CN113907156A - 一种茶褐素及其抗氧化组分的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种茶褐素及其抗氧化组分的制备方法，属于茶褐素提取制备领域。该茶褐素是以藏茶为原料，采用低共熔溶剂结合超声提取、醇沉和膜透析技术制备得到。并通过硅胶层析柱制备得茶褐素抗氧化组分。本发明的茶褐素提取制备方法操作简便、纯化难度小、有机溶剂使用量很少、提取时间短、成本低、绿色环保、污染小，并且茶褐素得率高，从而提高了茶褐素的利用率；并且，其抗氧组分的抗氧化效果优异，具备实际推广应用价值。

Description

一种茶褐素及其抗氧化组分的制备方法

技术领域

本发明属于茶褐素提取制备领域，具体涉及一种茶褐素及其抗氧化组分的制备方法。

背景技术

四川藏茶历史悠久，是黑茶的一种，属于后发酵茶，保健功效显著。随着发酵和贮藏时间的延长，藏茶中的茶褐素含量会大量地增加。作为藏茶的重要特征成分，茶褐素具有抗氧化、降脂减肥、抗肿瘤等功效，具有一定的医疗价值和食用价值。但是，茶褐素结构和组成复杂，导致对其提取、纯化和功效的研究还不够深入。

目前，茶褐素的提取技术主要包括试剂提取、微波和超声波提取等，没有超声辅助低共熔溶剂提取四川藏茶茶褐素的相关报道。茶褐素的制备纯化技术主要包括AB-8大孔树脂、DEAE-52纤维柱、膜分离技术，没有硅胶分级纯化茶褐素抗氧化组分的报道。其中，公开号为CN101696269的中国专利公开了一种以茶多酚为原料制备茶褐素的方法，该方法存在茶褐素得率低的缺点；公开号为CN101455257的中国专利公开了一种吸用发酵法制备茶褐素的方法，该方法主要存在成本高、操作复杂等问题；公开号为CN104082452A的中国专利公开了一种茶褐素的粗提方法和精提方法，该方法存在的主要缺点是：技术难度大，茶褐素得率低；公开号为CN104365912A的中国专利公开了一种茶褐素的制备与提取方法，该方法的主要缺点是茶褐素得率低。公开号为CN103444943A的中国专利公开了以黑茶为原料综合提制茶褐素和茶多糖的方法，该方法存在的主要缺点是：操作复杂、不易工业化。

综上可见，目前，茶褐素的提取技术主要包括试剂提取、微波和超声波提取等，这些技术普遍具有溶剂残留、成本高、效率低、工业化困难等缺点。寻找一种新的提取茶褐素的方法，提高茶褐素提取效率、降低成本、安全绿色高效、适宜工业化生产具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种茶褐素及其抗氧化组分的制备方法。本发明采用绿色的超声辅助低共熔溶剂提取藏茶茶褐素、硅胶分级制备茶褐素抗氧化组分。

本发明提供了一种茶褐素，它是以茶为原料，采用低共熔溶剂结合超声提取、醇沉和膜透析技术制备得到。

进一步地，所述低共熔溶剂是由氯化胆碱和苹果酸按摩尔比1:0.5～4混合组成；和/或，所述低共熔溶剂的含水率为10％～50％；

优选地，所述低共熔溶剂是由氯化胆碱和苹果酸按摩尔比1:2混合组成；和/或，所述低共熔溶剂的含水率为20％～40％；

更优选地，所述低共熔溶剂的含水率为30％。

进一步地，所述超声的功率为330W～720W；和/或，超声时间为2min～34min。

进一步地，所述超声的功率为550W～600W；优选地，所述超声功率为590W；

和/或，超声时间为20min～30min；优选地，所述超声时间为26min。

进一步地，所述茶与低共熔溶剂的料液比为1:10～50(g/ml)；优选地，所述料液比为1:10～30(g/ml)；更优选地，所述料液比为1:18～22(g/ml)。

进一步地优选地，所述料液比为1:20(g/ml)。

进一步地，所述茶为藏茶。

进一步地，所述茶褐素的制备方法包括如下步骤：

(1)取藏茶，冷冻干燥后粉碎，过筛得藏茶粉；

(2)将氯化胆碱和苹果酸混合后加水，加热溶解得到低共熔溶剂；

(3)在藏茶粉中加入低共熔溶剂后超声提取，得提取液；

(4)将提取液进行醇沉和膜透析，得到茶褐素干粉；

优选地，

步骤(1)中，所述冷冻干燥在-40℃～30℃温度梯度下进行；

和/或，步骤(1)中，所述藏茶粉过60-100目筛；

和/或，步骤(4)中，所述醇沉方法为：提取液液抽滤后将滤液减压浓缩至滤液的1/5～1/10，得浓缩液；浓缩液依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3-5次，收集水层；往水层加入90％乙醇使乙醇最终体积分数为80％，低温静置过夜，在4000～5000r/min的条件下离心20～30min，收集离心所得沉淀和醇沉上清液；将沉淀用水溶解，离心后取上清液、浓缩、冷冻干燥，得大分子茶褐素干粉；

和/或，步骤(4)中，所述膜透析方法为：将醇沉后得到的醇沉上清液装入截留量为3500Da～4000Da的透析袋中进行透析，待透析平衡，收集截留液体，离心取上清液、浓缩、冷冻干燥，得小分子茶褐素干粉。

进一步地，所述茶褐素的制备方法还包括采用硅胶层析柱对得到的茶褐素干粉进行分级纯化；

优选地，所述茶褐素的制备方法还包括如下步骤：

1)将硅胶粉与甲醇混合后倾入层析柱中，用2-3倍体积甲醇平衡柱；

2)将茶褐素干粉用水进行溶解，得茶褐素溶液；

3)用蒸馏水洗脱平衡柱子，待平衡后，将茶褐素溶液上样，再用甲醇进行梯度洗脱；收集40-20％甲醇、60-40％甲醇、80-60％甲醇洗脱液组分中一种或多种，即得；

更优选地，步骤1)中，所述硅胶粉规格为50-300目；

和/或，步骤3)中，所述用甲醇进行梯度洗脱的洗脱条件为：100％甲醇，0-20min；100-80％甲醇，21-40min；80-60％甲醇，41-60min；60-40％甲醇，61-80min；40-20％甲醇，81-100min；20-0％甲醇，101-120min。

本发明还提供了前述的茶褐素的制备方法，它包括如下步骤：

(1)取藏茶，冷冻干燥后粉碎，过筛得藏茶粉；

(2)将氯化胆碱和苹果酸混合后加水，加热溶解得到低共熔溶剂；

(3)在藏茶粉中加入低共熔溶剂后超声提取，得提取液；

(4)将提取液进行醇沉和膜透析，得到茶褐素干粉；

优选地，

步骤(1)中，所述冷冻干燥在-40℃～30℃温度梯度下进行；

和/或，步骤(1)中，所述藏茶粉过60-100目筛；

和/或，步骤(4)中，所述醇沉方法为：提取液液抽滤后将滤液减压浓缩至滤液的1/5～1/10，得浓缩液；浓缩液依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3-5次，收集水层；往水层加入90％乙醇使乙醇最终体积分数为80％，低温静置过夜，在4000～5000r/min的条件下离心20～30min，收集离心所得沉淀和醇沉上清液；将沉淀用水溶解，离心后取上清液、浓缩、冷冻干燥，得大分子茶褐素干粉；

和/或，步骤(4)中，所述膜透析方法为：将醇沉后得到的醇沉上清液装入截留量为3500Da～4000Da的透析袋中进行透析，待透析平衡，收集截留液体，离心取上清液、浓缩、冷冻干燥，得小分子茶褐素干粉。

进一步地，所述制备方法还包括采用硅胶层析柱对得到的茶褐素干粉进行分级纯化；

优选地，所述茶褐素的制备方法还包括如下步骤：

1)将硅胶粉与甲醇混合后倾入层析柱中，用2-3倍体积甲醇平衡柱；

2)将茶褐素干粉用水进行溶解，得茶褐素溶液；

3)用蒸馏水洗脱平衡柱子，待平衡后，将茶褐素溶液上样，再用甲醇进行梯度洗脱；收集40-20％甲醇、60-40％甲醇、80-60％甲醇洗脱液组分中一种或多种，即得；

更优选地，步骤1)中，所述硅胶粉规格为50-300目；

和/或，步骤3)中，所述用甲醇进行梯度洗脱的洗脱条件为：100％甲醇，0-20min；100-80％甲醇，21-40min；80-60％甲醇，41-60min；60-40％甲醇，61-80min；40-20％甲醇，81-100min；20-0％甲醇，101-120min。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明方法采用低共熔溶剂，从根本上解决了茶褐素有机溶剂的大量使用所带来的高成本、高危害及高污染等一系列问题。

(2)采用透析的方法截留了小分子茶褐素，提高了茶褐素总的利用率，从根本上解决了藏茶茶褐素一般提取技术得率低的问题。

(3)与常规提取方法相比，本发明方法成本低、操作简单，得率高。

(4)与常规纯化方法相比，本发明方法降低了解决了茶褐素纯化的难问题，为后期抗氧化茶褐素的结构组成鉴定降低难度。

(5)通过本发明制备方法得到的茶褐素得率高，茶褐素抗氧化组分抗氧化能力强，接近于V_C的抗氧化能力(IC₅₀＝0.003mg/mL)。

总之，本发明方法显著提高了茶褐素的得率和利用率，降低了茶褐素纯化难度；采用本发明提取方法所得到的提取物中藏茶茶褐素得率大于12％，茶褐素组分2(40-20％甲醇)、组分3(60-40％甲醇)和组分4(80-60％甲醇)表现出较好的抗氧化能力，与VC的抗氧化能力相当。所得到的藏茶提取物中茶褐素得率高，在提取效率得到极大提高的情况下，成功制备了3个抗氧化活性极强的组分，具备实际推广应用价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为不同低共熔溶剂提取得到的提取液抗氧化当量值。

图2为不同低共熔溶剂提取得到的提取液茶褐素得率。

图3为料液比对藏茶茶褐素提取液中茶褐素得率的影响图。

图4为DES含水率对藏茶茶褐素提取液中茶褐素得率的影响图。

图5为超声功率对藏茶茶褐素提取液中茶褐素得率的影响图。

图6为提取时间对藏茶茶褐素提取液中茶褐素得率的影响图。

图7为氯化胆碱与苹果酸的摩尔比对藏茶茶褐素提取液中茶褐素得率的影响图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。本发明具体实施方式中利用藏茶提取茶褐素。

具体实施方式中涉及的检测方法如下：

(1)系统比色法测定茶褐素的得率

分别吸取20ml样品和20ml正丁醇放入分液漏斗中，摇振，待分层后将水层(下层)放于50ml三角瓶中，取水层液2ml加饱和草酸2ml，加入6ml蒸馏水，加95％乙醇，定容至25ml(溶液为B)。使用紫外分光光度计测定380nm处溶液的吸光度值，根据以下方式计算茶褐素得率(TBs)：

茶褐素得率(TBs,％)＝2*E_B*7.06/M，其中，E_B为样品吸光度(A)，M为样品干重(g)。

(2)抗氧化活性测定

①DPPH工作溶液的配制：称取0.05g DPPH完全溶解于50mL甲醇中，得浓度为0.01mg/mL的DPPH甲醇溶液。

②100μL DPPH甲醇溶液(0.01mg/mL)与1mL样品(1mg/mL)混合。混合物在室温下保持30min，立即将其置于紫外分光光度计中，并测量519nm波长处的吸光值。选择抗坏血酸作为参考。根据以下公式计算DPPH清除率。

清除率(％)＝(Ab-Af)*100/Ab

Ab是空白吸光值，Af样品吸光值。

实施例1、茶褐素的制备

茶褐素的制备方法如下：

(1)将藏茶处理得到藏茶粉，具体方法为：取藏茶，在-40℃～30℃的温度梯度下，冷冻干燥48-72h，粉碎，过60-100目筛，低温储存待用。

(2)低共熔溶剂的制备：将氯化胆碱与苹果酸按照摩尔比1:2混合于干燥反应器中，加氯化胆碱与苹果酸总质量20％的水，加热到70℃，搅拌40-50min，形成均一且透明的氯化胆碱-苹果酸溶液(DES溶液)，冷却，备用。DES溶液体积与水的体积比为7mL:3mL，DES溶液的含水率为30％。

(3)超声提取得提取液：按照料液比1:20(g/mL)在藏茶粉中加入DES溶液，超声提取，得茶褐素提取液。超声提取的参数为：超声功率590W，超声时间为26min。

(4)制备茶褐素：将步骤(3)制备得到的提取液抽滤，滤液减压浓缩至滤液的1/5～1/10，将上述浓缩液依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取2-4次，收集水层，往水层加入90％乙醇使乙醇最终体积分数为80％，低温静置过夜，在4200r/min的条件下离心20min，收集离心所得沉淀和醇沉上清液。将沉淀用水充分溶解，离心后取上清液、浓缩、冷冻干燥，即得大分子茶褐素干粉；将醇沉上清液装入截留量为3500Da的透析袋中，透析4天，待透析平衡，低共熔溶剂完全去除后，收集截留液体，离心取上清液、浓缩、冷冻干燥，即得分子量大于3500Da的小分子茶褐素干粉。将所得茶褐素干粉混合，即可。

实施例2、茶褐素中抗氧化组分的制备

茶褐素中抗氧化组分的制备方法如下：

(1)硅胶粉预处理：用50-300目硅胶粉为填料，首先用蒸馏水洗至中性，再在90-110℃干燥24h，备用。纯化前，再把硅胶粉于90-110℃活化2-3h。

(2)采用硅胶粉对实施例1制备得到的茶褐素进行分级纯化：将已预处理的500g硅胶粉和甲醇搅拌均匀后缓缓倾入层析柱中，然后用2-3倍体积甲醇平衡柱。先用蒸馏100％甲醇充分洗脱平衡柱子，待平衡后，取50mL茶褐素(茶褐素使用水溶解)提取液上样，再用甲醇分级洗脱(洗脱梯度及洗脱条件：100％甲醇，0-20min；100-80％甲醇，21-40min；80-60％甲醇，41-60min；60-40％甲醇，61-80min；40-20％甲醇，81-100min；20-0％甲醇，101-120min)，全程流速20mL/min，分段收集6种茶褐素抗氧化组分。其中收集的40-20％甲醇、60-40％甲醇、80-60％甲醇的组分为强抗氧化组分。

以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。

试验例1、低共熔溶剂的筛选

(1)低共熔溶剂的制备：将氯化胆碱分别与甘油、乙二醇、蔗糖、木糖醇、柠檬酸和苹果酸按照摩尔比1:2混合于干燥反应器中，加水，加热到70℃，搅拌40-50min，形成均一且透明的溶液(低共熔溶剂)，冷却备用。低共熔溶剂的含水率为30％。

(2)超声提取液的制备：称取实施例1方法制备的藏茶粉(1g)放入50mL收集瓶中，分别与35mL不同低共熔溶剂混合，超声提取，得茶褐素提取液。超声提取的参数为：超声功率590W，超声时间为20min。在超声提取过程中，为了避免高温对茶褐素等活性成分降解的影响，一直将样品放在冰水上。所有实验均为3个重复。提取完成后，提取液12000×g离心15min，取上清液，然后用微孔滤膜过滤(0.22μm)，滤液用系统比色法测定茶褐素得率，测3次。根据茶褐素提取液中茶褐素得率确定最优的低共熔溶剂，用于下一步的研究。

低共熔溶剂筛选结果如图1和图2所示：低共熔溶剂选用氯化胆碱和苹果酸作为组分时，提取液中茶褐素得率最高，提取液抗氧化当量值最小，即抗氧化能力最强。因此，最终选择摩尔比为1:2的氯化胆碱和苹果酸作为低共熔溶剂。

试验例2、茶褐素提取参数的筛选

在试验例1制备提取液的基础上，通过单因素实验探究低共熔溶剂结合超声提取方法中不同提取参数对藏茶茶褐素提取液中茶褐素得率的影响。不同提取参数包括：料液比(1:10，1:20，1:30，1:40，1:50)、低共熔溶剂中两个组分氯化胆碱和苹果酸的摩尔比(1:4，1:3，1:2，1:1，2:1)、低共熔溶剂的含水率(10％，20％，30％，40％，50％)、超声功率(330W，460W，590W，580W，720W)，超声时间(2min，10min，18min，26min，34min)，每个实验处理重复三次。

单因素试验结果如图3～7所示。单因素试验结果表明：料液比为1:20(如图3所示)时、低共熔溶剂(DES)含水率为30％(如图4所示)时、超声功率为590W(如图5所示)时，提取时间为26min(如图6所示)时，氯化胆碱与苹果酸的摩尔比为1:2(如图7所示)时，得到的提取液中茶褐素得率高。

试验例3、茶褐素提取工艺的筛选

根据单因素结果，保持氯化胆碱与苹果酸的摩尔比为1:2，对茶褐素提取工艺的筛选，提取工艺选择如表1所示。按照实施例1制备提取液的方法，采用表1所示提取工艺提取茶褐素，利用系统比色法测定茶褐素得率，结果见表1。

表1.茶褐素提取工艺的选择

从表1的试验结果可知：当料液比为1:20(w/v)，超声功率为590W，提取时间为26min，DES含水率为30％时，茶褐素的得率最高。

提取工艺验证实验

根据提取工艺考察结果，结合生产实际，确定最优提取工艺为料液比为1:20(w/v)，超声功率为590W，提取时间为26min，DES含水率为30％；按照上述提取工艺各制备了3批藏茶茶褐素提取液进行验证实验，验证茶褐素得率测量值为12.31±1.03％与茶褐素得率的试验值12.74±2.34％和预测值13.34接近。验证结果，充分证明了该提取工艺所得藏茶提取液茶褐素得率高且稳定。

试验例4、茶褐素中抗氧化组分的抗氧化活性检测

采用实施例2所述方法制备抗氧化组分，收集20-0％甲醇(组分1)、40-20％甲醇(组分2)、60-40％甲醇(组分3)、80-60％甲醇(组分4)、100-80％甲醇(组分5)、100％甲醇(组分6)的组分。采用抗氧化活性测定方法测定各组分抗氧化活性。

从抗氧化的试验结果可知：组分1，组分2，组分3，组分4，组分5和组分6均表现出较好的抗氧化能力，抗氧化值(IC₅₀)分别为0.06mg/mL、0.0064mg/mL、0.009mg/mL、0.004mg/mL、0.046mg/mL、0.09mg/mL。其中，组分2(40-20％甲醇)、组分3(60-40％甲醇)和组分4(80-60％甲醇)表现出相对较好的抗氧化能力，IC₅₀分别为0.0064mg/mL、0.009mg/mL、和0.004mg/mL，接近于VC的抗氧化能力(IC₅₀＝0.003mg/mL)。

综上，本发明采用特定低共熔溶剂结合超声法提取藏茶中的茶褐素提取物，同时，通过硅胶分级法制备得到茶褐素中抗氧化活性十分优异的抗氧化组分。本发明的茶褐素提取制备方法操作简便、纯化难度小、有机溶剂使用量很少、提取时间短、成本低、绿色环保、污染小，并且茶褐素得率高，从而提高了茶褐素的利用率；并且，其抗氧组分的抗氧化效果优异，具备实际推广应用价值。

Claims (10)

1.一种茶褐素，其特征在于：它是以茶为原料，采用低共熔溶剂结合超声提取、醇沉和膜透析技术制备得到。

2.根据权利要求1所述的茶褐素，其特征在于：所述低共熔溶剂是由氯化胆碱和苹果酸按摩尔比1:0.5～4混合组成；和/或，所述低共熔溶剂的含水率为10％～50％；

优选地，所述低共熔溶剂是由氯化胆碱和苹果酸按摩尔比1:2混合组成；和/或，所述低共熔溶剂的含水率为20％～40％；

更优选地，所述低共熔溶剂的含水率为30％。

3.根据权利要求1所述的茶褐素，其特征在于：所述超声的功率为330W～720W；和/或，超声时间为2min～34min。

4.根据权利要求3所述的茶褐素，其特征在于：所述超声的功率为550W～600W；优选地，所述超声功率为590W；

和/或，超声时间为20min～30min；优选地，所述超声时间为26min。

5.根据权利要求1所述的茶褐素，其特征在于：所述茶与低共熔溶剂的料液比为1:10～50(g/ml)；优选地，所述料液比为1:10～30(g/ml)；更优选地，所述料液比为1:18～22(g/ml)。

6.根据权利要求1所述的茶褐素，其特征在于：所述茶为藏茶。

7.根据权利要求1～6任一项所述的茶褐素，其特征在于：所述茶褐素的制备方法包括如下步骤：

(1)取藏茶，冷冻干燥后粉碎，过筛得藏茶粉；

(2)将氯化胆碱和苹果酸混合后加水，加热溶解得到低共熔溶剂；

(3)在藏茶粉中加入低共熔溶剂后超声提取，得提取液；

(4)将提取液进行醇沉和膜透析，得到茶褐素干粉；

优选地，

步骤(1)中，所述冷冻干燥在-40℃～30℃温度梯度下进行；

和/或，步骤(1)中，所述藏茶粉过60-100目筛；

和/或，步骤(4)中，所述醇沉方法为：提取液液抽滤后将滤液减压浓缩至滤液的1/5～1/10，得浓缩液；浓缩液依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3-5次，收集水层；往水层加入90％乙醇使乙醇最终体积分数为80％，低温静置过夜，在4000～5000r/min的条件下离心20～30min，收集离心所得沉淀和醇沉上清液；将沉淀用水溶解，离心后取上清液、浓缩、冷冻干燥，得大分子茶褐素干粉；

和/或，步骤(4)中，所述膜透析方法为：将醇沉后得到的醇沉上清液装入截留量为3500Da～4000Da的透析袋中进行透析，待透析平衡，收集截留液体，离心取上清液、浓缩、冷冻干燥，得小分子茶褐素干粉。

8.根据权利要求7所述的茶褐素，其特征在于：所述茶褐素的制备方法还包括采用硅胶层析柱对得到的茶褐素干粉进行分级纯化；

优选地，所述茶褐素的制备方法还包括如下步骤：

1)将硅胶粉与甲醇混合后倾入层析柱中，用2-3倍体积甲醇平衡柱；

2)将茶褐素干粉用水进行溶解，得茶褐素溶液；

3)用蒸馏水洗脱平衡柱子，待平衡后，将茶褐素溶液上样，再用甲醇进行梯度洗脱；收集40-20％甲醇、60-40％甲醇、80-60％甲醇洗脱液组分中一种或多种，即得；

更优选地，步骤1)中，所述硅胶粉规格为50-300目；

和/或，步骤3)中，所述用甲醇进行梯度洗脱的洗脱条件为：100％甲醇，0-20min；100-80％甲醇，21-40min；80-60％甲醇，41-60min；60-40％甲醇，61-80min；40-20％甲醇，81-100min；20-0％甲醇，101-120min。

9.权利要求1～8任一项所述的茶褐素的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)取藏茶，冷冻干燥后粉碎，过筛得藏茶粉；

(2)将氯化胆碱和苹果酸混合后加水，加热溶解得到低共熔溶剂；

(3)在藏茶粉中加入低共熔溶剂后超声提取，得提取液；

(4)将提取液进行醇沉和膜透析，得到茶褐素干粉；

优选地，

步骤(1)中，所述冷冻干燥在-40℃～30℃温度梯度下进行；

和/或，步骤(1)中，所述藏茶粉过60-100目筛；

和/或，步骤(4)中，所述醇沉方法为：提取液液抽滤后将滤液减压浓缩至滤液的1/5～1/10，得浓缩液；浓缩液依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3-5次，收集水层；往水层加入90％乙醇使乙醇最终体积分数为80％，低温静置过夜，在4000～5000r/min的条件下离心20～30min，收集离心所得沉淀和醇沉上清液；将沉淀用水溶解，离心后取上清液、浓缩、冷冻干燥，得大分子茶褐素干粉；

和/或，步骤(4)中，所述膜透析方法为：将醇沉后得到的醇沉上清液装入截留量为3500Da～4000Da的透析袋中进行透析，待透析平衡，收集截留液体，离心取上清液、浓缩、冷冻干燥，得小分子茶褐素干粉。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括采用硅胶层析柱对得到的茶褐素干粉进行分级纯化；

优选地，所述茶褐素的制备方法还包括如下步骤：

1)将硅胶粉与甲醇混合后倾入层析柱中，用2-3倍体积甲醇平衡柱；

2)将茶褐素干粉用水进行溶解，得茶褐素溶液；

3)用蒸馏水洗脱平衡柱子，待平衡后，将茶褐素溶液上样，再用甲醇进行梯度洗脱；收集40-20％甲醇、60-40％甲醇、80-60％甲醇洗脱液组分中一种或多种，即得；

更优选地，步骤1)中，所述硅胶粉规格为50-300目；

和/或，步骤3)中，所述用甲醇进行梯度洗脱的洗脱条件为：100％甲醇，0-20min；100-80％甲醇，21-40min；80-60％甲醇，41-60min；60-40％甲醇，61-80min；40-20％甲醇，81-100min；20-0％甲醇，101-120min。

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