CN113527411A - 一种怀山药糖肽的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种怀山药糖肽的分离纯化方法，该方法以干燥怀山药为原料，粉碎，过筛，65℃水提取，离心，浓缩，喷雾干燥，分级醇沉除淀粉，冷冻干燥，将乙醇终浓度85%沉淀部分经阴离子交换树脂和凝胶色谱柱层析纯化，得到怀山药三种糖肽成分CYG‑N‑1、CYG‑N‑2和CYG‑A‑2。利用高效液相色谱，气相与红外光谱法对三种纯化怀山药糖肽进行了理化性质分析。纯度分别达到97.91%，95.91%与92.70%。本发明所述方法简单、操作方便、纯度高、制备成本低、可有效提取三种糖肽成分，易于大规模生产与推广应用等优点。本发明为今后怀山药糖肽的结构分析提供了新的途径，可为怀山药糖肽在功能性食药与药品中的应用开发提供参考。

Description

一种怀山药糖肽的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及怀山药糖肽的分离纯化方法。
背景技术
蛋白质糖基化在生物体内起着重要的作用，它不仅参与蛋白质翻译调控、蛋白质降解、免 疫保护和信号转导调控等许多生物学过程，而且对蛋白质的结构、溶解性等特性也有重要影响， 对蛋白质水解的电荷或敏感性。糖肽(Glycopeptides)包含聚糖与多肽。糖肽连键的主要类 型有两种：一，N-糖肽键，是指β-构型的N-乙酰葡糖胺异头碳与天冬酰胺的γ-酰胺N原子 共价连接而成的N-糖苷键。二，O-糖肽键，是指单糖的异头碳与羟基氨基酸的羟基O原子共 价结合而成的O-糖苷键。由于聚糖在所有生物体细胞中无所不在，并且糖肽有保持健康和防 止疾病作用，糖生物学领域出现了分子方面的研究。此外，还开发出治疗某些感染类型的糖肽 类抗生素。糖肽是通过肽合成过程生产出来的。在此过程中，聚糖绑定多肽，并与其它聚糖结 合氨基酸联系在一起，直到产生一个链。新产生的多肽随后通过糖基化绑定蛋白质和脂质。这 一酶催化过程让糖肽影响细胞之间的生化沟通。因此，这些多肽在生物体生命过程中有很重要 的生物学作用。细胞产生皮肤和有机组织，并有抵御疾病，帮助身体保持体内平衡等作用。体 液中糖蛋白和糖肽含量的变化通常反映人体的生理状态。糖生物学试图确定糖肽的分子结构， 并进一步探索这些多肽在与人体其它相关细胞和分子中的功能。通过确定糖肽结构，进一步了 解它们的机制，糖生物学领域工作者能生产出有助于促进健康和延长寿命的治疗方法。例如， 糖肽包含一种特质在癌细胞扩散前必须被分解；因此，了解糖肽结构能让科学家创造一种防止 糖肽变质和抑制癌细胞扩散的方法。因此，对体液中糖蛋白和糖肽进行定量和定性分析，对筛 选和发现临床疾病生物标志物具有重要意义。
山药为薯蓣科植物薯蓣(Dioscorea opposita Thunb.)的干燥根茎，是传统的药食同源原料， 因其有较好的药用价值和可口的风味深受世人喜爱。山药在东南亚、西非和加勒比海地区是相 当大的田间作物。山药是我国传统的药食同源类植物之一，在我国的栽培历史较久，记载于《本 草纲目》、《中药大词典》等书。分布于我国的华北、西北及长江流域各省区。以河南作为其道 地产区及主产区，炮制品规格为炒山药。江苏淮安地区是我国山药主要产区之一，所以，山药 俗称淮山药或怀山药。山药作为常用中药材，应用历史十分悠久。早在《神农本草经》中已将 其列为上品药材，认为其补中，益气力，长肌肉，久服耳目聪明，轻身，不饥，延年。传统上， 常食用山药可治疗脾虚久泻、慢性肠炎、肺虚咳喘、慢性胃炎、糖尿病等症。山药被作为主食 食用，富含多糖、氨基酸、淀粉、脂肪酸、多酚和皂苷等活性成分。山药含大量的粘液，很滑， 它是一种多糖肽质的混合物，主要成分为黏蛋白和甘露聚糖，山药块茎中积累的糖肽使山药之 所以具有这些功效，主要是因为其中所含有的糖肽等有效成分对人体有特殊的保健作用。此外， 山药粘液中的糖肽是一种天然的抗氧化剂，并该糖肽具有较高的降血糖作用。因此提取山药糖 肽，开发以其为主要成分的功能食品，对于提高人们的健康水平具有很重要的意义。
山药具有增强免疫、抑制肿瘤、降低血糖、减少血脂、抗衰老等药理作用。山药具有广阔 的应用前景和商业价值，目前，山药用于保健性食品开发已经取得了一些可喜的成果，但在山 药单一的重要的活性成分糖肽的开发利用方面还有较大的发展空间。为了适应开发需求与市场 需要，在寻求较好品质、较高产率的糖肽的基础上，研发怀山药糖肽的提取纯化方法与其应用 非常必要。该方法适用于总多糖含量高、单糖种类多，糖肽含量高但干扰因素多(如淀粉、皂 苷含量高)的提取方法。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种怀山药糖肽的分离纯化方法，该方法以干燥怀山药为原料， 机械粉碎，过筛，恒温水提取，离心，浓缩，喷雾干燥，分级醇沉除淀粉，冷冻干燥，将乙醇 终浓度85％沉淀部分用水溶解进行透析，袋内部分经离子交换树脂和葡聚糖凝胶色谱柱纯化制 备出怀山药三种糖肽成分CYG-N-1、CYG-N-2和CYG-A-2。本发明所述方法具有设计合理、工 艺简单、操作方便、纯度高、制备成本低、可有效提取三种糖肽成分，易于大规模生产与推广 应用等优点。获得的怀山药糖肽可以用于医药和食品领域。此外，本发明针对三种纯化怀山药 糖肽进行了理化性质分析，纯度分别达到97.91％，95.91％与92.70％。为今后怀山药糖肽的结 构分析提供了新的途径，可为怀山药糖肽在功能性食药与药品中的应用开发提供参考。
本发明所述的一种怀山药糖肽的分离纯化方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、预处理：将干燥怀山药粉碎，过60-100目筛，得到怀山药粉末；
b、恒温水提取：将步骤a得到的怀山药粉末以料液比1:5g/mL加入蒸馏水中，于温度为 50-70℃的恒温水搅拌提取，时间2h，搅拌速度250-300rpm，过滤上清液，取药渣加入蒸馏水 中，于温度为50-70℃的恒温水第二次搅拌提取，时间2h，搅拌速度250-300rpm，合并两次 提取液，10000rpm，离心10min，再将上清液减压浓缩，喷雾干燥，得到怀山药粗提物；
c、分级醇沉：将步骤b得到的粗提物用蒸馏水溶解，10000rpm，离心10min，取上清液 加入浓度30％的乙醇，于温度4℃静置2小时，10000rpm，离心10min，沉淀淀粉，重复三次， 再将重复三次后的沉定淀粉喷雾干燥；将重复三次的上清液合并浓缩加入浓度55％乙醇，于温 度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min，沉淀，真空冷冻干燥，得部分糖肽粗品；再将 离心得到的上清液浓缩后加入浓度85％乙醇，于温度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min， 沉淀，真空冷冻干燥得到怀山药糖肽粗品；
d、纯化：将步骤c得到的怀山药糖肽粗品用截留分子量为MW3500Da的透析袋进行透析， 时间48h，透析袋内分别采用经阴离子交换树脂和凝胶色谱柱层析纯化，分别得到三种怀山药 糖肽成分CYG-N-1、CYG-N-2和CYG-A-2。
步骤a中所怀山药粉末过60目筛，步骤b所述恒温水温度为50℃，搅拌速度为250rpm。
步骤a所述怀山药粉末过100目筛，步骤b所述恒温水温度为60-70℃，搅拌速度为250-300rpm。
本发明所述的一种怀山药糖肽的分离纯化方法，该方法通过干燥怀山药用恒温超纯水搅拌 提取；离心取上清液，将上清液减压浓缩、干燥得粗提物，将粗提物终浓度为30％、55％、80％ 乙醇分级沉淀(核心：沉淀再溶法除淀粉)，将80％乙醇沉淀部位透析，再经阴离子交换树脂 DEAE 650-M和凝胶色谱柱层析Sephadex G-75纯化，得到怀山药三种糖肽成分CYG-N-1、CYG-N-2 和CYG-A-2；利用红外、电泳与高效液相色谱(HPLC)法鉴定纯度与测定分子量；怀山药三种 糖肽分子量和纯度分别为：752.48kDa(97.91％)；4.89kDa(95.91％)；532.70kDa(92.70％)。 怀山药三种糖肽成分的糖含量与单糖组成气象色谱(GC-MS)分析显示；CYG-N-1的糖含量为 79.50％，由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖与半乳糖组成；CYG-N-2的糖含量为80.35％， 由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成；CYG-A-2的糖含量为81.20％％，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、 鼠李糖、阿拉伯糖组成；CYG-N-1、CYG-N-2与CYG-A-2的蛋白含量分别为9.87％、8.16％与9.67％； 其中CYG-N-1是主要由组氨酸、半胱氨酸与脯氨酸组成；CYG-N-2是主要由组氨酸、苏氨酸、 甘氨酸、半胱氨酸与谷氨酸组成；CYG-A-2是主要由脯氨酸、甘氨酸、苏氨酸与丙氨酸组成。
本发明所述的一种怀山药糖肽的分离纯化方法，具有设计合理、工艺简单、操作方便、纯 度高、制备成本低、可有效提取三种糖肽成分，易于大规模生产与推广应用等优点。获得的三 种怀山药糖肽可以用于医药和食品领域。为今后怀山药糖肽的结构分析提供了技术支撑。
与现有技术相比，本发明所述方法的有益效果是：
(1)本发明所述方法对干燥怀山药进行恒温水搅拌提取，醇沉，透析，柱层析纯化，提取 纯化方法具有设计合理、工艺简单、操作方便、产品提取率高、纯度高、制备成本低、易于推 广应用等优点。
(2)本发明所述方法最佳条件采用65℃恒温水中搅拌提取，条件温和，以糖肽活性为导向， 在去除干扰因素的条件下获得多种糖肽并保证其活性。
(3)与传统搅拌自溶方法相比，在活性不减的前提下可显著缩短提取时间，提高了提取分 离过程的准确性。通过粗提物用食用酒精进行分级醇沉除淀粉，上清液再次乙醇沉淀得到糖肽 粗品。
(4)本发明对糖肽粗品进行透析，以便去掉小分子物质及其他分子量范围的多糖类或低聚 糖等物质，再经阴离子交换树脂DEAE-650M与凝胶Sephadex G-75柱层析进行二次纯化，得到 了高纯度纯化三种怀山药糖肽。并且针对怀山药糖肽的理化性质进行分析。
附图说明
图1为本发明怀山药糖肽粗品DEAE-650M离子交换洗脱曲线图；
图2为本发明怀山药糖肽Sephadex G-75凝胶色谱洗脱曲线图，其中a为CYG-N-1；b为 CYG-N-2；c为CYG-A-2；
图3为本发明怀山药糖肽红外分析图，其中1为CYG-N-1；2为CYG-N-2；3为CYG-A-2；
图4为本发明怀山药糖肽的HPLC分子量测定与纯度鉴定图，其中1为CYG-N-1；2为CYG-N-2；3为CYG-A-2；
图5为本发明怀山药糖肽单糖分析GC图，其中1为CYG-N-1；2为CYG-N-2；3为CYG-A-2。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些举例性实施方式的用途和目的仅用 来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护 范围局限于此。
实施例1
a、预处理：将干燥怀山药粉碎，过60目筛，得到粒径为60目的怀山药粉末；
b、恒温水提取：将步骤a得到的怀山药粉末以料液比1:5g/mL加入蒸馏水中，于温度为 50℃的恒温水搅拌提取，时间2h，搅拌速度250rpm，过滤上清液，取药渣加入蒸馏水中，于 温度为50℃的恒温水第二次搅拌提取，时间2h，搅拌速度250rpm，合并两次提取液，10000rpm， 离心10min，再将上清液减压浓缩，喷雾干燥，得到怀山药粗提物，提取率为14.0％，糖含量 为3.03％；
c、分级醇沉：将步骤b得到的粗提物用蒸馏水溶解，10000rpm，离心10min，取上清液 加入浓度30％的乙醇，于温度4℃静置2小时，10000rpm，离心10min，沉淀淀粉，重复三次， 再将重复三次后的沉淀淀粉喷雾干燥；将重复三次的上清液合并浓缩加入浓度55％乙醇，于温 度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min，沉淀，真空冷冻干燥，得部分糖肽粗品；再将 离心得到的上清液浓缩后加入浓度85％乙醇，于温度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min， 沉淀，真空冷冻干燥得到怀山药糖肽粗品；
d、纯化：将步骤c得到的怀山药糖肽粗品用截留分子量为MW3500Da的透析袋进行透析， 时间48h，先用自来水透析24h，再用蒸馏水透析24h，透析袋内先采用DEAE650-M纤维素柱 层析，DEAE650-M柱层析：
将透析袋内部分上样于DEAE 650-M离子交换树脂色谱柱，依次以超纯水、0.1与0.3mol/L 的NaC1溶液梯度洗脱，洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰与紫外分光光度计检测 280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白相互重叠吸收峰洗脱液(NaC1溶液洗脱液透析48h) 得到三种粗纯怀山药糖肽部位(图1)；
再采用SephadexG-75凝胶柱层析进行纯化：
将DEAE650-M柱层析得到的三种粗纯怀山药糖肽部位浓缩后经Sephadex G-75凝胶色谱柱 纯化，具体方法为：以超纯水洗脱剂，用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰与紫外分光光 度计检糖肽测280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白的相互重叠吸收峰洗脱液，将糖肽流出 液减压浓缩，冷冻干燥，即分别得到三种怀山药糖肽成分CYG-N-1、CYG-N-2和CYG-A-2(图2)。
实施例2
a、预处理：将干燥怀山药粉碎，过100目筛，得到粒径为100目怀山药粉末；
b、恒温水提取：将步骤a得到的怀山药粉末以料液比1:5g/mL加入蒸馏水中，于温度为 60℃的恒温水搅拌提取，时间2h，搅拌速度250rpm，过滤上清液，取药渣加入蒸馏水中，于 温度为60℃的恒温水第二次搅拌提取，时间2h，搅拌速度250rpm，合并两次提取液，10000rpm， 离心10min，再将上清液减压浓缩，喷雾干燥，得到怀山药粗提物，提取率为13.8％，糖含量 为2.7％；
c、分级醇沉：将步骤b得到的粗提物用蒸馏水溶解，10000rpm，离心10min，取上清液 加入浓度30％的乙醇，于温度4℃静置2小时，10000rpm，离心10min，沉淀淀粉，重复三次， 再将重复三次后的沉定淀粉喷雾干燥；将重复三次的上清液合并浓缩加入浓度55％乙醇，于温 度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min，沉淀，真空冷冻干燥，得部分糖肽粗品；再将 离心得到的上清液浓缩后加入浓度85％乙醇，于温度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min， 沉淀，真空冷冻干燥得到怀山药糖肽粗品；
d、纯化：将步骤c得到的怀山药糖肽粗品用截留分子量为MW3500Da的透析袋进行透析， 时间48h，先用自来水透析24h，再用蒸馏水透析24h，透析袋内先采用DEAE650-M纤维素柱 层析，DEAE650-M柱层析：
将透析袋内部分上样于DEAE 650-M离子交换树脂色谱柱，依次以超纯水、0.1与0.3mol/L 的NaC1溶液梯度洗脱，洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰与紫外分光光度计检测 280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白相互重叠吸收峰洗脱液(NaC1溶液洗脱液透析48h) 得到三种粗纯怀山药糖肽部位(图1)；
再采用SephadexG-75凝胶柱层析进行纯化：
将DEAE650-M柱层析得到的三种粗纯怀山药糖肽部位浓缩后经Sephadex G-75凝胶色谱柱 纯化，具体方法为：以超纯水洗脱剂，用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰与紫外分光光 度计检糖肽测280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白的相互重叠吸收峰洗脱液，将糖肽流出 液减压浓缩，冷冻干燥，分别得到三种怀山药糖肽成分CYG-N-1、CYG-N-2和CYG-A-2。
实施例3
a、预处理：将干燥怀山药粉碎，过100目筛，得到粒径为100目怀山药粉末；
b、恒温水提取：将步骤a得到的怀山药粉末以料液比1:5g/mL加入蒸馏水中，于温度为 65℃的恒温水搅拌提取，时间2h，搅拌速度250rpm，过滤上清液，取药渣加入蒸馏水中，于 温度为65℃的恒温水第二次搅拌提取，时间2h，搅拌速度250rpm，合并两次提取液，10000rpm， 离心10min，再将上清液减压浓缩，喷雾干燥，得到怀山药粗提物，提取率为9.2％，糖含量为 1.9％；
c、分级醇沉：将步骤b得到的粗提物用蒸馏水溶解，10000rpm，离心10min，取上清液 加入浓度30％的乙醇，于温度4℃静置2小时，10000rpm，离心10min，沉淀淀粉，重复三次， 再将重复三次后的沉定淀粉喷雾干燥；将重复三次的上清液合并浓缩加入浓度55％乙醇，于温 度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min，沉淀，真空冷冻干燥，得部分糖肽粗品；再将 离心得到的上清液浓缩后加入浓度85％乙醇，于温度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min， 沉淀，真空冷冻干燥得到怀山药糖肽粗品；
d、纯化：将步骤c得到的怀山药糖肽粗品用截留分子量为MW3500Da的透析袋进行透析， 时间48h，先用自来水透析24h，再用蒸馏水透析24h，透析袋内先采用DEAE650-M纤维素柱 层析，DEAE650-M柱层析：
将透析袋内部分上样于DEAE 650-M离子交换树脂色谱柱，依次以超纯水、0.1与0.3mol/L 的NaC1溶液梯度洗脱，洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰与紫外分光光度计检测 280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白相互重叠吸收峰洗脱液(NaC1溶液洗脱液透析48h) 得到三种粗纯怀山药糖肽部位(图1)；
再采用SephadexG-75凝胶柱层析进行纯化：
将DEAE650-M柱层析得到的三种粗纯怀山药糖肽部位浓缩后经Sephadex G-75凝胶色谱柱 纯化，具体方法为：以超纯水洗脱剂，用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰与紫外分光光 度计检糖肽测280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白的相互重叠吸收峰洗脱液，将糖肽流出 液减压浓缩，冷冻干燥，分别得到三种怀山药糖肽成分CYG-N-1、CYG-N-2和CYG-A-2。
实施例4
a、预处理：将干燥怀山药粉碎，过100目筛，得到怀山药粉末；
b、恒温水提取：将步骤a得到的怀山药粉末以料液比1:5g/mL加入蒸馏水中，于温度为 65℃的恒温水搅拌提取，时间2h，搅拌速度300rpm，过滤上清液，取药渣加入蒸馏水中，于 温度为65℃的恒温水第二次搅拌提取，时间2h，搅拌速度300rpm，合并两次提取液，10000rpm， 离心10min，再将上清液减压浓缩，喷雾干燥，得到怀山药粗提物，提取率为12.6％，糖含量 为3.6％；
c、分级醇沉：将步骤b得到的粗提物用蒸馏水溶解，10000rpm，离心10min，取上清液 加入浓度30％的乙醇，于温度4℃静置2小时，10000rpm，离心10min，沉淀淀粉，重复三次， 再将重复三次后的沉淀淀粉喷雾干燥；将重复三次的上清液合并浓缩加入浓度55％乙醇，于温 度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min，沉淀，真空冷冻干燥，得部分糖肽粗品；再将 离心得到的上清液浓缩后加入浓度85％乙醇，于温度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min， 沉淀，真空冷冻干燥得到怀山药糖肽粗品；
d、纯化：将步骤c得到的怀山药糖肽粗品用截留分子量为MW3500Da的透析袋进行透析， 时间48h，先用自来水透析24h，再用蒸馏水透析24h，透析袋内先采用DEAE650-M纤维素柱 层析，DEAE650-M柱层析：
将透析袋内部分上样于DEAE 650-M离子交换树脂色谱柱，依次以超纯水、0.1与0.3mol/L 的NaC1溶液梯度洗脱，洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰与紫外分光光度计检测 280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白相互重叠吸收峰洗脱液(NaC1溶液洗脱液透析48h) 得到三种粗纯怀山药糖肽部位(图1)；
再采用SephadexG-75凝胶柱层析进行纯化：
将DEAE650-M柱层析得到的三种粗纯怀山药糖肽部位浓缩后经Sephadex G-75凝胶色谱柱 纯化，具体方法为：以超纯水洗脱剂，用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰与紫外分光光 度计检糖肽测280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白的相互重叠吸收峰洗脱液，将糖肽流出 液减压浓缩，冷冻干燥，分别得到三种怀山药糖肽成分CYG-N-1、CYG-N-2和CYG-A-2。
实施例5
a、预处理：将干燥怀山药粉碎，过100目筛，得到怀山药粉末；
b、恒温水提取：将步骤a得到的怀山药粉末以料液比1:5g/mL加入蒸馏水中，于温度为 70℃的恒温水搅拌提取，时间2h，搅拌速度300rpm，过滤上清液，取药渣加入蒸馏水中，于 温度为70℃的恒温水第二次搅拌提取，时间2h，搅拌速度300rpm，合并两次提取液，10000rpm， 离心10min，再将上清液减压浓缩，喷雾干燥，得到怀山药粗提物，提取率为9.3％，糖含量为 3.4％；
c、分级醇沉：将步骤b得到的粗提物用蒸馏水溶解，10000rpm，离心10min，取上清液 加入浓度30％的乙醇，于温度4℃静置2小时，10000rpm，离心10min，沉淀淀粉，重复三次， 再将重复三次后的沉定淀粉喷雾干燥；将重复三次的上清液合并浓缩加入浓度55％乙醇，于温 度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min，沉淀，真空冷冻干燥，得部分糖肽粗品；再将 离心得到的上清液浓缩后加入浓度85％乙醇，于温度4℃静置24小时，10000rpm，离心10min， 沉淀，真空冷冻干燥得到怀山药糖肽粗品；
d、纯化：将步骤c得到的怀山药糖肽粗品用截留分子量为MW3500Da的透析袋进行透析， 时间48h，先用自来水透析24h，再用蒸馏水透析24h，透析袋内先采用DEAE650-M纤维素柱 层析，DEAE650-M柱层析：
将透析袋内部分上样于DEAE 650-M离子交换树脂色谱柱，依次以超纯水、0.1与0.3mol/L 的NaC1溶液梯度洗脱，洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰与紫外分光光度计检测 280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白相互重叠吸收峰洗脱液(NaC1溶液洗脱液透析48h) 得到三种粗纯怀山药糖肽部位(图1)；
再采用SephadexG-75凝胶柱层析进行纯化：
将DEAE650-M柱层析得到的三种粗纯怀山药糖肽部位浓缩后经Sephadex G-75凝胶色谱柱 纯化，具体方法为：以超纯水洗脱剂，用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰与紫外分光光 度计检糖肽测280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白的相互重叠吸收峰洗脱液，将糖肽流出 液减压浓缩，冷冻干燥，分别得到三种怀山药糖肽成分CYG-N-1、CYG-N-2和CYG-A-2。
实施例6
山药糖肽FT-IR分析：
将实施例1-5得到的任意三种山药糖肽均在4000-500CM-1之间出现了糖类与肽类化合物的 特征吸收峰，如图3所示，其在3400CM-1处有一个明显的宽峰，是O-H键和N-H键的叠加伸缩 振动，表明存在分子间或分子内氢键，这是多糖和蛋白质分子的特征吸收峰。2900CM-1附近的 2922、2928与2924CM-1等较弱弯曲是C-H振动。1734CM-1和1739CM-1处的羧基伸缩振动表 明可能存在糖醛酸。在1610-1670CM-1波长范围内的1653CM-1、1638CM-1和1607CM-1处的吸 收是N-H的变形振动，表明样品中存在蛋白质。1459CM-1、1413CM-1和1380CM-1处的吸收条带 为C-N伸缩振动。1250CM-1、1245CM-1和1117CM-1处的吸收峰是C＝O基团的伸缩振动和C-N 伸缩振动。在618CM-1附近的吸收归属于酰胺基的N-H弯曲振动；
HPLC鉴定纯度与测定分子量：
将Sigma色谱纯5KDa、25KDa、50KDa、80KDa、150KDa、410KDa葡聚糖与蓝色葡聚 糖用超纯水溶液配至浓度2mg/mL多糖分子量标样，经0.45μm滤膜过滤后进样，采用蓝色葡 聚糖保留时间V0标定孔体积，以分子量的对数(1gMw)为横坐标，保留时间为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线回归方程为y＝-4.2574xx+10.494,R2＝0.9904；同时将怀山药三种纯化糖肽进样 (图5)，根据保留时间计算相对分子质量，色谱条件：TSK-G3000 PWXL(7.8×300mm)，流动 相为超纯水，流速0.6mL/min，柱温箱温度25℃，检测器为示差检测器；从HPLC分析可知， 本发明提取的怀山药三种糖肽，根据保留时间计算相对分子量，怀山药三种糖肽分子量和纯度 分别为：CYG-N-1：752.48kDa、97.91％；CYG-N-2：4.89kDa、95.91％；CYG-A-2：532.70kDa、 92.70％(表.1)；
表1山药多糖分子量
Figure BDA0003178570980000081
总糖含量测定：
采用苯酚-硫酸法测定总糖含量：精确称量葡萄糖标准品10mg，加蒸馏水溶解，定容至50mL， 标准品终浓度为0.2mg/mL，分别精确吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL于不同试管中； 加蒸馏水，使每管体积达到2mL；分别精确吸取50uL于96孔板中，被测试每孔中迅速加入 浓硫酸150uL，逐管加入5％苯酚30uL，摇匀后室温静置20min，室温放置10min，用酶标仪 在490nm处测定吸光度；吸光度作为横坐标，标准溶液质量浓度作为纵坐标，蒸馏水作为空 白对照，制作标准曲线；样品测定：配制浓度为200μg/mL的淮山药纯化糖肽样品溶液，同上 述标准曲线操作方法测定吸光度，计算总糖含量，计算得出CYG-N-1的糖含量为79.50％； CYG-N-2的糖含量为80.35％与CYG-A-2的糖含量为81.20％；
蛋白质含量测定：
采用BCA法：准确量取2mg/mL的标准牛血清蛋白溶液，配置25-2000μg/mL的标准溶液；根据BCA蛋白测量试剂盒说明书操作配制工作液，BCA试剂分为试剂A和试剂B，每50 倍体积的试剂A加1倍体积的试剂B，充分摇匀备用；量取25uL不同浓度的标准液于96孔 板中，分别加入175uL BCA工作液，轻微振荡，充分混匀，于温度37℃恒温箱中恒温30min， 用酶标仪于562nm处测定溶液吸光度；将标准品吸光度作为横坐标，牛血清蛋白质量浓度作 为纵坐标，绘制标准曲线；准确称取2.0mg三种淮山药纯化糖肽样品，加入2mL蒸馏水溶 解，取25μL样品溶液于96孔板中，同上述标准曲线操作方法测定样品溶液吸光度值，通过 计算可知CYG-N-1的蛋白含量为9.87％，CYG-N-2的蛋白含量为8.16％，CYG-A-2的蛋白含量为9.67％；
单糖组成分析：
水解：取纯化怀山药糖肽样品5mg于顶空瓶中加入2mol/L三氟乙酸4mL，密封后在温度 110℃恒温水解6h，加适量甲醇减压蒸干，重复三次；乙酰化衍生物：向水解产物中加入8mg 羟基乙酸，1mL吡啶与1mL乙酸酐，温度90℃加热1h，冷却后N2吹干，此乙酰化的单糖醇用 三氯甲烷稀释后进行气相色谱-质谱GS分析。经GC分析(表.2)可知，CYG-N-1与CYG-A-2由 鼠李糖、阿拉伯糖、甘罗糖、葡萄糖与半乳糖组成。CYG-N-2由甘罗糖、葡萄糖与半乳糖组成。 CYG-A-2包含少量木糖；
表2怀山药三种糖肽单糖组成(摩尔比％)
Figure BDA0003178570980000091
氨基酸分析：
测定方法：称取5mg各纯化怀山药糖肽于水解管中，然后加入3mL浓度为6mol/L的盐酸 溶液,充入氮气2min，抽真空封管，置于烤箱内110℃水解24h，水解完成后的水解液用旋转 蒸发仪减压蒸干使盐酸充分蒸干，从而脱去水解液中的酸，用甲醇洗涤3次，继续蒸干剩余盐 酸，然后用蒸馏水定容至1mL完成衍生化后用0.45um微孔滤膜过滤，滤液用氨基酸分析仪进 行氨基酸含量测定分析，测定结果如表3所示：
表3氨基酸分析结果
Figure BDA0003178570980000092
Figure BDA0003178570980000101
由表3可以看出，本发明提取、分离纯化的三种怀山药糖肽中的肽链包含17种氨基酸； 其中CYG-N-1的主要氨基酸为组氨酸(47.75％)、半胱氨酸(13.68％)与脯氨酸(1.76％)；CYG-N-2 的主要氨基酸为组氨酸(9.79％)、苏氨酸(6.68％)甘氨酸(6.31％)、半胱氨酸(4.96％)与谷 氨酸(3.82％)；CYG-A-2的主要氨基酸为脯氨酸(12.25％)、甘氨酸(7.41％)、苏氨酸(2.49％) 与丙氨酸(2.38％)。
上述实施例为本发明的实施方式，但并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明 的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含 在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种怀山药糖肽的分离纯化方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、预处理：将干燥怀山药粉碎，过60-100目筛，得到怀山药粉末；
b、恒温水提取：将步骤a得到的怀山药粉末以料液比1:5g/mL加入蒸馏水中，于温度为50-70℃的恒温水搅拌提取，时间2h，搅拌速度250-300rpm，过滤上清液，取药渣加入蒸馏水中，于温度为50-70℃的恒温水第二次搅拌提取，时间2h，搅拌速度250-300rpm，合并两次提取液，10000 rpm，离心10min，再将上清液减压浓缩，喷雾干燥，得到怀山药粗提物；
c、分级醇沉：将步骤b得到的粗提物用蒸馏水溶解，10000 rpm，离心10min，取上清液加入浓度30%的乙醇，于温度4℃静置2小时，10000 rpm，离心10min，沉淀淀粉，重复三次，再将重复三次后的沉定淀粉喷雾干燥；将重复三次的上清液合并浓缩加入浓度55%乙醇，于温度4℃静置24小时，10000 rpm，离心10min，沉淀，真空冷冻干燥，得部分糖肽粗品；再将离心得到的上清液浓缩后加入浓度85%乙醇，于温度4℃静置24小时，10000 rpm，离心10min，沉淀，真空冷冻干燥得到怀山药糖肽粗品；
d、纯化：将步骤c得到的怀山药糖肽粗品用截留分子量为MW3500Da的透析袋进行透析，时间48h，透析袋内分别采用经阴离子交换树脂和凝胶色谱柱层析纯化，分别得到三种怀山药糖肽成分CYG-N-1、CYG-N-2和CYG-A-2。
2.根据权利要求1所述的怀山药糖肽的提取纯化方法,其特征在于步骤a中所怀山药粉末过60目筛，步骤b所述恒温水温度为50℃，搅拌速度为250rpm。
3.根据权利要求1所述的怀山药糖肽的提取纯化方法,其特征在于步骤a所述怀山药粉末过100目筛，步骤b所述恒温水温度为60-70℃，搅拌速度为250-300rpm。
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