CN106866602B - 一种应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，步骤如下：1)取猴头菌发酵菌丝体，采用高纯度乙醇提取，过滤，减压浓缩回收乙醇，再经石油醚和乙酸乙酯萃取得粗提物；2)以氯仿、二氯甲烷、甲醇和水体积比4:2:3:2的混合液作为两相溶剂体系，静置分层后上相作为固定相，下相作为流动相；经高速逆流色谱分离后得到黄酮类化合物。本方法简便，重现性好，可用于化合物的大量制备，为进一步活性研究提供奠定了物质基础。

Description

一种应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法
技术领域
本发明涉及一种黄酮类化合物分离纯化的方法，尤其涉及一种高速逆流色谱分离纯化高纯度猴头菌中黄酮类化合物的方法。
背景技术
猴头菌(Hericium erinaceus)属于菌物界猴菇属。其成熟的子实体和通过发酵产生的菌丝体均可作为中药的原料,性质平和稳定、味道甘甜可口。其主要成分为吡喃酮、甾体、生物碱、芳香类、二萜类化合物，具有抗肿瘤，修复神经组织等作用。
现代研究表明黄酮类化合物，具有有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒、免疫调节等多种生理功能及药理作用，其提取物可以运用于食品、药品、化妆品等产品中。金雀异黄酮，具有抑制结肠癌、皮肤癌、前列腺癌，预防骨质疏松等作用。是一种很有潜力的癌症化学预防剂，其抗癌作用及机制具有广泛的应用前景。
目前天然产物的分离主要采用柱色谱进行分离，该方法容易造成环境污染，耗时较长，所需试剂量较大，容易对样品形成不可逆吸附作用。高速逆流色谱(High-speedcountercurrent chromatography，HSCCC) 是近年来发展起来的一种高效连续的液-液分配技术，由于不使用固相载体作为固定相，被分离的物质在互不相容的两相分配分离，克服了固相载体带来的样品的吸附、损失、污染等问题，具有分离量大、回收率高、节约溶剂等特点，被广泛的应用于天然产物活性成分制备分离。
发明内容
本发明的目的在于采用高速逆流色谱方法从猴头菌中分离黄酮化合物的方法，以克服现有技术中存在的上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案；
一种应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，所述方法步骤如下：
A、猴头菌发酵菌丝体粗提物的制备：
取猴头菌发酵菌丝体，用乙醇或乙醇水溶液为提取剂提取，收集提取液，过滤，减压浓缩回收乙醇，得到乙醇提取物；将乙醇提取物依次通过石油醚萃取取石油醚层，再以乙酸乙酯萃取取乙酸乙酯层，蒸馏挥去溶剂干燥后得到猴头菌发酵菌丝体粗提物；
B.高速逆流色谱法分离：
以氯仿、二氯甲烷、甲醇和水的混合液作为两相溶剂体系，充分混合后静置分层，两相分离后超声脱气，上相作为固定相，下相作为流动相；将固定相充满高速逆流色谱仪的色谱柱，设定高速逆流色谱仪，在900～1000r/min转速下，水浴温度为15～25℃的条件下，以 2～3ml/min的流速注入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态，用上相、下相体积比为1:1的混合溶剂溶解猴头菌发酵菌丝体粗提物，制备得样品溶液进样，以波长为254nm的紫外检测器检测，根据紫外检测器光谱的峰形收集流出液，将收集到的流出液用高效液相色谱进行检测，将出峰及保留时间相同的流出液合并，浓缩后冷冻干燥，得到目标产物黄酮类化合物。
进一步，本发明所述的乙醇水溶液中乙醇质量浓度为90～95％。
进一步，本发明所述两相溶剂体系中氯仿：二氯甲烷：甲醇：水的体积比为4～6:2～4:3～5:2～3。
更进一步，本发明所述两相溶剂体系中氯仿：二氯甲烷：甲醇：水的体积比优选为4:2:3:2。
进一步，本发明所述黄酮类化合物具体为金雀异黄酮，结构式如下：
进一步，本发明步骤A中所述提取剂的质量用量为所述猴头菌发酵菌丝体15～20倍。
进一步，本发明步骤A中所述乙醇提取的温度为30～35℃，提取次数为3次，每次提取时间为8～12h。
进一步，本发明步骤A中所述猴头菌发酵菌丝体为粉末状，粒度为100目。
进一步，本发明所述水浴温度优选为20℃。
进一步，本发明样品溶液中所述猴头菌发酵菌丝体粗提取物的用量以混合溶剂的体积计为10-25mg/mL。
进一步，本发明步骤B中猴头菌发酵菌丝体粗提取物的上样量为200-250mg。
进一步，本发明步骤B中所述流动相流速优选为2mL/min。
进一步，本发明步骤B中高速逆流色谱仪的转速优选为 900r/min。
进一步，本发明所述步骤B中采用高效液相色谱法测定的色谱条件为：色谱柱为XTerra MS C18，5μm×4.6×250mm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱；洗脱程序：0min，B为30％；0～10min， B为30％～60％；10～20min，B为60％～90％；20～25min，90％～60％； 25～30min，60％～30％；流速1mL/min；柱温：30℃；检测波长254nm；进样量10μL。
本发明以猴头菌发酵菌丝体粉末为原料，其猴头菌发酵菌丝体粉末经乙醇回流提取，旋干浓缩后，依次经石油醚、乙酸乙酯萃取后得到猴头菌发酵菌丝体醇提物，采用高速逆流色谱法分离得到一个高纯度的黄酮类化合物，经质谱和核磁共振鉴定其结构，该黄酮类化合物为金雀异黄酮。本方法简便，重现性好，固定相的保留率为72～80％，可用于化合物的大量制备，为进一步活性研究提供奠定了物质基础。
附图说明
图1为实施例1的猴头菌发酵菌丝体醇体物HPLC图。
图2为实施例1的高速逆流色谱分离色谱图。
图3为实施例1的化合物1HPLC检测图(254nm)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：
本实施例中的猴头菌发酵菌丝体粉末购于北京福尔康生物有限责任有限公司。
1、高速逆流色谱(HSCCC)上样原料(猴头菌发酵菌丝体粗提物)的制备
取猴头菌发酵菌丝体粉末1000g，用为猴头菌发酵菌丝体粉末20 倍重量的95％质量浓度的乙醇在30℃下回流提取3次，三次提取时间均为8h，收集提取液，过滤浓缩，减压浓缩后，回收乙醇，得到提取物。先通过石油醚进行萃取，去掉油性物质，再经乙酸乙酯萃取，收集萃取液，减压浓缩后得猴头菌发酵菌丝体粗提物。作为高速逆流色谱上样原料。
2、HPLC检测方法
对上述步骤得到的猴头菌发酵菌丝体粗提物进行HPLC，高效液相色谱条件：色谱柱为XTerra MS C18(5μm×4.6×250mm)；流动相： A为乙腈，B为水；梯度洗脱；洗脱程序：0min，B为30％；0～10min， B为2＝30％～60％；10～20min，B为60％～90％；20～25min，90％～60％； 25～30min，60％～30％；流速1mL/min；柱温：30℃；检测波长254nm；进样量10μL。所得图谱如图1所示。图1中标注“1”的峰为目标物峰。
3、高速逆流色谱(HSCCC)分离
3.1、溶剂系统的选择
通过对多个弱极性及亲脂性溶剂体系进行筛选，发现正己烷-二氯甲烷-甲醇-水、氯仿-甲醇-水、石油醚-二氯甲烷-甲醇-水、氯仿-二氯甲烷-甲醇-水组成的体系K值较好，将该四种溶剂体系按下表1中的比例进行配制，充分振荡后静置分层，移取上相2ml，加入猴头菌发酵菌丝体提取物样品，用HPLC测定样品在上相中目标组分的峰面积AU，再取等体积的下相2ml，加入猴头菌发酵菌丝体提取物样品，用HPLC测定样品在下相中目标组分的峰面积AL，根据式(1)计算目标组分的分配系数K，根据K值选择合适的溶剂体系作为HSCCC 的固定相和流动相。最终实验采用溶剂体系氯仿-二氯甲烷-甲醇-水 (4:2:3:2，V/V)作为溶剂体系上样操作。
式(1)：K＝AU/AL
表1溶剂体系K值筛选表
3.2、HSCCC操作条件
高速逆流色谱柱：TBE-300A高速逆流色谱色谱仪(上海同田生物技术有限公司)：配置有聚四氟乙烯柱，内径1.6mm，柱溶剂280ml，转速0～1000r/min，
按上述比例配置溶剂系统，置于分液漏斗中，振荡摇匀，静置分层，待平衡后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取 250mg猴头菌发酵菌丝体提取物溶解于5ml上相和5ml下相的混合物中待用。采用高速逆流色谱仪进行分离制备，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以10mL/min灌满色谱分离柱，停泵。设置水浴温度为15℃，调节转速，使高速逆流色谱仪分离柱正转，转速至 900r/min时，设置流动相的流速为2.0mL/min，开始泵入流动相，当两相溶剂达至平衡后，将样品用注射器注入高速逆流色谱仪进液阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱柱，根据紫外检测器光谱图(图2)接收目标成分，图2中“1”为目标物峰，得化合物 1(15mg)，且固定相保留率为78％.
结合图3，根据HPLC(分析条件同上)在254nm下的色谱图，采用峰面积归一法计算化合物1纯度，化合物1纯度为95％。
采用质谱及核磁共振鉴定上述化合物的结构。
化合物1，棕黄色粉末，分子量270.24，分量式C15H10O5根据1H 和13CNMR数据，并结合文献，确定化合物为：金雀异黄酮 (4',5,7-Trihydroxyisoflavone),其结构如下，NMR信号归属见表2。
表2化合物1核磁共振H谱与C谱归属表
实施例2：
取猴头菌发酵菌丝体粉末1000g，用为猴头菌发酵菌丝体粉末20 倍重量的95％质量浓度的乙醇在30℃下回流提取3次，三次提取时间均为8h，收集提取液，过滤浓缩，减压浓缩后，回收乙醇，得到提取物。先通过石油醚进行萃取，去掉油性物质，再经乙酸乙酯萃取，收集萃取液，减压浓缩后得猴头菌发酵菌丝体粗提物。作为高速逆流色谱上样原料。
HPLC检测方法同实施例1
高速逆流色谱的分离提取，在分液漏斗中加入氯仿、二氯甲烷、甲醇、水(体积比为6:4:5:3)，混合静止分层，超声脱气，按上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相。取猴头菌发酵菌丝体粗体物 250mg溶于上相5mL和下相5mL的混合溶剂中，作为样品溶液待用。
采用高速逆流色谱仪进行分离制备，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以10mL/min灌满色谱分离柱，停泵。调节转速，设置水浴温度为15℃，使高速逆流色谱仪分离柱正转，转速至 1000r/min时，设置流动相的流速为2mL/min，开始泵入流动相，当两相溶剂达至平衡后，将样品用注射器注入高速逆流色谱仪进液阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱柱，根据紫外检测器光谱，接收目标成分，得化合物1(12.5mg)，且固定相保留率为80％。
HPLC检测条件同实施例1，采用峰面积归一法计算得化合物1 纯度为92％。
实施例3：
取猴头菌发酵菌丝体粉末1000g，用为猴头菌发酵菌丝体粉末15 倍重量的90％质量浓度的乙醇在30℃下回流提取3次，三次提取时间均为12h，收集提取液，过滤浓缩，减压浓缩后，回收乙醇，得到提取物。先通过石油醚进行萃取，去掉油性物质，再经乙酸乙酯萃取，收集萃取液，减压浓缩后得猴头菌发酵菌丝体粗提物。作为高速逆流色谱上样原料。
HPLC检测方法同实施例1
高速逆流色谱的分离提取，在分液漏斗中加入氯仿、二氯甲烷、甲醇、水(体积比为4:2:3:2)，混合静止分层，超声脱气，按上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相。取猴头菌发酵菌丝体粗体物 200mg溶于上相10mL和下相10mL的混合溶剂中，作为样品溶液待用。
采用高速逆流色谱仪进行分离制备，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以10mL/min灌满色谱分离柱，停泵。调节转速，设置水浴温度为25℃，使高速逆流色谱仪分离柱正转，转速至 1000r/min时，设置流动相的流速为3mL/min，开始泵入流动相，当两相溶剂达至平衡后，将样品用注射器注入高速逆流色谱仪进液阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱柱，根据紫外检测器光谱，接收目标成分，得化合物1(10mg)，且固定相保留率为72％。
HPLC检测条件同实施例1，采用峰面积归一法计算得化合物1 纯度为88％。

Claims (9)

1.一种应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，其特征在于所述方法步骤如下：
A、猴头菌发酵菌丝体粗提物的制备：
取猴头菌发酵菌丝体，用乙醇或乙醇水溶液为提取剂提取，收集提取液，过滤，减压浓缩回收乙醇，得到乙醇提取物；将乙醇提取物依次通过石油醚萃取取石油醚层，再以乙酸乙酯萃取取乙酸乙酯层，蒸馏挥去溶剂干燥后得到猴头菌发酵菌丝体粗提物；
B.高速逆流色谱法分离：
以氯仿、二氯甲烷、甲醇和水的混合液作为两相溶剂体系，充分混合后静置分层，两相分离后超声脱气，上相作为固定相，下相作为流动相；将固定相充满高速逆流色谱仪的色谱柱，设定高速逆流色谱仪，在900～1000r/min转速下，水浴温度为15～25℃的条件下，以2～3ml/min的流速注入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态，用上相、下相体积比为1:1的混合溶剂溶解猴头菌发酵菌丝体粗提物，制备得样品溶液进样，以波长为254nm的紫外检测器检测，根据紫外检测器光谱图的峰形收集流出液，将收集到的流出液用高效液相色谱进行检测，将出峰及保留时间相同的流出液合并，浓缩后冷冻干燥，得到目标产物黄酮类化合物，所述的黄酮类化合物为金雀异黄酮；
所述两相溶剂体系中氯仿：二氯甲烷：甲醇：水的体积比为4～6:2～4:3～5:2～3。
2.如权利要求1所述的应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述的乙醇水溶液中乙醇质量浓度为90～95％。
3.如权利要求1所述的应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述两相溶剂体系中氯仿：二氯甲烷：甲醇：水的体积比为4:2:3:2。
4.如权利要求1所述的应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，其特征在于：步骤A中所述提取剂的质量用量为所述猴头菌发酵菌丝体15-20倍。
5.如权利要求1所述的应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，其特征在于：步骤A中所述乙醇提取的温度为30-35℃，提取次数为3次，每次提取时间为8-12h。
6.如权利要求1所述的应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，其特征在于：步骤A中所述猴头菌发酵菌丝体为粉末状，粒度为100目。
7.如权利要求1所述的应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，其特征在于：样品溶液中所述猴头菌发酵菌丝体粗提取物的用量以混合溶剂的体积计为10～25mg/mL。
8.如权利要求1所述的应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，其特征在于：步骤B中所述流动相流速为2mL/min。
9.如权利要求1所述的应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述步骤B中采用高效液相色谱法测定的色谱条件为：色谱柱为XTerra MS C18，5μm×4.6×250mm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱；洗脱程序：0min，B为30％；0～10min，B为30％～60％；10～20min，B为60％～90％；20～25min，90％～60％；25～30min，60％～30％；流速1mL/min；柱温：30℃；检测波长254nm；进样量10μL。
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