CN110156907B - 一种分离鉴定黄水中多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体公开了一种分离鉴定黄水中多糖的方法，通过离心、超滤、醇沉、除杂等前处理初步提纯多糖，离子交换柱和凝胶层析纯化黄水粗多糖，通过甲基和/或乙酰化、分子量测定处理以及波谱分析解析纯化黄水多糖的理化性质，对该黄水多糖进行抗氧化能力测定，测得该多糖具有较强的清除1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼(DPPH)自由基能力，表明白酒酿造副产物黄水中含有生物活性物质多糖，为黄水的深层次开发或利用提供了理论基础。

Description

一种分离鉴定黄水中多糖的方法

技术领域

本发明涉及一种分离鉴定多糖的方法，尤其适用于黄水中多糖的分离鉴定。

背景技术

白酒是我国传统蒸馏酒，在白酒酿造过程中，微生物代谢生成的水与酒醅中的水逐渐沉降，将酒醅中有机酸、单宁、色素、可溶性淀粉、蛋白质、还原糖及其他香味物质溶于其中，并且沉积到窖池底部，形成了棕黄色的粘稠液体——黄水。因此，黄水中含有大量残留的可溶性淀粉(2.0-4.5g/mL)。淀粉经过酶或微生物作用得到进一步降解，产生了多糖、双糖及单糖等物质，可溶性的糖类物质最终溶解在黄水中。因此，对黄水的研究，不仅对于提高酒质、提升生产工艺等具有重要意义，还能为合理开发黄水资源提供技术依据。

黄水中含有较多的糟醅残渣，这些物质与生产过程中的水分共同形成的物质一般较为粘稠，不能直接用于化学仪器检测，必须通过一定的预处理方法对固体沉淀处理，提取其中的有效成分，才能分析出多糖并鉴定。如中国专利201210369333公开了一种分析黄水中组分的方法，包括离心黄水收集沉淀、对沉淀进行超声破碎处理、对超声破碎后的混合液离心萃取处理、将萃取后的物质利用全二维气相色谱仪和飞行时间质谱仪综合分析，得出了黄水中的主要成分。

多糖是生物体中广泛存在的物质，是一类由许多相同或不同的单糖以α/β-糖苷键连接而成的天然高分子多聚物。活性多糖是指具有某种特殊生理活性的多糖化合物，如免疫活性、抗炎活性、抗氧化活性、降血脂活性等。活性多糖广泛存在于植物和微生物的细胞壁中，如灵芝多糖、枸杞多糖、猴头菇多糖、海带多糖、石斛多糖等。

粗多糖的分离纯化较常用的有离子交换柱层析和葡聚糖凝胶色谱柱层析。离子交换分离的原理是根据被分离物质和固定相上带电荷基团相结合的强弱能力的不同来进行分离，固定相上带电荷基团通过静电作用与带有相反电荷的被分离物相结合，当用离子性溶剂洗脱时，洗脱液能够将固定相上的样品离子交换下来。而不同分子量的多糖所带电荷有差异，因此洗脱剂会在不同的洗脱阶段将多糖分离开。

凝胶色谱分离多糖主要是依据分子筛的阻通，大分子物质体积较大，不易进入凝胶颗粒内部的微孔中，只能分布在颗粒之间随着洗脱剂移动，因此经过色谱柱时首先被洗脱下来。而小分子物质的体积较小，除了在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒内部，因此在色谱柱上的运动途径相对较长，在大分子物质之后被洗脱下来。

现有对黄水的研究集中在黄水中的有机物质和微生物等方面，对黄水中多糖的研究较少，更多的是对黄酒中的多糖进行了分离和鉴定。如“黄酒中多糖的提取和分析”介绍了黄酒中多糖的提取和分析方法，其确定了黄酒多糖的最佳提取工艺，分析纯化后多糖的化学组分为中性糖含量为89.6％、糠醛酸含量为0.48％、蛋白质含量为4％(参见“工业微生物”，2018,48(1),1-7,)。

现有技术大都关注黄水中的有机物质和微生物等方面的研究，尚无关于黄水中生物活性多糖的研究。

发明内容

本发明的目的在于结合现有技术的不足，提供一种分离鉴定黄水中多糖的方法，采用离心、超滤、醇沉、离子交换柱层析、葡聚糖凝胶柱层等方法，对黄水进行预处理、分离并纯化多糖，采用化学方法和波谱学方法判定多糖的结构。

本发明的又一个目的在于提供一种制备多糖的方法，该制备方法以白酒酿造副产物黄水为原料。

本发明解决其技术问题所采用的分离鉴定黄水中多糖的方法，包括以下步骤：

(1)黄水前处理：对黄水进行离心、超滤、醇沉处理，收集沉淀并干燥得到黄水粗多糖；

(2)黄水粗多糖除杂：除去黄水粗多糖中的蛋白质、色素及杂质；

(3)黄水粗多糖纯化：利用离子交换层析柱和凝胶层析纯化黄水粗多糖，得到黄水多糖；

(4)黄水多糖理化性质分析：通过化学处理和波谱分析测定纯化后的多糖组分的理化性质。

进一步地，所述步骤(1)具体包括：用离心机对黄水进行至少一次离心处理，收集上清液并超滤，然后对黄水超滤液进行醇沉处理，再次离心，收集沉淀并干燥；其中，除首次离心的条件为：离心温度为0℃-4℃、离心力为4000g-6000g、离心时间为15-30min，后续离心处理的条件为：离心温度为0℃-4℃、离心力为8000g-10000g、离心时间为5-25min。

优选地，超滤处理前先将收集的上清液通过0.45μm水系过滤头过滤，然后采用超滤膜包进行超滤。

进一步地，所述步骤(1)中超滤截留组分的分子量大于3000Da。

超滤后进行醇沉处理，向黄水超滤液中加入无水乙醇，充分混合，静置离心后收集沉淀。提取过程中优选采用乙醇分级沉淀法使多糖逐级沉淀，具体方法为：用酒精计测黄水超滤液中酒精的浓度，向黄水超滤液中缓慢的加入无水乙醇，当有絮状沉淀出现时，停止加入无水乙醇，0-4℃静置，离心，收集上清液，对上清液重复上述步骤直至不再出现沉淀。本发明中，醇沉时乙醇的浓度达到65-75％(v/v)时，以及4℃下静置24h处理得到的黄水中多糖的量最多。

进一步地，步骤(2)具体包括：向黄水粗多糖中加入Sevag试剂，振摇，离心，收集最上层糖液，回收剩余样品，重复上述步骤直至中间层无白色蛋白质出现，用洗糖试剂洗去糖液中的色素及杂质，然后将糖液转移至透析袋透析，真空冷冻干燥滤液得到除杂后的黄水粗多糖。

其中，黄水粗多糖与Sevag试剂的体积比优选为1:1-5。Sevag试剂为三氯甲烷和正丁醇体积比为4:1的混合溶液，Sevag法处理多糖是为了脱除溶液中的蛋白，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，然后用离心法除去。

洗糖试剂包括甲醇、95％乙醇、无水乙醇、丙酮中的一种或多种。利用洗糖试剂洗去糖液中的色素及杂质时，分别在糖液中加入甲醇、95％乙醇、无水乙醇、丙酮中的一种或多种洗去糖液中的色素及其他的水溶性杂质。

优选地，利用3500Da透析袋在0-4℃下透析48h-72h，期间每隔一段时间换一次蒸馏水。透析后，将滤液在-80℃下真空冷冻干燥，干燥时间优选为24h。

进一步地，步骤(3)中采用DEAE FF离子交换层析柱纯化，洗脱液为超纯水以及0.05-0.5mol/LNaCl，流速为0.5-0.6mL/min。

进一步地，采用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析，流动相为超纯水，流速为0.4-0.5mL/min。

优选地，洗脱条件为：层析柱尺寸为2.6×20cm；洗脱条件为：层析柱尺寸为2.6×20cm；洗脱液依次为超纯水、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L和0.5mol/LNaCl，流速为0.5mL/min；每10min收集1管洗脱液，每种洗脱液收集40管。

优选地，Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析时洗脱液的流速为0.5mL/min。优选地，洗脱条件为：层析柱尺寸为1.6×60cm；洗脱液流速为0.5mL/min，每10min收集1管洗脱液，共收集40管；

进一步地，测定纯化后的多糖理化性质的方法包括：

将纯化后的多糖组分与不同分子量的葡聚糖标准品通过糖柱色谱柱串联凝胶柱分析，测定多糖的纯度及分子质量；

对纯化后的多糖组分进行乙酰化和/或甲基化处理，然后通过气相色谱-质谱联用仪进行组成分析；以及，

利用红外光谱和核磁共振分析多糖的理化性质。

优选地，糖柱色谱柱串联凝胶柱分析时的条件为流动相为0.04-0.05mol/L NaCl，流速为0.8-1.0mL/min，柱温为40℃。

甲基化多糖分析的原理：将多糖中的羟基完全甲基化反应后，通过将其水解、还原及乙酰化后，运用分析仪器检测其降解后所得的部分甲基化alditol乙酸酯的种类，依次确定多糖结构中的糖苷键类型。

GC或GC-MS是定性和定量分析多糖中各种多糖残基的键型的最简便的方法，但前提是甲基化多糖必须转化成可挥发性的衍生物，如alditol，其在GC上仅出现一个峰，定量测定时不需要反应因子校正。

甲基化多糖水解时，可先用甲酸处理，再用无机酸或三氟乙酸处理，无机酸可以为硫酸。使用硫酸水解时需要用碳酸钡中和后才能用离子交换树脂去离子，而三氟乙酸可以通过蒸馏除去。然后利用NaBH₄将甲基化的单糖还原成相应的alditol。

若多糖上本来就含有甲基，可直接水解、还原、乙酰化，进行GC-MS分析。

优选地，利用气相色谱-质谱联用仪采用以下条件分析：RXI-5 SIL MS色谱柱；起始温度100-120℃，以3℃/min升温至250℃，保持5min；进样口和检测器温度保持250℃，载气为氦气，流速为0.8-1.0mL/min。

上述的理化性质测定还包括黄水多糖抗氧化活性的测定。具体为黄水多糖清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力的测定。

本发明的有益效果为：

本发明方法首先利用离心将黄水分成了液体和固体两部分，并利用超滤截留含多糖的组分，采用离心的方法处理黄水，对黄水中化合物结构不产生破坏；通过这些前处理操作，能够最大限度地萃取黄水中液体和固体所含有的易挥发和不易挥发的组分；通过Sevag试剂去除粗多糖中的蛋白质以及使用洗糖试剂去除粗多糖中的色素和水溶性杂质，能对粗多糖进行初步纯化以便于后续分析；利用阴离子交换柱层析和凝胶层析提纯黄水粗多糖，得到的黄水多糖能够用质谱及波谱学分析。本发明还解析出了分离出的黄水多糖的分子量、组成、结构、所含糖苷键的种类以及多糖的抗氧化能力，说明该分离鉴定方法能够有效地分离出黄水中的多糖，分析得到的结果可靠，解决现有技术中难于分离鉴定黄水中多糖的问题。

附图说明

图1为实施例黄水中多糖的离子交换柱层析(DEAE FF)洗脱图；

图2为实施例黄水中的多糖YSPa凝胶层析(Sephadex G-100)洗脱图；

图3为多糖YSPaa纯度及相对分子质量校正曲线图；

图4为单糖标准品和YSPaa的气相色谱图；

图5为黄水中的多糖YSPaa中糖苷键的气相色谱图；

图6为黄水多糖YSPaa的红外光谱图；

图7为黄水多糖YSPaa的¹HNMR图；

图8为黄水多糖YSPaa的¹³C NMR图；

图9为黄水多糖YSPaa的DEPT 135图；

图10为黄水多糖YSPaa的¹H-¹H COSY图；

图11为黄水多糖YSPaa的HSQC图；

图12为黄水多糖YSPaa的¹H-¹H NOESY图；

图13为对比例1黄水中多糖的离子交换柱层析(DEAE FF)洗脱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

1、主要试剂及样品

芝麻香型白酒酿造副产物黄水取自某酒业股份有限公司，当天取样后于-20℃条件下存储备用；

超纯水取自Millipore-Q系统制备；

单糖标准品(鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)，均为色谱纯，购于Sigma公司；

2、主要仪器及材料

DEAE Sepharose Fast Flow树脂(DEAE FF树脂)、Sephadex G-100树脂，购于GEHealthcare公司；

高速冷冻离心机(CR22N)，株式会社日立制作所；

真空冷冻干燥仪(FD-1B-80)，南京普森仪器有限公司；

高效液相色谱(1200)，美国安捷伦公司；

色谱柱KS805-804-802串联凝胶柱(7.8×300mm)，昭和电工科学仪器(上海)有限公司；

气相色谱-质谱联用仪(7890A-5975C)，美国安捷伦公司；

核磁共振波谱仪(ADVANCE 600M)，德国Bruker公司；

红外光谱仪(Nicolet iS10)，美国尼高力公司。

3、分离方法

(1)黄水前处理：取出在-20℃放置的黄水样品于常温下放置6h解冻后备用。量取1.0L黄水样品，于4℃恒温条件下进行离心(4000g，20min)，取上清液，用滤纸过滤后进行高速离心(4℃，8000g，20min)。取上清液经过0.45μm水系过滤头过滤之后，采用超滤膜包(截留分子量＞3kDa)进行超滤，收集分子量＞3kDa的组分备用。采用酒精计测定黄水超滤液的酒精度，在其中加入一定体积的无水乙醇，使得样品中乙醇的最终浓度为75％。将上述样品置于4℃条件下静置24h后，利用高速离心仪对其离心(4℃，8000g，20min)，弃上清液，收集沉淀，于40℃鼓风干燥除去多余的乙醇。

(2)黄水中粗多糖除杂：将沉淀置于50mL离心管中，按照体积比1:1在其中加入Sevag试剂(三氯甲烷：正丁醇＝4：1)，并将离心管置于恒温摇床振摇30min，离心(4℃，8000g，20min)，收集最上层糖液，回收剩余样品。重复操作多次，直至中间层不再出现白色蛋白质。在糖液中分别加入一定体积的95％的乙醇、无水乙醇、丙酮清洗糖液。将糖液转移至3500Da的透析袋中，在4℃冰箱中透析48h(每6h换一次蒸馏水)。之后将滤液进行真空冷冻干燥(-80℃，24h)，得到黄水粗多糖，记为cYSP。

(3)黄水粗多糖的阴离子交换层析纯化：称取150mg的cYSP溶于10mL超纯水，离心(4℃，8000g，15min)取上清液，经0.45μm水系过滤头过滤后，逐滴上样至DEAE FF离子交换层析柱中(2.6×20cm)，依次用超纯水、0.05、0.1、0.2、0.3和0.5mol/L NaCl溶液洗脱，流速为0.5mL/min，每10min收集1管洗脱液，每种洗脱液收集40管。每管吸取30μL采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，根据吸光值OD，绘制洗脱曲线，洗脱曲线如图1所示。根据洗脱曲线中不同峰段的多糖组分，将不同的洗脱组分转移至3500Da的透析袋中，在4℃冰箱中透析48h(每6h换一次蒸馏水)，之后将滤液进行真空冷冻干燥(-80℃，24h)。得到3种多糖组分，分别记为YSPa、YSPb和YSPc。

本发明的实施例以YSPa为例进行进一步地纯化及结构分析。

4、纯化方法

黄水粗多糖的凝胶层析纯化：称取25mg的样品YSPa溶于5mL超纯水中，离心(4℃，8000g，15min)取上清液，经0.45μm水系过滤头过滤后，逐滴上样至Sephadex G-100层析柱中(1.6×60cm)，使用超纯水洗脱，流速为0.5mL/min，每10min收集1管洗脱液，共收集40管。每管吸取30μL采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，根据吸光值OD，绘制洗脱曲线，洗脱曲线如图2所示。根据洗脱曲线中峰段的多糖组分，将洗脱组分转移至3500Da的透析袋中，在4℃冰箱中透析48h(每6h换一次蒸馏水)，之后将滤液进行真空冷冻干燥(-80℃，24h)。得到1种纯化多糖组分，记为YSPaa。

5、结构分析方法

(1)黄水多糖YSPaa的分子量测定：样品浓度及进样量(2mg/mL,20μL)。色谱柱:KS805-804-802串联凝胶柱(7.8×300mm)，流动相为0.05mol/LNaCl，流速0.8mL/min，柱温40℃。以不同相对分子质量的葡聚糖(Mw 5200，11600，23800，48600，148000，273000，410000，668000)作为标准品，做出标准曲线，测定多糖的纯度及相对分子质量，得到lgMp-RT，lgMw-RT，lgMn-RT校正曲线，如图3a、3b、3c所示，根据校正曲线求得样品的分子量。

(2)黄水多糖YSPaa的单糖组成测定：称取2mg的YSPaa样品离心管中，加入1mL的2mol/L三氟乙酸水解90min，转移至圆底烧瓶中使用旋转蒸发仪蒸干。残留物中加入2mL双蒸水，60mg NaBH₄还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，101℃烘箱烘干。加入1mL乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却，加入3mL甲苯,减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的乙酸酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液,如此重复4次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，分析采用气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品，如图4所示。GC-MS条件：RXI-5 SIL MS色谱柱30*0.25*0.25；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min，保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。

(3)黄水多糖YSPaa的甲基化分析：称取10mg的YSPaa样品置于反应瓶中，加入5mLDMSO，快速加入100mgNaOH粉末，封闭，在超声作用下溶解，再加入2mL碘甲烷反应。最后加入1mL去离子水到上述混合物中终止甲基化反应。取甲基化后的多糖，加入1mL的2mol/L三氟乙酸水解90min，旋转蒸发仪蒸干。残留物中加入2mL双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，101℃烘箱烘干，然后加入1mL乙酸酐乙酰化100℃反应1h,冷却，然后加入3mL甲苯,减压浓缩蒸干，重复4-5次,以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液,如此重复4次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，分析采用气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品，结果如图5所示。GC-MS条件：RXI-5 SIL MS色谱柱30*0.25*0.25；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。

(4)黄水多糖YSPaa的红外光谱分析：称取3mgYSPaa样品与适量KBr粉末混合，研磨均匀之后压片处理，放入红外光谱仪中进行分析，波数范围是400-100000px-1。光谱仪分辨率100px-1，信躁比是50000:1，扫描32次，结果如图6所示。

(5)黄水多糖YSPaa的核磁共振分析：称取20mgYSPaa样品于离心管中，加入1mL重水溶解样品。取0.6mL溶液加入到核磁管中，分别进行¹H，¹³C，DEPT 135，¹H-1H COSY，HSQC，H-H NOESY扫描，结果分别如图7至图12所示。

实施例2

其与实施例1的区别在于：

步骤(1)中，黄水前处理时，在2℃恒温条件下离心(4000g)15min，后续离心的条件均为在2℃恒温条件下以10000g的离心力离心5min；醇沉处理时，向黄水超滤液中加入无水乙醇至乙醇的最终浓度为65％(v/v)，4℃下静置24h后，经经高速离心仪对其离心(4℃，10000g，5min)，弃上清液，收集沉淀，于40℃鼓风干燥除去多余的乙醇。

黄水中粗多糖除杂时，黄水粗多糖与Sevag试剂的体积比为1:3，离心条件为：0℃，以离心力10000g离心处理5min。

黄水粗多糖的阴离子交换柱层析纯化时，离心条件为：0℃，以10000g离心力离心处理5min。洗脱液流速为0.6mL/min，依次用超纯水超纯水、0.05、0.1、0.2、0.3和0.4mol/LNaCl溶液洗脱，每10min收集1管洗脱液，每种洗脱液收集40管。绘制洗脱曲线。

鉴定方法步骤中，糖柱色谱柱串联凝胶柱分析的洗脱液为0.05mol/L NaCl溶液，流速为1.0mL/min。

实施例3

其与实施例1的区别在于：

步骤(1)中，黄水前处理时，在4℃恒温条件下离心(4000g)18min，后续离心的条件均为在4℃恒温条件下以9000g的离心力离心15min；醇沉处理时，向黄水超滤液中加入无水乙醇至乙醇的最终浓度为70％(v/v)，4℃下静置24h，经高速离心仪对其离心(4℃，9000g，15min)，弃上清液，收集沉淀，于40℃鼓风干燥除去多余的乙醇。

黄水中粗多糖除杂时，黄水粗多糖与Sevag试剂的体积比为1:5，离心条件为4℃，9000g，15min。黄水粗多糖的阴离子交换层析纯化时，离心条件为4℃，9000g，15min，洗脱液流速为0.5mL/min，依次用超纯水超纯水、0.05、0.1、0.2、0.3和0.4mol/L NaCl溶液洗脱，每10min收集1管洗脱液，每种洗脱液收集40管。绘制洗脱曲线。

鉴定方法步骤中，糖柱色谱柱串联凝胶柱分析的洗脱液为0.05mol/L NaCl溶液，流速为0.9mL/min。

经改变黄水的前处理条件以及黄水多糖提取、纯化的条件发现，上述条件下均能得到如图1所示的各多糖组分离开的洗脱曲线。

对比例1

其与实施例1的区别在于，黄水前处理时，对黄水离心的离心力为4000g、得到的上清液进行活性炭吸附后进行超滤、醇沉处理。具体步骤如下：

(1)黄水前处理：量取100mL黄水样品，将滤液于4℃恒温条件下进行离心(4000g，20min)，取上清液，向其中加入10g活性炭处理30min，经过0.22μm水系过滤头过滤之后，采用超滤膜包(截留分子量＞3kDa)进行超滤，收集分子量＞3kDa的组分备用。采用酒精计测定上清液的酒精度，在其中加入一定体积的95％乙醇，使得样品中乙醇的最终浓度为75％。将上述样品置于4℃条件下静置24h后，利用高速离心仪对其离心(4℃，8000g，20min)，弃上清液，收集沉淀，于40℃鼓风干燥除去多余的乙醇。

(2)黄水中粗多糖除杂：将沉淀置于50mL离心管中，按照体积比1:1在其中加入Sevag试剂(三氯甲烷：正丁醇＝4：1)，并将离心管置于恒温摇床振摇30min，离心(4℃，8000g，20min)，收集最上层糖液，回收剩余样品。重复操作多次，直至中间层不再出现白色蛋白质。在糖液中分别加入一定体积的95％的乙醇、无水乙醇、丙酮清洗糖液。将糖液转移至3500Da的透析袋中，在4℃冰箱中透析48h(每6h换一次蒸馏水)。真空冷冻干燥(-80℃，24h)滤液，得到黄水粗多糖，记为d’YSP。

(3)黄水粗多糖的阴离子交换层析纯化：称取150mg的d’YSP溶于10mL超纯水，离心(4℃，8000g，15min)取上清液，将上清液逐滴上样至DEAE FF离子交换层析柱中(2.6×20cm)，依次用超纯水、0.05、0.1、0.2、0.3和0.5mol/LNaCl溶液洗脱，流速为0.5mL/min，每10min收集1管洗脱液，每种洗脱液收集40管。每管吸取30微升采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，根据吸光值OD，绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线中不同峰段的多糖组分，将不同的洗脱组分转移至3500Da的透析袋中，在4℃冰箱中透析48h(每6h换一次蒸馏水)，之后将滤液进行真空冷冻干燥(-80℃，24h)。得到如图13所示YSPc’的洗脱曲线。

对比例2

其与实施例1的区别在于，黄水前处理时，对黄水离心的离心力为4000g、醇沉处理时样品中乙醇的浓度为85％，在4℃条件下静置18h，离心收集沉淀得到黄水粗多糖。具体步骤如下：

(1)黄水前处理：量取100mL黄水样品，于4℃恒温条件下进行离心(4000g，20min)，取上清液，用滤纸过滤后进行离心(4℃，6000g，30min)。取上清液经过0.45μm水系过滤头过滤之后，采用超滤膜包(截留分子量＞3kDa)进行超滤，收集分子量＞3kDa的组分备用。采用酒精计测定黄水超滤液的酒精度，在其中加入一定体积的无水乙醇，使得样品中乙醇的最终浓度为85％。将上述样品置于4℃条件下静置18h后，利用高速离心仪对其离心(4℃，6000g，30min)，弃上清液，收集沉淀，于40℃鼓风干燥除去多余的乙醇。

(2)黄水中粗多糖除杂：将沉淀置于50mL离心管中，按照体积比1:1在其中加入Sevag试剂(三氯甲烷：正丁醇＝4：1)，并将离心管置于恒温摇床振摇30min，离心(4℃，8000g，30min)，收集最上层糖液，回收剩余样品。重复操作多次，直至中间层不再出现白色蛋白质。在糖液中分别加入一定体积的无水乙醇洗。将糖液转移至3500Da的透析袋中，在4℃冰箱中透析48h(每6h换一次蒸馏水)。真空冷冻干燥(-80℃，24h)滤液，得到黄水粗多糖，记为d”YSP。

(3)黄水粗多糖的阴离子交换层析纯化：称取150mg的d”YSP溶于10mL超纯水，离心(4℃，8000g，15min)取上清液，将上清液逐滴上样至DEAE FF离子交换层析柱中(2.6×20cm)，依次用超纯水、0.05、0.1、0.2、0.3和0.5mol/LNaCl溶液洗脱，流速为0.5mL/min，每10min收集1管洗脱液，共收集40管。每管吸取30微升采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，根据吸光值OD，绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线中不同峰段的多糖组分，将不同的洗脱组分转移至3500Da的透析袋中，在4℃冰箱中透析48h(每6h换一次蒸馏水)，之后将滤液进行真空冷冻干燥(-80℃，24h)。得到的YSPc”的洗脱曲线与图8所示的洗脱曲线类似。

通过本发明的分离方法能够分离出纯度适于化学仪器检测的多糖，利用本发明的鉴定方法也能够鉴定出黄水多糖中糖苷键类型以及主、支链结构。从图1可以看出，收集到3个多糖洗脱组分，解析了1种水洗多糖组分的结构，表明白酒酿造副产物黄水中含有生物活性物质多糖，为黄水的深层次开发或高附加值利用提供了理论基础。

经过分析图3至图7以及解析分离YSPaa多糖的结构，可知黄水多糖YSPaa的分子量为48.5kDa；单糖组成分析表明该多糖由葡萄糖组成；甲基化结果表明该多糖共含有1-Glcp，1,4-Glcp，1,6-Glcp，1,4,6-Glcp四种糖苷键，各糖苷键之间的摩尔比为8.58:67.56:15.28:8.58；核磁共振分析显示，该多糖含有分支结构，主链为→4)-α-Glcp(1→，非还原端为β-Glcp(1→，支链→6)-α-Glcp(1→通过O-6键连接在主链上。

通过对分离出的黄水多糖进行清除DPPH自由基分析，发现该黄水多糖具有清除DPPH自由基的能力，与阳性对照抗氧化剂6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)相比，该多糖清除DPPH自由基的能力是Trolox的1.72倍，表明白酒酿造副产物黄水中含有生物活性物质多糖。另外，经过实验发现，cYSP、YSPb和YSPc均具有清除DPPH自由基能力，分别是Trolox的1.98倍、3.42倍、2.52倍。从此实施例可知，从芝麻香型白酒酿造副产物黄水中分离得到了功能性多糖，说明黄水中存在大量生物活性多糖，为黄水的深加工或高附加值利用提供理论支撑。

利用本发明方法中的前处理分离纯化多糖，能够得到较纯的黄水多糖，且提取的黄水多糖量含量范围是158～169mg/L，纯化多糖得率为9.4±0.7％。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种分离鉴定黄水中多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)黄水前处理：对黄水进行离心、超滤、醇沉处理，收集沉淀并干燥，得到黄水粗多糖；

(2)黄水粗多糖除杂：除去黄水粗多糖中的蛋白质、色素及杂质；

(3)黄水粗多糖纯化：利用离子交换层析柱和凝胶层析纯化黄水粗多糖，得到黄水多糖；

(4)黄水多糖理化性质分析：通过化学处理和波谱分析测定纯化后的多糖组分的理化性质；

步骤(1)具体包括：用离心机对黄水进行至少一次离心处理，收集上清液并超滤，然后对黄水超滤液进行醇沉处理，再次离心，收集沉淀并干燥；其中，首次离心的条件为：离心温度为0℃-4℃、离心力为4000g-6000g、离心时间为15-30min，后续离心处理的条件为：离心温度为0℃-4℃、离心力为8000g-10000g、离心时间为5-25min；所述超滤截留组分的分子量大于3000Da；

步骤(2)具体包括：向黄水粗多糖中加入Sevag试剂，振摇，离心，收集最上层糖液，回收剩余样品，重复上述步骤直至中间层无白色蛋白质出现，用洗糖试剂洗去糖液中的色素及杂质，然后将糖液转移至透析袋透析，真空冷冻干燥滤液得到除杂后的黄水粗多糖；

步骤(3)中采用DEAE FF离子交换层析柱纯化，洗脱液为超纯水以及0.05-0.5mol/LNaCl，流速为0.5-0.6mL/min；

测定纯化后的多糖理化性质的方法包括：

将纯化后的多糖组分与不同分子量的葡聚糖标准品通过糖柱色谱柱串联凝胶柱分析，测定多糖的纯度及分子质量；

对纯化后的多糖组分进行乙酰化和/或甲基化处理，然后通过气相色谱-质谱联用仪进行组成分析；以及，利用红外光谱和核磁共振分析多糖结构；

所述糖柱色谱柱串联凝胶柱分析时的条件为：流动相为0.04-0.05mol/L NaCl，流速为0.8-1.0mL/min，柱温为40℃；利用气相色谱-质谱联用仪采用以下条件分析：RXI-5SIL MS色谱柱；起始温度100-120℃，以3℃/min升温至250℃，保持5min；进样口和检测器温度保持250℃，载气为氦气，流速为0.8-1.0mL/min。

2.如权利要求1所述的分离鉴定黄水中多糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中黄水粗多糖与Sevag试剂的体积比为1:1-5；所述洗糖试剂为甲醇、95％乙醇、无水乙醇、丙酮中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的分离鉴定黄水中多糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中采用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析，洗脱液为超纯水，流速为0.4-0.5mL/min。

4.如权利要求1所述的分离鉴定黄水中多糖的方法，其特征在于，还包括所述黄水多糖抗氧化活性的测定。

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