CN109081864A - 一种山药糖蛋白的提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种山药糖蛋白的提取纯化方法，首先称取干燥山药粉加入三蒸水中，在恒温热水中浸提；浸提结束后离心取上清液，将上清液进行减压浓缩；减压浓缩后加入无水乙醇析出沉淀，将沉淀物干燥得到糖蛋白粗提物；对糖蛋白粗提物进行两次柱层析纯化除杂，得到纯化糖蛋白。本发明提取方法更简单实用，生产工艺更趋合理，使产品质量有了进一步保障，为山药糖蛋白的进一步研究提供一定的参考，更好地满足医疗需要。
Description
技术领域
本发明属于药品及其制备工艺领域，具体涉及一种山药糖蛋白的提取纯化方法。
背景技术
糖蛋白由于其天然、低毒的特性越来越受到科研工作者的关注，到目前为止，共有300多种多糖复合物从天然产物中分离出来，其中植物来源的糖蛋白，尤其是药用植物来源的糖蛋白最为重要，已发现的100多种药用植物来源糖蛋白具有增强免疫力的作用。
山药(Dioscorea opposita Thunb)为薯蓣属(Dioscorea)薯蓣科(Dioscoreaceae)的多年生草本植物的地下块茎，分布于我国的华北、西北及长江流域各省区。它是我国一种传统的药食同源类植物，具有增强免疫力、降低血糖、益肺止咳、健脾益胃、滋肾益精的作用。山药营养丰富，除含有多糖、脂肪、蛋白质、维生素、微量元素，人体必需氨基酸外，还含有粘液质。糖蛋白是存在于粘液质中的由糖类与蛋白质或多肽通过共价键结合而成的一类蛋白质，具有增强免疫力、抗氧化、降血糖等的生理活性。目前，对于山药成分的研究主要集中在小分子量的物质如皂甙、黄酮、尿囊素等，大分子量的物质如多糖，淀粉。而对于山药糖蛋白的研究相对较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种山药糖蛋白的提取纯化方法，以克服现有技术存在的问题，本发明提取方法更科学化，得到了纯度较高的山药糖蛋白，生产工艺更简单及合理，使产品质量有了进一步保障，为山药糖蛋白的进一步研究提供合格的原料药，更好地满足医疗需要。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种山药糖蛋白的提取纯化方法，包括以下步骤：
步骤一：称取干燥山药粉加入三蒸水中，在恒温热水中浸提；
步骤二：浸提结束后离心取上清液，将上清液进行减压浓缩；
步骤三：减压浓缩后加入无水乙醇进行沉淀，将沉淀物干燥得到糖蛋白粗提物；
步骤四：对糖蛋白粗提物进行纯化除杂、干燥，得到纯化山药糖蛋白，其中纯化除杂包括一次提纯和二次提纯，所述一次提纯是将山药糖蛋白粗提物经过DEAE-52纤维素柱层析方法得到粗提纯山药糖蛋白，二次提纯是将粗提纯糖蛋白采用Sephadex G-75柱层析方法得到纯化山药糖蛋白。
进一步地，步骤一中称取干燥山药粉加入三蒸水中，使料液比为1g：(10-20)mL，然后在40-60℃的恒温热水中浸提2～4h。
进一步地，步骤二中离心速率为3000r/min，离心时间为15min。
进一步地，步骤二中减压浓缩的压力为-0.06～-0.08MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.20-1.25。
进一步地，步骤三中加入无水乙醇使乙醇体积浓度为65％～70％。
进一步地，步骤三中干燥温度为40℃～50℃，干燥时间为5～6h。
进一步地，，所述DEAE-52纤维素柱层析方法具体为：将山药糖蛋白粗提物用三蒸水溶解至浓度为10mg/mL后上样，依次经过三蒸水和0.05mol/L的NaCl溶液洗脱后，用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰，用紫外分光光度计检测280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白的吸收峰相互重叠部分洗脱液，将相互重叠部分洗脱液减压浓缩，压力为-0.06～-0.08MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.10-1.15，然后加入无水乙醇进行沉淀，使溶液中乙醇体积浓度为65％～70％，沉淀24h，过滤，将沉淀物在40℃～50℃温度下干燥5～6h，得粗提纯山药糖蛋白。
进一步地，所述Sephadex G-75柱层析方法具体为：将粗提纯糖蛋白用三蒸水溶解至浓度为5mg/mL后上样，用三蒸水作为洗脱剂，用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰，用紫外分光光度仪检测280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白质的吸收峰相互重叠部分洗脱液，将相互重叠部分洗脱液减压浓缩，压力为-0.06～-0.08MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.10-1.15，然后加入无水乙醇进行沉淀，使溶液中乙醇体积浓度为65％～70％，沉淀24h，过滤，将沉淀物在40℃～50℃温度下干燥5～6h，得到纯化山药糖蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明可以得到一种纯度较高的山药糖蛋白，按照蛋白质的提取纯化的规律，首先采用纤维素DEAE-52离子交换柱柱层析对山药糖蛋白进行了纯化，得到了糖和蛋白质的重叠峰，表明该部分化合物，既含有糖又含有蛋白质，即为山药糖蛋白粗品。另外，现有技术中对于植物糖蛋白的提取过程中都进行了透析操作，为了去掉小分子物质及其他分子量范围的多糖类等物质，在本发明中并未进行透析同样得到了所需的物质，主要是经过柱层析后小分子的物质、电荷不同的物质已经被分离开来，省去此步骤对于山药糖蛋白的大规模生产节约了时间，提高了效率，生产工艺更趋合理，使产品质量有了进一步保障，为山药糖蛋白的进一步研究提供一定的参考，更好地满足医疗保健需要。
附图说明
图1山药糖蛋白在DEAE-52层析住上的洗脱曲线图；
图2山药糖蛋白的SephadexG-75凝胶柱层析洗脱曲线图；
图3糖蛋白DOT1的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中，A.考马斯亮蓝G-250染色；B.Schiff试剂染色；
图4分子量测定标准曲线图；
图5葡萄糖的标准曲线图；
图6牛血清白蛋白的标准曲线图；
图7山药糖蛋白水解液的薄层层析图，其中从左到右依次为：D-葡萄糖，L-半乳糖，D-甘露糖，样品的水解液，D-木糖。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细描述：
一、山药糖蛋白的提取工艺
第一步：称取一定量的干燥山药粉于适量三蒸水中，在恒温热水中浸提数小时；
第二步：离心(3000r/min,15min)取上清液，将上清液进行减压浓缩；
第三步：加入无水乙醇进行沉淀；将沉淀物低温干燥得糖蛋白粗提物。
1、正交实验优化山药糖蛋白的提取工艺
在前期实验的基础上，对影响山药糖蛋白的主要因素提取温度、料液比、提取时间进行三因素三水平的正交优化。正交实验设计如表1。
表1正交实验因素水平表
2、实验设计及结果
将提取温度、料液比、提取时间进行三因素三水平的正交实验，实验设计及结果如表2。
表2正交实验结果
表3方差分析结果
其中试验号1、试验号4和试验号7中第二步中减压压力为-0.06MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.20；第三步中加入的无水乙醇使乙醇浓度为65％，干燥温度为40℃，干燥时间为6h；
试验号2、试验号5和试验号8中第二步中减压压力为-0.08MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.25；第三步中加入的无水乙醇使乙醇浓度为70％，干燥温度为50℃，干燥时间为5h；
试验号3、试验号6和试验号9中第二步中减压压力为-0.07MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.23；第三步中加入的无水乙醇使乙醇浓度为68％，干燥温度为45℃，干燥时间为5.5h；
方差分析结果见表3。由表2可以看出，影响因素由大到小，依次为提取温度，料液比，提取时间。由表3的方差分析可知，三个因素对山药糖蛋白的提取没有显著性影响。因此，山药糖蛋白提取的优化条件是提取温度60℃，料液比为1：20，提取时间为3h。
二、山药糖蛋白的纯化
1、DEAE-52柱层析
如图1所示，山药糖蛋白粗提物经过DEAE-52纤维素柱层析的方法将山药糖蛋白粗提物溶解至10mg/ml后上样，经过蒸馏水和0.05mol/L的NaCl溶液洗脱后，用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰，用紫外分光光度计检测280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白收集糖和蛋白的吸收峰相互重叠部分洗脱液，减压浓缩、沉淀、干燥，得到粗提纯山药糖蛋白。
其中试验号1、试验号4和试验号7中第二步中减压压力为-0.06MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.10；第三步中加入的无水乙醇使乙醇浓度为65％，干燥温度为40℃，干燥时间为6h；
试验号2、试验号5和试验号8中第二步中减压压力为-0.08MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.15；第三步中加入的无水乙醇使乙醇浓度为70％，干燥温度为50℃，干燥时间为5h；
试验号3、试验号6和试验号9中第二步中减压压力为-0.07MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.13；第三步中加入的无水乙醇使乙醇浓度为68％，干燥温度为45℃，干燥时间为5.5h；
2、Sephadex G-75柱层析
如图2所示，将上述经DEAE-52柱层析得到的粗提纯山药糖蛋白进行Sephadex G-75柱层析的进一步纯化，将粗提纯糖蛋白用三蒸水溶解至浓度5mg/ml后上样，用三蒸水作为洗脱剂，用苯酚-硫酸法和紫外分光光度仪检测490nm处糖的吸收峰及280nm处蛋白质的吸收峰。收集糖和蛋白质的重叠峰处的吸收峰相互重叠部分洗脱液，减压浓缩、沉淀、干燥，得到纯化山药糖蛋白。
其中试验号1、试验号4和试验号7中第二步中减压压力为-0.06MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.10；第三步中加入的无水乙醇使乙醇浓度为65％，干燥温度为40℃，干燥时间为6h；
试验号2、试验号5和试验号8中第二步中减压压力为-0.08MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.15；第三步中加入的无水乙醇使乙醇浓度为70％，干燥温度为50℃，干燥时间为5h；
试验号3、试验号6和试验号9中第二步中减压压力为-0.07MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.13；第三步中加入的无水乙醇使乙醇浓度为68％，干燥温度为45℃，干燥时间为5.5h；
三、山药糖蛋白的纯度鉴定
针对试验号9得到的山药糖蛋白进行鉴定
1、SDS-PAGE电泳鉴定
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对所得山药糖蛋白进行纯度的鉴定及分子量的测定，12％的聚丙烯酰胺分离胶，4％的聚丙烯酰胺浓缩胶，用考马斯亮蓝R-250和PAS试剂分别对山药糖蛋白染色。
如图3所示，山药糖蛋白经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，分别对其进行考马斯亮蓝R-250染色和PAS法染色，泳道1为Maker(分子量由大到小依次为170kDa，130kDa，100kDa，70kDa，55kDa，40kDa，35kDa，25kDa，15kDa)，泳道2和3为山药糖蛋白的考马斯亮蓝G-250和Schiff试剂染色。实验结果发现条带2和3均在相同的位置出现了一个斑点，说明此物质为山药糖蛋白且纯度达到了电泳纯。如图4所示，标准蛋白由大到小相对迁移率分别为0.1346，0.1826，0.2596，0.3465，0.4375，0.5399，0.6431，0.7485，0.9135。以标准蛋白质的相对迁移率Rm为横坐标，标准蛋白质分子量的对数lgMr为纵坐标，进行线性回归，得回归方程y＝-1.273x+2.330，R2＝0.9910，由此计算出山药糖蛋白DOT1的分子量为30kDa。
3、山药糖蛋白中糖和蛋白质含量的测定
糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，用葡萄糖作为标准品。蛋白质的测定采用紫外分光光度法，以牛血清白蛋白为标准品，牛血清白蛋白质量分数采用微量凯氏定氮法测定。
如图5所示，以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标作出葡萄糖的标准曲线。标准曲线的线性回归方程为y＝53.12x+3.832，相关系数R2＝0.9978，其中y为待测样品的蛋白质浓度(μg/mL)，x为待测样品显色后的吸光度值。根据标准曲线，通过计算可知糖蛋白中糖的含量为35％。
如图6所示，以蛋白质的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制牛血清白蛋白的标准曲线，标准曲线的线性回归方程为y＝0.003x+0.139，相关系数R2＝0.9910，其中x为待测样品的蛋白质浓度(μg/mL)，y为待测样品显色后的吸光度值。通过计算可知糖蛋白中蛋白质的含量为65％。
4、山药糖蛋白定性实验结果
山药糖蛋白为白色物质，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机试剂。山药糖蛋白溶液与I2-KI、硫酸－咔唑、斐林试剂、FeCl3反应均为阴性，与茚三酮、CTAB反应均为阳性，表明其为非淀粉类糖蛋白类物质，且不含糖醛酸、游离单糖及多酚类物质。
5、山药糖蛋白的单糖组成分析
薄层层析方法测定糖蛋白中单糖的种类时，当用蒸馏水溶解样品和标准单糖时，显色后会出现严重的空心效应，造成这种现象的出现主要是因为糖蛋白在蒸馏水中的溶解度过大，所以本实验选择极性小一些的乙醇溶液来溶解样品和标准品。
由图7所示，经苯胺-邻苯二甲酸喷雾显色后可知，山药糖蛋白样品的糖链中主要含有D-葡萄糖，L-半乳糖和D-甘露糖这三种单糖。
4)氨基酸的组成分析
山药糖蛋白DOT1的盐酸水解液经氨基酸自动分析仪(Hitachi L-8900)测定结果如表4所示，山药糖蛋白DOT1的多肽链中含有17种氨基酸，其中含有丰富的酸性氨基酸如天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)，表明山药糖蛋白DOT1为酸性糖蛋白。它既含有必需氨基酸也含有非必需氨基酸，证明其有较高的营养价值。
表4山药糖蛋白的氨基酸组成
整体来看，本发明最佳的提取条件为提取温度60℃，提取时间为3h，料液比(g/v)为1：20。山药糖蛋白提取物纯化时采用纤维素DEAE-52柱层析和Sephadex G-75凝胶柱层析纯化，最后得到山药糖蛋白。对山药糖蛋白进行了纯度鉴定及理化性质的分析，结果表明山药糖蛋白为均一组分且分子量为30kDa的非淀粉类糖蛋白类物质，由多糖(35％)和蛋白质(65％)组成，多糖主要由D-葡萄糖、L-半乳糖、D-甘露糖组成，蛋白质主要由17种氨基酸组成，包括必需氨基酸和非必需氨基酸。
Claims (8)
1.一种山药糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：称取干燥山药粉加入三蒸水中，在恒温热水中浸提；
步骤二：浸提结束后离心取上清液，将上清液进行减压浓缩；
步骤三：减压浓缩后加入无水乙醇进行沉淀，将沉淀物干燥得到糖蛋白粗提物；
步骤四：对糖蛋白粗提物进行纯化除杂、干燥，得到纯化山药糖蛋白，其中纯化除杂包括一次提纯和二次提纯，所述一次提纯是将山药糖蛋白粗提物经过DEAE-52纤维素柱层析方法得到粗提纯山药糖蛋白，二次提纯是将粗提纯糖蛋白采用Sephadex G-75柱层析方法得到纯化山药糖蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种山药糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于，步骤一中称取干燥山药粉加入三蒸水中，使料液比为1g：(10-20)mL，然后在40-60℃的恒温热水中浸提2～4h。
3.根据权利要求1所述的一种山药糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于，步骤二中离心速率为3000r/min，离心时间为15min。
4.根据权利要求1所述的一种山药糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于，步骤二中减压浓缩的压力为-0.06～-0.08MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.20-1.25。
5.根据权利要求1所述的一种山药糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于，步骤三中加入无水乙醇使乙醇体积浓度为65％～70％。
6.根据权利要求1所述的一种山药糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于，步骤三中干燥温度为40℃～50℃，干燥时间为5～6h。
7.根据权利要求1所述的一种山药糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于，所述DEAE-52纤维素柱层析方法具体为：将山药糖蛋白粗提物用三蒸水溶解至浓度为10mg/mL后上样，依次经过三蒸水和0.05mol/L的NaCl溶液洗脱后，用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰，用紫外分光光度计检测280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白的吸收峰相互重叠部分洗脱液，将相互重叠部分洗脱液减压浓缩，压力为-0.06～-0.08MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.10-1.15，然后加入无水乙醇进行沉淀，使溶液中乙醇体积浓度为65％～70％，沉淀24h，过滤，将沉淀物在40℃～50℃温度下干燥5～6h，得粗提纯山药糖蛋白。
8.根据权利要求1所述的一种山药糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于，所述SephadexG-75柱层析方法具体为：将粗提纯糖蛋白用三蒸水溶解至浓度为5mg/mL后上样，用三蒸水作为洗脱剂，用苯酚-硫酸法检测490nm处糖的吸收峰，用紫外分光光度仪检测280nm处蛋白质的吸收峰，收集糖和蛋白质的吸收峰相互重叠部分洗脱液，将相互重叠部分洗脱液减压浓缩，压力为-0.06～-0.08MPa，在60℃下浓缩至相对密度1.10-1.15，然后加入无水乙醇进行沉淀，使溶液中乙醇体积浓度为65％～70％，沉淀24h，过滤，将沉淀物在40℃～50℃温度下干燥5～6h，得到纯化山药糖蛋白。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181225 |
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