备成本低于现有技术，操作简便，效率高，可以较大批量从中药功劳木中，分离制备出纯度大于96％的药根碱、小檗碱、巴马汀、非洲防己碱单体化合物的分离制备方法，本发明首次从中药功劳木中分离出非洲防己碱。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为功劳木生物碱总样分离的高速逆流色谱图；
图3为生物碱总样的高效液相色谱图；
图4为药根碱单体的高效液相色谱图；
图5为小檗碱单体的高效液相色谱图；
图6为巴马汀单体的高效液相色谱图；
图7为非洲防己碱单体的高效液相色谱图；
图8为对比例1功劳木生物碱总样分离的高速逆流色谱图；
图9为对比例2功劳木生物碱总样分离的高速逆流色谱图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
如图1功劳木中单体制备流程图所示。
取功劳木药材2kg粉碎后用95％乙醇回流提取3次(每次2h)，过滤，滤液减压浓缩至无醇味。
将上述浓缩后的提取液，加盐酸调节pH＝3，石油醚萃取3～5次除去脂溶性成分，萃取后的水层加氨水调节pH＝9，过滤得沉淀10.6g，即为所需生物碱总样。
应用高速逆流色谱分离纯化功劳木生物碱总样
溶剂系统为氯仿：甲醇：0.5mol·L-1盐酸溶液＝4:1.5:2，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量300mg，转速800rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min，固定相保留率71.67％，检测波长254nm。
具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取200mg功劳木生物碱粗提物溶解于5mL上相和5mL下相的混合物中待用。采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以流速20mL·min-1灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800rpm时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，达到流体动力学平衡后，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。然后根据检测器紫外光谱图(图2)接收目标成分，得药根碱(15.1mg)，小檗碱(13.4mg)，非洲防己碱(8.6mg)，巴马汀(17.3mg)和未知成分(13.2mg)，HPLC分析纯度均为96％以上。
利用高效液相色谱分析分离物，如图3-图7，液相条件：Kromasil 100-5C18柱(4.6×250mm mm)，紫外检测波长265nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用乙腈：盐溶液(1％三乙胺溶液，用磷酸调pH＝3)＝25:75。
结构鉴定：对分离得到的生物碱应用Agilent 5973N质谱仪和Varian 600MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，1H NMR谱的测定，所得数据如下：
药根碱：UV(λmax,MeOH):264,345nm.Positive ESI-MS m/z 338[M+H]+.1H NMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.86(1H,s,H-8),8.98(1H,s,H-13),8.19(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.01(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.69(1H,s,H-1),6.86(1H,s,H-4),4.91(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.09(3H,s,10-OCH3),4.07(3H,s,9-OCH3),3.94(3H,s,2-OCH3),3.14(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).
小檗碱：UV(λmax,MeOH):263and 346nm.Positive ESI-MS m/z 336[M+H]+.1H NMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.90(1H,s,H-8),8.96(1H,s,H-13),8.21(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.01(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.80(1H,s,H-1),7.09(1H,s,H-4),6.18(2H,s,2,3-OCH2O),4.94(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.10(3H,s,10-OCH3),4.07(3H,s,9-OCH3),3.21(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).
非洲防己碱：UV(λmax,MeOH):263,345nm.Positive ESI-MS m/z 338[M+H]+.1H NMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.88(1H,s,H-8),8.82(1H,s,H-13),8.20(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.06(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.57(1H,s,H-1),7.06(1H,s,H-4),4.93(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.09(3H,s,10-OCH3),4.07(3H,s,9-OCH3),3.90(3H,s,3-OCH3),3.19(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).
巴马汀：UV(λmax,MeOH):272,345nm.Positive ESI-MS m/z 352[M+H]+.1H NMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.90(1H,s,H-8),9.08(1H,s,H-13),8.20(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.04(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.73(1H,s,H-1),7.10(1H,s,H-4),4.96(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.10(3H,s,10-OCH3),4.08(3H,s,9-OCH3),3.94(3H,s,2-OCH3),3.88(3H,s,3-OCH3),3.23(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).
对比例1：
二氯甲烷：甲醇：0.5mol.L-1盐酸溶液＝5:2:3，流速：2mL.min-1，进样量：200mg，固定相保留：60％，转速：800rpm，其他条件与操作都与实施例1中的一样。
对比例2：
二氯甲烷：甲醇：mol.L-1盐酸溶液＝4:1.5:2，流速：2mL.min-1，进样量：200mg，固定相保留：66.7％，转速：800rpm。
由图8和图9可以看出，对比例1与实施例1是在溶剂系统中将三氯甲烷换成了二氯甲烷，并且将溶剂系统的比例发生了改变，就导致各有效成分之间不能分离，对比例2仅仅是在溶剂系统中将三氯甲烷换成了二氯甲烷，溶剂系统的比例都没有改变，同样导致了各有效成分之间不能分离。发明人通过实验发现只有本发明的实验条件才能将功劳木中的生物碱很好的分离出来，并且得到非洲防己碱。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (3)

1.一种分离功劳木中生物碱类化合物的方法，其特征是：应用高速逆流色谱分离，所述分离所用到的条件是：溶剂系统为氯仿：甲醇：0.5mol·L-1盐酸溶液＝4:1.5:2，高速逆流色谱仪柱体积为300ml，上样量300mg，转速800rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min，检测波长254nm。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述功劳木中生物碱类化合物的提取方法：(1)采用乙醇对功劳木药材进行提取，将提取液真空浓缩至无醇味，得总提取物；(2)将总提取物调至酸性，石油醚萃取脱脂后，调整至碱性，搅拌沉淀，即为功劳木生物碱粗提物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述应用高速逆流色谱分离的具体步骤如下：
(1)将溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相；
(2)取功劳木生物碱粗提物溶解于体积比为1:1的上相和下相的混合液中待用，所述功劳木生物碱粗提物与混合液的用量关系为20g:1L；
(3)首先使半制备型高速逆流色谱仪进样阀处于进样状态，将固定相用泵以20mL·min-1流速灌满色谱分离柱；开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，达到设定转速时，设置流动相流速，开始泵流动相，达到流体动力学平衡后，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据检测器紫外光谱图接收目标成分即可。
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Record date: 20191213