CN112110886A

CN112110886A - 一种利用高效逆流色谱分离桑黄中多酚类化合物的方法

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Publication number: CN112110886A
Application number: CN202011075959.3A
Authority: CN
Inventors: 王晶; 宋吉玲; 张勇; 陈丽娜; 时东方; 刘春明
Original assignee: Changchun Normal University
Current assignee: Changchun Normal University
Priority date: 2020-10-10
Filing date: 2020-10-10
Publication date: 2020-12-22

Abstract

本发明公开了一种利用高效逆流色谱分离桑黄中多酚类化合物的方法，包括以下步骤：制备桑黄粗提取液：称取桑黄样品适量，粉碎成粗粉，过60目筛，在室温下，用乙醇浸泡提取，液料比10:1～20:1，提取2‑3次，将提取液减压回收浓缩至干，色谱甲醇溶解，得到桑黄醇提物；分离纯化桑黄提取物：利用高速逆流色谱对制备得到的桑黄醇提取物进行分离提纯，得到三种多酚类化合物。本发明利用高速逆流色谱技术经一次分离从药用真菌桑黄中分离、提纯得到三种多酚类化合物，并且得到的功能成分纯度高。

Description

一种利用高效逆流色谱分离桑黄中多酚类化合物的方法

技术领域

本发明涉及天然产物活性成分的分离纯化技术领域，具体为一种利用高效逆流色谱一次性同时分离药用真菌桑黄中3种多酚类化合物的方法。

背景技术

桑黄为珍贵的大型药用真菌，主要生长在桑树、杨树等被子植物树干上，又称桑耳、胡孙眼等。桑黄中含有多种化学成分，多糖、黄酮等物质为主要有效成分。现代药理作用表明，桑黄具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、消炎、保肝护肝及抑制尿酸等多种活性。桑黄是国际公认的使用免疫疗法治疗癌症效率最高的真菌之一。在国外，桑黄已被广泛用于治疗各期癌症以及防止手术后转移及复发。由于桑黄及其提取物是通过激活人体免疫系统从而产生治疗功效，因此即使长期服用也对人体无毒副作用。但目前桑黄尚未建立质量评价方法，标准物质是建立外标法含量测定方法的必要条件和基础，然而桑黄目前尚未商品化标准物质，极大地阻碍了桑黄的深入研究。

吡喃酮类化合物是桑黄多酚类色素，主要有苯乙烯基吡喃酮(Hispidin)骨架和苯并毗喃酮骨架。据报道，这一类化合物具有较好的抗氧化活性、强烈的清除自由基活性、抗炎活性和细胞毒活性(如卵巢癌细胞A2780、肺腺癌细胞A549、肝癌细胞Bel7402和结肠癌细胞HCT-8)。近十年来，国内外对桑黄吡喃酮多酚类化合物研究较多，发现了较多新化合物，而且该类化合物有许多是以新奇的骨架被报道的。具有苯乙烯基吡喃酮骨架化合物一般为几分子Hispidin聚合体，或由Hispidin与Hispolon缩合而成。但目前的关于桑黄中吡喃酮类成分的分离报道中，主要采用传统的柱分离方法，该耗时较长、溶剂消耗量较大、工作量也比较繁重。

目前，桑黄中的多酚类单体化合物市场上很难购买到，而且价格昂贵。目前的关于桑黄中吡喃酮类成分的分离报道中，主要采用传统的柱分离方法，该耗时较长、溶剂消耗量较大、工作量也比较繁重。同时，桑黄中的多酚类单体化合物价格昂贵，而且很难购买到。因此，有必要探索出更易操作、快速地分离桑黄中单体化合物的方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种利用高效逆流色谱分离桑黄中多酚类化合物的方法，是一种利用高效逆流色谱法快速得到纯度较好的桑黄中多酚类化合物的分离方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用高效逆流色谱分离桑黄中多酚类化合物的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备桑黄粗提取液：称取桑黄样品适量，粉碎成粗粉，过60目筛，在室温下，用乙醇浸泡提取，液料比10:1～20:1，提取2-3次，将提取液减压回收浓缩至干，色谱甲醇溶解，得到桑黄醇提物；

步骤二、分离纯化桑黄提取物：利用高速逆流色谱对由步骤一制备得到的桑黄醇提取物进行分离提纯，得到三种多酚类化合物。

优选的，所述步骤一具体包括如下步骤：①将桑黄经过粉碎后，备用；②向上述桑黄中加入乙醇，液料比10:1～20:1，于常温避光条件下浸提12-24h，并适时搅拌；再经过过滤，得到滤液备用；③重复上述步骤②，将得到的滤液与步骤②中得到的滤液合并；④将步骤③中得到的合并后滤液，在45～55℃条件下减压浓缩，用适量色谱甲醇溶解，过0.45μm的滤膜，得到桑黄粗提液。

优选的，所述步骤②中乙醇的质量浓度为80～95％。

优选的，所述步骤二具体包括如下步骤：①在室温下，将石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水按体积比0.5:1.5:0.2:2的混合溶剂倒于分液漏斗中，充分摇匀后，静置约30min，将上、下层溶液分离，上层为固定相，下层为流动相，并分别进行过滤；②首先用较高流速将柱子用固定相填充，将主机转速调到1000-1100rpm，平衡5-10min左右；③泵入流动相，流动相流速为1.20-1.50mL/min。接液瓶中出现两相分层时，表明色谱柱中两相已达到平衡状态，可准备进样。④移取桑黄醇提取物适量，快速抽干溶剂，分别用等体积的所述混合溶剂系统上层和下层进行溶解，样品浓度在0.5-1.0g/mL，进样。分离后的样品经UV(395nm)检测，并将相同峰的流出液分段接取。

本发明具有以下有益效果：

(1)无需对桑黄的粗提物进行纯化，可以直接用于高效逆流色谱的分离；(2)方法操作简便、时间较短、效率较高，适合于桑黄粗提物中有效成分的分离，且一次分离能得到3种单体化合物，经过了HPLC检测，3种化合物的纯度均可以达到95％以上；(3)方法溶剂系统中所用的溶剂未采用氯仿等毒性相对较强的溶剂。

与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用高速逆流色谱分离桑黄中多酚类化合物的方法，分离得到Davallialactone、HypholomineB和InoscavinA；并且，本发明分离得到的各种化合物其纯度相对较高，为桑黄的进一步活性研究及质量控制提供物质基础。并且，本发明利用高速逆流色谱技术经一次分离从药用真菌桑黄中分离、提纯得到三种多酚类化合物，并且得到的功能成分纯度高，有利于对桑黄进行进一步的研究；本发明公开的分离、提纯方法简单，重复性好，可用于化合物的大量制备，具有优异的发展前景。

附图说明

图1为本发明应用高效逆流色谱分离桑黄中3个多酚类化合物方法实施例1的样品图谱；

图2为本发明实施例1中应用高效液相色谱分析桑黄提取物及经过高效逆流色谱分离得到桑黄单体化合物的样品图谱，其中，A为桑黄粗提物HPLC谱图，B为化合物1(Davallialactone)HPLC谱图，C为化合物3(InoscavinA)HPLC谱图，D为化合物2(Hypholomine B)HPLC谱图；

图3为本发明实施例1中应用电喷雾串联质谱分析桑黄单体化合物1(Davallialactone)的样品图谱，其中，A为一级谱图，B为二级谱图；

图4为本发明实施例1中应用电喷雾串联质谱分析桑黄单体化合物2(HypholomineB)的样品图谱，其中，A为一级谱图，B为二级谱图；

图5为本发明实施例1中应用电喷雾串联质谱分析桑黄单体化合物3(InoscavinA)的样品图谱，其中，A为一级谱图，B为二级谱图；

图6本发明实施例1中分离得到的三个化合物的结构式谱图，其中化合物1为Davallialactone，化合物2为HypholomineB，化合物3为InoscavinA；

图7为本发明应用高效逆流色谱分离桑黄中3个多酚类化合物方法实施例2的样品图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述，但本发明不仅限于所述实施例。

实施例1：

(1)样品制备

称取桑黄样品10.00g，粉碎成粗粉，过60目筛，在室温下，用200mL 95％乙醇浸泡24h，提取3次，将提取液在55℃条件下减压回收浓缩至干，用20mL的色谱甲醇溶解，过0.45μm的滤膜，得到桑黄醇提物。

高效液相色谱检测目标化合物在不同溶剂系统中的K值，优化逆流色谱分离的溶剂系统。

(2)高效逆流色谱分离

在室温下，将石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水(0.5:1.5:0.2:2，体积比)混合溶剂倒于分液漏斗中，充分摇匀后，静置约30min，将上、下层溶液分离，上层为固定相，下层为流动相，并分别进行过滤，备用。高效逆流色谱的分离条件，用10.0mL/min流速将分离管路用固定相填充，将主机转速调到1000-1100rpm，平衡5min左右，泵入流动相，流动相流速为1.2mL/min。接液瓶中出现两相分层时，表明色谱柱中两相已达到平衡状态，可准备进样。移取桑黄醇提取液2mL，吹干，分别用0.75mL上层和0.75mL的下层(石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水，体积比0.5:1.5:0.2:2)进行溶解，样品浓度在1.0g/mL，进样。分离后的样品经UV(395nm)检测，根据色谱图峰形分段收集流出液；150min左右，基线稳定，基本上回到0点，停泵；采用上述溶剂系统对桑黄提取物中活性成分进行分离，主要分离得到3个化合物，如图1所示。将收集的流出液，应用HPLC进行纯度分析。

(3)HPLC对上述实施例1中分离得到的化合物进行纯度检测

步骤(2)中在收集的流出液经过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后得到的粉末状化合物，对其进行结构和纯度鉴定。经过从10.00g桑黄粗提物中分离得到化合物1为28.30mg、化合物2为72.15mg、化合物3为46.50mg，将分离得到的3个化合物分别进行HPLC检测，并与桑黄醇提物HPLC图进行对比，图2为桑黄醇提物及分离单体的高效液相色谱图，经过面积归一法测定化合物1、2、和3纯度分别为98.75％、96.43％和90.46％。

(4)ESI-MSⁿ实施例1中分离得到的化合物进行纯度检测

对上述得到的3种化合物采用质谱检测，结果ESI-MS分析3个化合物的[M-H]^-分别为m/z 463，m/z 489，m/z 461，分子量分别为464，490和462。化合物1的ESI-MSⁿ见图3，在MS一级谱中的[M-H]^-为m/z 462.98，为其脱去一个H的分子离子峰，根据化合物1主要碎片离子的归属及分析其裂解途径，与文献比对为Davallialactone，结构式见图6。

化合物2的ESI-MSⁿ见图4，在MS一级谱中的[M-H]^-为m/z 488.81，为其脱去一个H的分子离子峰，根据化合物2的主要碎片离子的归属及分析其裂解途径，与文献比对为HypholomineB，结构式见图6。

化合物3的ESI-MSⁿ见图5，在MS一级谱中的[M-H]^-为m/z 461.03，为其脱去一个H的分子离子峰，根据化合物3的主要碎片离子的归属及分析其裂解途径，与文献比对为InoscavinA，结构式见图6。

实施例2：

(1)样品制备

称取桑黄样品5.00g，粉碎成粗粉，过60目筛，在室温下，用200mL80％乙醇浸泡12h，提取3次，将提取液在45℃条件下减压回收浓缩至干，用20mL的色谱甲醇溶解，过0.45μm的滤膜，得到桑黄醇提物。

(2)高效逆流色谱分离

在室温下，将石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水(0.5:1.5:0.2:2，体积比)混合溶剂倒于分液漏斗中，充分摇匀后，静置约30min，将上、下层溶液分离，上层为固定相，下层为流动相，并分别进行过滤，备用。高效逆流色谱的分离条件，用10.0mL/min流速将分离管路用固定相填充，将主机转速调到1000-1100rpm，平衡10min左右，泵入流动相，流动相流速为1.5mL/min。接液瓶中出现两相分层时，表明色谱柱中两相已达到平衡状态，可准备进样。移取桑黄醇提取液2mL，吹干，分别用0.75mL上层和0.75mL的下层(石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水，体积比0.5:1.5:0.2:2)进行溶解，样品浓度在0.5g/mL，进样。分离后的样品经UV(395nm)检测，根据色谱图峰形分段收集流出液；80min左右，基线稳定，基本上回到0点，停泵；采用上述溶剂系统对桑黄提取物中活性成分进行分离，主要分离得到3个化合物，如图7所示。将收集的流出液，应用HPLC进行纯度分析，化合物1、2纯度分别均大于95％，化合物3纯度大于90％。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种利用高效逆流色谱分离桑黄中多酚类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种利用高效逆流色谱分离桑黄中多酚类化合物的方法，其特征在于，所述步骤一具体包括如下步骤：

①将桑黄经过粉碎后，备用；

②向上述桑黄中加入乙醇，液料比10:1～20:1，于常温避光条件下浸提12-24h，并适时搅拌；再经过过滤，得到滤液备用；

③重复上述步骤②，将得到的滤液与步骤②中得到的滤液合并；

④将步骤③中得到的合并后滤液，在45～55℃条件下减压浓缩，用20mL的色谱甲醇溶解，过0.45μm的滤膜，得到桑黄粗提液。

3.如权利要求1所述的一种利用高效逆流色谱分离桑黄中多酚类化合物的方法，其特征在于，所述步骤②中乙醇的质量浓度为80～95％。

4.如权利要求1所述的一种利用高效逆流色谱分离桑黄中多酚类化合物的方法，其特征在于，所述步骤二具体包括如下步骤：

①在室温下，将石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水按体积比0.5:1.5:0.2:2的混合溶剂倒于分液漏斗中，充分摇匀后，静置约30min，将上、下层溶液分离，上层为固定相，下层为流动相，并分别进行过滤；

②首先速将柱子用固定相填充，将主机转速调到1000-1100rpm，平衡5-10min；

③泵入流动相，流动相流速为1.20-1.50mL/min，接液瓶中出现两相分层时，表明色谱柱中两相已达到平衡状态，可准备进样；

④移取桑黄醇提取物适量，快速抽干溶剂，分别用等体积的所述混合溶剂系统上层和下层进行溶解，样品浓度在0.5-1.0g/mL，进样；分离后的样品经395nm UV检测，并将相同峰的流出液分段接取。