CN105294722B

CN105294722B - 一种高纯度光甘草定单体的制备方法

Info

Publication number: CN105294722B
Application number: CN201410289036.6A
Authority: CN
Inventors: 丁圣峰
Original assignee: Hubei A Taike Carbohydrate Chemistry Co Ltd
Current assignee: Hubei ataike biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2014-06-26
Publication date: 2017-12-05
Anticipated expiration: 2034-06-26
Also published as: CN105294722A

Abstract

本发明的名称是一种高纯度光甘草定单体的制备方法，涉及从甘草中分离制备高纯度光甘草定单体的制备方法。它主要是解决已知的制备方法复杂、分离效率低、分离时间长、溶剂消耗量大的问题。本发明包括制取光甘草浸膏,其特征是：采用反相C18柱色谱富集光甘草定：将浸膏依次用30%醇、50%醇、70%醇和95%醇洗脱，分别收集洗脱液，将收集的70%醇洗脱液减压浓缩至干，得到光甘草定粗品；采用高速逆流色谱技术分离上述光甘草定粗品：将分离溶剂置于分液漏斗中充分振摇后静置分层，将上述光甘草定粗品溶解于分离溶剂中，用高效液相色谱法分别测定上下层溶液所含光甘草定的浓度。本发明分离时间短，回收率高、无污染、节约溶剂。

Description

一种高纯度光甘草定单体的制备方法

技术领域

本发明属于中药活性成分分离纯化技术领域，具体地是涉及从甘草中分离制备高纯度光甘草定单体的制备方法。

背景技术

已知甘草是豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflate Bat.）、或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L）的干燥根和根茎；甘草味甘、性平、无毒，是一种补益中药，具有益气补中、缓急止痛、润肺止咳、泻火解毒、调和诸药等的作用；光甘草定是光果甘草特有的异黄酮类成分，已有研究表明光甘草定具有较强的抗氧化活性，此外还有抗动脉粥样硬化、降血脂、神经保护、增强记忆作用、抑制黑色素形成、减肥等作用；光甘草定是世界上最昂贵的天然祛斑美白原料，含有世界上公认的最安全的祛斑美白成分，在化妆品领域应用非常广泛；但是其在甘草中的含量及少，目前国内外多采用萃取、硅胶柱色谱、重结晶和制备液相等传统方法分离纯化光甘草定单体，上述分离纯化过程复杂、分离效率低、分离时间长、溶剂消耗量大，因此，高纯度光甘草定的价格非常昂贵。专利申请号为200410079233.1、200880117804.2中提供的技术得到的产品均是纯度仅有50%左右的低纯度光甘草定，专利申请号为200510023860.8、200910213748.9采用聚酰胺柱色谱、重结晶等方法得到的光甘草定的纯度也只能达到90%以上，不能满足标准品和对照品的要求；专利申请号为200910311302.X采用高效制备液相方法可以得到纯度大于98%的光甘草定，但是溶剂消耗量太大，分离时间长。

发明内容

本发明的目的是针对上述的不足，而提出的一种工艺简便，效率高，产品纯度大于98％，从豆科植物甘草中快速分离高纯度光甘草定单体的方法。

本发明的技术解决方案是：光甘草定单体的制备方法包括a、制取光甘草浸膏, 其特征是：

b、采用反相C18柱色谱富集光甘草定：将浸膏依次用30%醇、50%醇、70%醇和95%醇洗脱，分别收集洗脱液，将收集的70%醇洗脱液减压浓缩至干，得到光甘草定粗品；

c、采用高速逆流色谱技术分离上述光甘草定粗品：将分离溶剂置于分液漏斗中充分振摇后静置分层，将上述光甘草定粗品溶解于分离溶剂中，用高效液相色谱法分别测定上下层溶液所含光甘草定的浓度。

本发明的技术解决方案中所述的高效液相色谱法是用TBE-300A型制备型逆流色谱仪对光甘草定的浓度进行测定，得到纯度大于98%的光甘草定单体。

本发明的技术解决方案中所述的分离溶剂是惰性溶剂：乙酸乙酯：醇：水，按其体积比为2-5: 1-4:2-6:1-4组成。

本发明的技术解决方案中所述的惰性溶剂是石油醚、或正己烷、或环己烷，或石油醚、正己烷和环己烷的混合物。

本发明的技术解决方案中所述的醇为甲醇或乙醇，或甲醇和乙醇的混合物。

本发明采用高速逆流色谱分离制备高纯度光甘草定单体，只需一步就从光甘草定粗品中分离制备出纯度在98％以上的光甘草定单体，由于它的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附，因此具有分离时间短，样品无损失、回收率高、分离环境缓和、无污染、高效、快速和大制备量分离，节约溶剂的优点。

附图说明

图1是本发明的分离溶剂为石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水(5.5：4.5：6：4) 的光甘草定粗品的高速逆流色谱分离的色谱图，图中峰A为光甘草定。

图2是本发明的分离溶剂为环己烷：乙酸乙酯：乙醇：水(5:5:5.5:4.5) 的光甘草定粗品的高速逆流色谱分离的色谱图，图中峰B为光甘草定。

图3是本发明的光甘草定分离纯化后的HPLC图谱，图中保留时间为13 min的色谱图，图中峰为光甘草定。

具体实施方式

本发明是首先用反相C18柱色谱富集，然后用高速逆流色谱法(HSCCC)从甘草中分离制备高纯度光甘草定单体；具体实施步骤如下：

1、光甘草定粗提物的提取：甘草粉碎后，用50%~95％乙醇提取3次，提取温度为40~80⁰C，提取时间为1~2小时，合并提取液，减压浓缩得浸膏；

2、光甘草定的富集：采用反相C18柱色谱富集光甘草定，依次用30%醇、50%醇、70%醇和95%醇洗脱，分别收集洗脱液，HPLC检测，光甘草定主要在70%醇的洗脱液中，收集70%醇的洗脱液，减压浓缩至干，得到光甘草定粗品；

3、光甘草定的纯化：采用高速逆流色谱技术分离纯化光甘草定，分离溶剂的选择：根据各种溶剂的极性、粘性、比重、溶解度诸因素，设计分离溶剂，然后按分离溶剂的比例，配置20ml分离溶剂，分别吸取分离溶剂的上下相各1ml，加入光甘草定粗品样品1mg，充分振摇，静置分层，分别取上下层溶液，用高效液相色谱法测定上下层溶液所含光甘草定的浓度，即可求得其在该分离溶剂中的分配系数K，K =Cs/Cm ，其中Cs表示溶质在上相的质量浓度，Cm表示溶质在下相的质量浓度；选取K值在0.5－1.5范围内的分离溶剂作为分离制备系统；本发明的分离溶剂是由惰性溶剂、乙酸乙酯、醇和水组成，其用量体积比为2-5: 1-4:2-6:1-4，其中惰性溶剂分别为：石油醚、环己烷、正己烷或任意两个的混合物，醇分别为甲醇、乙醇或二者的混合物；将配置的上述分离溶剂2L置于分液漏斗中充分振摇后静置12小时，分层，取上相作为固定相，下相作为流动相。

4、本发明采用上海同田生物技术有限公司生产的TBE-300A型制备型逆流色谱仪，逆流色谱仪由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱组成，色谱分离柱是由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，其容量为230ml，连接顺序为：柱塞泵、进样阀、色谱分离柱、紫外检测仪、记录仪；首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800r/min时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相,待流动相流出色谱分离柱时，称取一定量光甘草定粗品放入上相、下相的混合液中溶解，用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱；根据检测器紫外光谱图，对分离的每个峰进行收集，用高效液相色谱(HPLC)测定纯度，收集光甘草定。

5、采用HPLC分析及HSCCC峰的鉴定：利用高效液相色谱(HPLC)分析提取物，高效液相色谱条件: Agilent SB C18 (4.6×250mm，5μm)，紫外检测波长230nm，柱温：25℃，流速:0.8 ml/min，进样量: 10μl，流动相：A：0.2%，冰乙酸水，B：乙腈，0-10min 5%-25%B；10-50min 25%-80%B；50-51min 80%-100%B。HSCCC峰的鉴定：应用Agilent 5973N质谱仪和Varian 600 MHz 核磁共振波谱仪分别进行MS，¹H-NMR 和¹³C-NMR谱的测定。

实施例1

取甘草3kg，粉碎后，在40~80⁰C的温度下，1~2小时内，用70%乙醇回流提取3次，每次1h，提取液合并后减压浓缩得浸膏162g，将该浸膏用反相C18柱色谱富集光甘草定，依次用30%、50%、70%和95%乙醇/水各4L洗脱，收集70%乙醇洗脱液，HPLC检测，减压浓缩至干，得到光甘草定粗品28g。

高纯度光甘草定单体的制备:

采用制备型高速逆流色谱仪，分离溶剂选用石油醚、乙酸乙酯、乙醇和水从光甘草定粗品中分离制备高纯度光甘草定单体；首先以5.5:4.5:6:4的体积比将上述分离溶剂配置2L于分液漏斗中，摇匀后静置12小时，分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，取150mg光甘草定粗品溶解于5ml上相和5ml下相的混合物中待用；采用上海同田生物技术有限公司生产的TBE-300A型制备型逆流色谱仪，按上述TBE-300A型制备型逆流色谱仪的操作方法，对上述光甘草定单体的纯度进行检测，根据如图1所示的检测器紫外光谱图，接收目标成分，分别收集对应的馏分，HPLC测定纯度，减压浓缩，得到峰A的白色粉末48mg，经质谱、核磁、HPLC分析鉴定峰A为光甘草定，纯度为99.5％。

利用HPLC分析光甘草定；HPLC条件：Agilent SB C18 (4.6×250mm，5μm)，紫外检测波长282nm，柱温：25℃，流速:1.0 ml/min，进样量: 10μl，流动相：流动相：乙腈-0.2%冰乙酸水=55：45。

实施例2

取甘草3kg，粉碎后，在40~80⁰C的温度下，1~2小时内，用90%乙醇回流提取3次（每次1h），提取液合并后减压浓缩得浸膏171g；浸膏用反相C18柱色谱富集光甘草定，依次用30%、50%、70%和95%乙醇/水各4L洗脱，收集70%乙醇洗脱液，HPLC检测，减压浓缩至干得光甘草定粗品28g。

高纯度光甘草定单体的制备：

采用制备型高速逆流色谱仪，分离溶剂选用正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水体系从光甘草定粗品中分离制备高纯度光甘草定单体。首先以5:5:5.5:4.5的体积比将上述溶剂体系配置2L于分液漏斗中，摇匀后静置12小时，分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，取180mg光甘草定粗提物溶解于5ml上相和5ml下相的混合物中待用；采用上海同田生物技术有限公司生产的TBE-300A型制备型逆流色谱仪，按上述TBE-300A型制备型逆流色谱仪的操作方法，对上述光甘草定单体的纯度进行检测，根据图2所示的检测器紫外光谱图接收目标成分，分别收集对应的流份，HPLC测定纯度，减压浓缩，得到峰B的白色粉末52mg，经质谱、核磁、HPLC分析鉴定峰B为光甘草定，纯度为99.2％。

利用HPLC分析光甘草定。HPLC条件：Agilent SB C18 (4.6×250mm，5μm)，紫外检测波长282nm，柱温：25℃，流速:1.0 ml/min，进样量: 10μl，流动相：流动相：乙腈-0.2%冰乙酸水=55：45。

Claims

1.一种高纯度光甘草定单体的制备方法，包括（1）光甘草定粗提物的提取：甘草粉碎后，用50%~95％乙醇提取3次，提取温度为40~80℃，提取时间为1~2小时，合并提取液，减压浓缩得浸膏；

（2）光甘草定的富集：采用反相C18柱色谱富集光甘草定，依次用30%醇、50%醇、70%醇和95%醇洗脱，分别收集洗脱液，HPLC检测，光甘草定主要在70%醇的洗脱液中，收集70%醇的洗脱液，减压浓缩至干，得到光甘草定粗品；

（3）光甘草定的纯化：采用高速逆流色谱技术分离纯化光甘草定，分离溶剂的选择：根据各种溶剂的极性、粘性、比重、溶解度诸因素，设计分离溶剂，然后按分离溶剂的比例，配置20ml分离溶剂，分别吸取分离溶剂的上下相各1ml，加入光甘草定粗品样品1mg，充分振摇，静置分层，分别取上下层溶液，用高效液相色谱法测定上下层溶液所含光甘草定的浓度，即可求得其在该分离溶剂中的分配系数K，K =Cs/Cm ，其中Cs表示溶质在上相的质量浓度，Cm表示溶质在下相的质量浓度；选取K值在0.5－1.5范围内的分离溶剂作为分离制备系统；其中分离溶剂是由惰性溶剂、乙酸乙酯、醇和水组成，其用量体积比为2-5: 1-4:2-6:1-4，其中惰性溶剂为：石油醚、环己烷、正己烷或任意两个的混合物，醇为甲醇、乙醇或二者的混合物；将配置的上述分离溶剂2L置于分液漏斗中充分振摇后静置12小时，分层，取上相作为固定相，下相作为流动相；

（4）采用上海同田生物技术有限公司生产的TBE-300A型制备型逆流色谱仪，逆流色谱仪由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱组成，色谱分离柱是由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，其容量为230ml，连接顺序为：柱塞泵、进样阀、色谱分离柱、紫外检测仪、记录仪；首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800r/min时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相,待流动相流出色谱分离柱时，称取一定量光甘草定粗品放入上相、下相的混合液中溶解，用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱；根据检测器紫外光谱图，对分离的每个峰进行收集，用高效液相色谱测定纯度，收集光甘草定；

（5）采用HPLC分析及HSCCC峰的鉴定：利用高效液相色谱分析提取物，高效液相色谱条件： 4.6×250mm，5μm 的Agilent SB C18，紫外检测波长230nm，柱温：25℃，流速:0.8 ml/min，进样量: 10μl，流动相：A：0.2%，冰乙酸水，B：乙腈，0-10min 5%-25%B；10-50min 25%-80%B；50-51min 80%-100%B，HSCCC峰的鉴定：应用Agilent 5973N质谱仪和Varian 600 MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，¹H-NMR 和¹³C-NMR谱的测定。