CN117903273A

CN117903273A - 山药蛋白dp1及其分离纯化方法和应用

Info

Publication number: CN117903273A
Application number: CN202410310459.5A
Authority: CN
Inventors: 赵大庆; 王思明; 刘美辰; 王兴林; 李肇联; 于士婷; 潘黛安
Original assignee: Guangdong Xiandai Hanfang Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Xiandai Hanfang Technology Co ltd
Priority date: 2024-03-19
Filing date: 2024-03-19
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2044-03-19
Also published as: CN117903273B

Abstract

本发明公开山药蛋白DP1及其分离纯化方法和应用。该分离纯化方法包括：(1)以合适的料液比使用Tris‑HCl缓冲液对山药进行浸提以获得山药总蛋白；(2)使用缓冲液配制山药总蛋白溶液，并调节至合适的pH值；(3)采用柱层析对溶液分别进行蛋白的分离和脱盐处理，得到山药蛋白DP1。本发明的山药蛋白DP1的分离纯化方法工艺简单，操作简便。此外，由本发明分离纯化得到的山药蛋白DP1能够促进或提高生殖功能，预防或治疗勃起功能障碍，恢复氧化损伤海绵体内皮细胞的活力，促进海绵体内皮细胞与海绵体平滑肌细胞交互作用，提升海绵体组织中NO/cGMP的水平。

Description

山药蛋白DP1及其分离纯化方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及山药蛋白DP1及其分离纯化方法和应用。

背景技术

山药为薯蓣科薯蓣属的地下块茎，它既是一味重要中药，又是一种常见蔬菜，因其卓越的药用保健功效和糯香可口的风味品质而深得世人的喜爱。山药成分较复杂且含量相对较低，主要活性成分包括糖类、蛋白质、氨基酸类和有机酸类等。山药中蛋白质含量为山药干重的1%-3%左右。现有的山药蛋白提取工艺复杂，步骤繁琐，因此，目前仍需要开发一种工艺简单，操作简便的山药蛋白分离纯化方法。

同时，现有研究表明山药蛋白对勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)具有一定的作用，但仍需要对其进行进一步的分子机理研究，从而揭示山药蛋白对男性生殖系统的作用和机制。通过对山药蛋白的深入研究，可以更好地理解其改善勃起功能障碍的机制，为开发新的治疗勃起功能障碍的药物或健康产品提供理论依据。此外，通过对山药总蛋白中某些蛋白的分析还可以更准确地了解其作用机制和效果，从而为开发更有效的治疗勃起功能障碍的药物或健康产品提供支持。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分问题，本发明提供山药蛋白DP1及其分离纯化方法和应用。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种山药蛋白DP1的分离纯化方法，其包括：

(1) 以合适的料液比使用Tris-HCl缓冲液对山药进行浸提，获得山药总蛋白；

(2) 使用所述缓冲液配制山药总蛋白溶液，并调节至合适的pH值；

(3) 采用柱层析对所述溶液分别进行蛋白的分离和脱盐处理，得到所述山药蛋白DP1。

在某些实施方案中，根据本发明所述的山药蛋白DP1的分离纯化方法，其中，所述山药与Tris-HCl缓冲液的料液比为1:(1-50)。

在某些实施方案中，根据本发明所述的山药蛋白DP1的分离纯化方法，其中，浸提后收集上清液，加入硫酸铵，收集沉淀，得到山药总蛋白。

在某些实施方案中，根据本发明所述的山药蛋白DP1的分离纯化方法，其中，采用柱层析法对蛋白进行分离，其中，层析介质为DEAE Sepharose FF，平衡液为Buffer A，洗脱液为Buffer B，样品流速为2-10 mL/min，层析柱的规格为DEAE Sepharose FF (XK 26/40)，具体的洗脱程序为：上样后用Buffer A洗脱0.5-3 CV，优选0.6-2.5 CV，还优选0.8-2CV，进一步优选0.8-1.2 CV，例如1 CV，随后在2 CV内Buffer B的比例由0%增加至50%，当Buffer B的比例为50%后没有继续出峰时，将比例改为100%继续洗脱，直至没有新的蛋白峰出现。

在某些实施方案中，根据本发明所述的山药蛋白DP1的分离纯化方法，其中，调节所述山药总蛋白溶液的pH值与Buffer A的pH值一致。

在某些实施方案中，根据本发明所述的山药蛋白DP1的分离纯化方法，其中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10-100 mmol/L，pH为6.8-9.2。

在某些实施方案中，根据本发明所述的山药蛋白DP1的分离纯化方法，其中，采用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行脱盐，柱床体积为50-500 mL，平衡液为超纯水，样品流速为2-10 mL/min，洗脱液为超纯水。

本发明的第二方面，提供一种山药蛋白DP1，其由本发明所述的分离纯化方法得到。

在某些实施方案中，根据本发明所述的山药蛋白DP1，其中，其在流动相A为三氟乙酸-水，流动相B为乙腈，洗脱程序如下所示的HPLC程序中，保留时间为14-17 min，根据峰面积百分比确定其纯度不低于90%：

本发明的第三方面，提供根据本发明所述的山药蛋白DP1在制备促进或提高生殖功能的药物中的应用。

本发明的山药蛋白DP1的分离纯化方法工艺简单，操作简便。此外，由本发明分离纯化的山药蛋白DP1能够促进或提高生殖功能，预防或治疗勃起功能障碍，恢复氧化损伤海绵体内皮细胞的活力，促进海绵体内皮细胞与海绵体平滑肌细胞交互作用，提升海绵体组织中NO/cGMP的水平。

附图说明

图1 示出了山药蛋白DP1的电泳图。

图2 示出了山药蛋白DP1的HPLC图。

图3 示出了山药蛋白DP1热稳定性的检测结果。

图4 示出了山药蛋白DP1的SEM图像。

图5 示出了山药蛋白DP1的TEM图像。

图6 示出了山药蛋白DP1在190-260 nm波长内的CD图谱。

图7 示出了山药蛋白DP1内源荧光光谱检测结果。

图8 示出了山药蛋白DP1的FTIR检测结果。

图9 示出了山药蛋白DP1的液质图谱。

图10 示出了免疫荧光技术分析的小鼠海绵体内皮细胞(mouse cavernousendothelial cells，MCECs)的纯度(放大倍数：100×)。

图11 示出了H₂O₂诱导MCECs氧化应激损伤，其中，**P<0.01，***P<0.001 vs.对照。

图12 示出了DP1改善H₂O₂诱导所致的MCECs氧化损伤，其中，###P<0.001 vs.对照；*P<0.05，***P<0.001 vs. H₂O₂。

图13 示出了免疫荧光技术分析MCSMCs纯度(放大倍数：100×)。

图14 示出了H₂O₂诱导MCSMCs氧化应激损伤，其中，**P<0.01，***P<0.001 vs.对照。

图15 示出了DP1改善H₂O₂诱导所致的MCSMCs氧化损伤，其中，###P<0.001 vs.对照；*P<0.05，***P<0.001 vs. H₂O₂。

图16 示出了Transwell构建MCECs-MCSMCs交互作用模型。

图17 示出了山药蛋白DP1对MCECs-MCSMCs共培养体系中PI3K/AKT/eNOS级联反应的影响，其中，(A) 为Western blot检测p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-eNOS、eNOS表达情况；(B) 示出了定量分析p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS的表达量，#P<0.05，##P<0.01vs. 对照；**P<0.01，***P<0.001 vs. H₂O₂。

图18 示出了山药蛋白DP1对MCECs-MCSMCs共培养体系中cGMP含量的影响，其中，^##P<0.01 vs. 对照；^*P<0.05 vs. H₂O₂。

图19 示出了山药蛋白DP1对MCECs-MCSMCs共培养体系中Ca²⁺浓度的影响，其中，^##P<0.01 vs. 对照；^*P<0.05 vs. H₂O₂。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

分离纯化方法

本发明的一个方面，提供一种山药蛋白DP1的分离纯化方法，其包括：

(1) 从山药中以合适的料液比使用Tris-HCl缓冲液进行浸提，以获得山药总蛋白；

(3) 采用柱层析对所述溶液分别进行蛋白的分离和脱盐处理，得到所述山药蛋白DP1。下面对本发明的分离纯化方法进行具体说明。

本发明中，山药的来源不特别限定，其实例包括不限于细毛山药、铁棍山药、淮山药、麻山药、大和山药和灵芝山药等。在一个优选的实施方案中，山药为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea oppositaThunb.的干燥根茎。

本文中，“料液比”是指山药原料和Tris-HCl缓冲液的质量体积比，以“w/v”表示。本发明中，料液比为1:(1-50)，优选1:(1-45)，还优选1:(1-40)，更优选1:(1-35)，更优选1:(1-30)，更优选1:(1-25)，更优选1:(5-15)，例如1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15。

为了从山药总蛋白中获得山药蛋白DP1，本发明使用的Tris-HCl缓冲液的浓度为10-100 mmol/L，优选10-90 mmol/L，还优选10-80 mmol/L，更优选10-70 mmol/L，更优选10-60 mmol/L，更优选10-50 mmol/L，更优选10-40 mmol/L，更优选10-30 mmol/L，更优选15-25 mmol/L，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 mmol/L。Tris-HCl缓冲液的pH为6.8-9.2，优选7-9，还优选7-8，例如7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0。

在一个优选的实施方案中，Tris-HCl缓冲液的浓度为20 mmol/L，pH为7.4。

本发明中，浸提温度为1-20℃，优选1-18℃，还优选1-16℃，更优选1-14℃，更优选1-12℃，更优选1-10℃，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10℃。浸提时间为0.5-10 h，优选0.5-8h，还优选0.5-6 h，更优选0.5-4 h，例如0.5、1、2、3、4 h。

在一个优选的实施方案中，浸提温度为4℃，浸提时间为2 h。

在一些实施方案中，浸提后还包括：3000-10000 r/min离心2-30 min，收集上清液，加入硫酸铵至饱和，静置过夜，3000-10000 r/min离心2-30 min，收集沉淀，透析，冻干，得到山药总蛋白样品。其中，离心转速优选4000-9000 r/min，还优选5000-8000 r/min，例如5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000 r/min，离心时间优选2-25 min，还优选2-20min，更优选2-15 min，更优选2-10 min，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10 min。

步骤(2)中，配制的山药总蛋白溶液的浓度为10-100 mg/mL，优选10-90 mg/mL，还优选10-80 mg/mL，更优选10-70 mg/mL，更优选10-60 mg/mL，更优选10-50 mg/mL，更优选10-40 mg/mL，更优选15-25 mg/mL，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 mg/mL。

在一些具体的实施方案中，配制山药总蛋白溶液后还包括：离心取上清液，然后用0.1-20 μm的微孔滤膜过滤，并调节其pH值和电导值与Buffer A的pH值和电导值一致。本发明中，微孔滤膜的孔径优选0.1-20 μm，进一步优选0.1-15 μm，还优选0.1-10 μm，更优选0.1-5 μm，更优选0.1-1 μm，例如0.1、0.15、0.2、0.22、0.25、0.28、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μm。

在步骤(3)的一个优选的实施方案中，采用柱层析法对蛋白进行分离以获得山药蛋白DP1，其中，层析介质为DEAE Sepharose FF，平衡液Buffer A为20 mM Tris-HCl(pH=7.4)，洗脱液Buffer B为pH=7.4的Tris-HCl和NaCl溶液。NaCl优选为0.5-1.5 M，例如1 M。在一个优选的实施方案中，洗脱液Buffer B为20 mM Tris-HCl和1 M NaCl(pH=7.4)。

DEAE柱层析中，样品流速为2-10 mL/min，优选3-8 mL/min，还优选4-6 mL/min，层析柱的规格为XK 26/40。在一个优选的实施方案中，洗脱程序为：上样后用Buffer A洗脱1CV，随后在2 CV内Buffer B比例由0%增加至50%，当Buffer B比例为50%后没有继续出峰时，将比例改为100%继续洗脱，直至没有新的蛋白峰出现。

本发明中，采用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行脱盐，柱床体积为50-500 mL，优选50-400 mL，还优选50-300 mL。平衡液为超纯水，样品流速为2-10 mL/min，优选3-8 mL/min，还优选4-6 mL/min，洗脱相为超纯水。

山药蛋白DP1

本发明的一个方面，提供一种新颖的山药蛋白DP1，其由本发明所述的分离纯化方法得到。

在一个优选的实施方案中，山药蛋白DP1在流动相A为三氟乙酸-水，优选1%三氟乙酸-水。流动相B为乙腈，洗脱程序为如下所示的HPLC程序，保留时间为15.534 min，根据峰面积百分比确定其纯度为91.5%。其中，色谱柱为Zorbax 300SB-C18 0.3×150 mm，5 μm，流速为0.1-1.5 ml/min，还优选0.1-1.2 ml/min，进一步优选0.1-0.6 ml/min，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml/min。

本发明中，山药蛋白DP1的分子量为8-12 kDa，在一个具体的实施方案中，山药蛋白DP1的分子量为11.7 kDa。

本发明的山药蛋白DP1具有30-35%，优选为32.06%的必需氨基酸与总氨基酸比值(E/T)。

本发明的山药蛋白DP1具有优异的热稳定性，在一个优选的实施方案中，其具有100-120℃，优选108-118℃，还优选111-115℃的最高变性温度。

在一个优选的实施方案中，山药蛋白DP1具有DFILYSGESL的N-端序列。

应用

本发明的一个方面，提供山药蛋白DP1在制备促进或提高生殖功能的药物中的应用。所述促进或提高生殖功能包括但不限于以下情形之一：

(1) 预防或治疗勃起功能障碍；

(2) 提升海绵体组织中NO/cGMP水平；

(3) 恢复氧化损伤海绵体内皮细胞活力，特别是H₂O₂诱导的氧化损伤；

(4) 提高海绵体内皮细胞的p-PI3K、p-AKT及p-eNOS的蛋白表达量；

(5) 提高海绵体平滑肌细胞的cGMP水平、降低Ca²⁺浓度。

基于同一发明构思，本发明还提供一种提高细胞内NO/cGMP水平，p-PI3K、p-AKT及p-eNOS的蛋白的量，和/或Ca²⁺浓度的方法，该方法为体外方法，所述细胞优选为体外的内皮细胞和/或平滑肌细胞，还优选海绵体内皮细胞和/或海绵体平滑肌细胞。所述方法包括使所述山药蛋白DP1与细胞接触并培养的步骤。

实施例

一、实验方法

1. 山药蛋白DP1的分离纯化

1.1 山药总蛋白的提取

将新鲜山药洗净，加入20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)缓冲液，料液比(w/v)1:10，4℃浸提2 h，7000 r/min离心5 min，收集上清液，加入硫酸铵至饱和度为65%，静置过夜，7000 r/min离心5 min，收集沉淀，透析，冻干，得到山药总蛋白样品。

1.2 山药蛋白DP1的分离纯化

1.2.1 样品预处理

称取山药总蛋白冻干样品，加入20 mmol/L Tris-Hcl (pH=7.4)配制成20 mg/mL的蛋白溶液，离心取上清液，然后用0.22 μm的微孔滤膜过滤，并调节其pH值和电导值与Buffer A的pH值和电导值一致。

1.2.2 DEAE Sepharose FF层析介质预处理

(1) 脱气

取适量体积的DEAE Sepharose FF层析介质，放置至室温，转入抽滤瓶中，连接真空泵进行脱气处理，脱气后的介质静置备用。

(2) 装柱与平衡

把脱气好的DEAE Sepharose FF介质装柱(规格：XK 26/40)，用Buffer A充分平衡。将处理好的介质上层液体倒掉一部分，大致使介质与上清液体积比约为1:1。然后慢慢搅动，使介质悬浮均匀。再向预先含有少量Buffer A的柱子中，连续地倒入介质，等底层出现2 cm左右的柱床后，将下端口打开，从上端加入介质，直至所有介质全部倒入，停止装柱。装柱结束后，需先观察柱床是否平整，确认柱床无断层，无气泡。

使用Buffer A不断的过柱，当柱床高度稳定，继续平衡层析柱，直至层析柱内流动相与Buffer A的电导值和pH值一致，且基线平稳，可以进行下一步的实验操作。

1.2.3 上样与洗脱

取“1.2.1”中处理好的样品溶液，通过进样泵加入到层析柱内，流速5 mL/min，柱床体积150 mL，上样后用Buffer A洗脱1 CV，随后在2 CV内Buffer B比例由0%增长至50%，当Buffer B比例为50%后没有继续出峰时，将比例改为100%继续洗脱，直至没有新的蛋白峰出现。收集蛋白峰的洗脱溶液。

1.2.4 葡聚糖凝胶Sephadex G25脱盐

(1) 溶胀

样品脱盐选择常见的脱盐介质葡聚糖凝胶Sephadex G25，加入10倍体积的超纯水，加热煮沸1 h溶胀，此过程缓慢搅拌，溶胀结束静置，冷却至室温，倒出上层悬浮的细碎颗粒。

(2) 脱气

取已经溶胀好的Sephadex G25层析介质，转入抽滤瓶中，连接真空泵进行脱气处理，脱气后的介质静置备用。

(3) 装柱与平衡

把脱气好的Sephadex G25进行装柱(规格：XK 26/40)，用超纯水充分平衡。将处理好的介质上层液体倒掉一部分，大致使介质与上清液体积比约为1:1。然后慢慢搅动，使介质悬浮均匀。再向预先含有少量超纯水的柱子中，连续地倒入介质悬浮液体，等底层出现2cm左右的柱床后，将下端口打开，从上端续加入介质，直至所有介质全部倒入，停止装柱。装柱结束后，需先观察柱床是否平整，确认柱床无断层，无气泡。

使用超纯水不断的过柱，当柱床高度稳定，继续平衡层析柱，直至层析柱内流动相与超纯水的电导值和pH值一致，且基线平稳，可以进行下一步的实验操作。

1.2.5 上样与洗脱

取“1.2.3”中收集的蛋白溶液，加入层析柱内，流速5 mL/min，柱床体积150 mL，上样后用超纯水洗脱，出现蛋白峰时收集溶液，冻干，于-80℃保存。

2. 山药蛋白DP1结构表征

2.1 山药蛋白DP1 SDS-PAGE电泳测定

2.1.1 凝胶配制

分离胶浓度为12%(以下为1板胶的加量)。

在配胶之前现将配胶片所需的装置安装好，取一个清洗好的干燥小烧杯，先配置分离胶，按上述溶液的配比加入后，混匀，加入装置中，再加入异丙醇(作用：排气泡，压平胶面)置于上方，30 min后分离胶凝固，弃去异丙醇，配制浓缩胶，混匀后加入装置中并插入所需孔数的梳子，凝固后备用。

2.1.2 蛋白样品配置

用精密天平称取山药蛋白DP1冻干粉末，加入RO水配置成2.5 mg/mL的蛋白溶液，再用逐级稀释法配成浓度分别为2、1.5、1和0.5 mg/mL的溶液，将配置好的溶液置于瞬离仪器中瞬离30 s，分别吸取适量的上清液并加入等量的2X含DTT的蛋白上样缓冲液，混匀后置于浮漂中，放到沸水中使蛋白变性，5 min后取出，得到电泳样品，冷却至室温备用。

2.1.3 蛋白溶液上样及电泳条件

将凝固好的胶片组装在上样夹中，加入蒸馏水检漏，没有液体从缝隙中滴落视为检漏成功，将蒸馏水弃去，加入电泳缓冲液，缓慢向上平移拔出梳子，样品按顺序上样，没有样品的孔加入上样缓冲液，小心将上样夹放置到电泳槽中(电极要安装正确)，缓慢将剩余的电泳缓冲液倒入电泳槽内，设置程序为70 v/30 min；140 v/50 min，结束后，取出胶片弃去上层胶，将下层胶放到考马斯亮蓝中进行染色。

2.1.4 染色和脱色

染色：取考马斯亮蓝染色液大概100 mL并将下层胶片放入，使染色液完全覆盖在胶片上面，在室温条件下将其摆放在水平的摇床上，转速调节为60 rpm/min，时间设置为30min，结束后回收染色液。

脱色：加入适量的脱色液(脱色液完全覆盖在胶片上为止)，在室温条件下将其摆放在水平的摇床上，转速调节为60 rpm/min，时间设置为每30 min更换一次脱色液，胶片背景变成透明。浸泡在蒸馏水中待分析。

2.1.5 凝胶成像

从蒸馏水中取出胶片，将其放置于底色为白的不透明的塑料板上，放到凝胶成像仪中，进行拍照并对其分析。

2.2 山药蛋白DP1氨基酸组成测定

取25 µL混合氨基酸标准品溶液，加入12.5 µL 1 mol/L三乙胺涡旋混合震荡，之后加入12.5 µL 0.1 mol/L PITC涡旋混合震荡，室温静置1 h，加入100 µL正己烷剧烈混合震荡后静置10 min，取下层溶液20 µL，加入180 µL流动相A溶液,混合后0.22 µm过滤处理，上机待用。

取一定量的山药蛋白DP1样品，转移至水解管中，加入1 mL 6 M的盐酸，充入氮气约10 min，密封后放置于干式加热器模块中，110℃水解反应过夜。反应完毕后，将游离氨基酸溶液转移至1.5 mL EP管中，抽真空浓缩至干。取适量流动相A液复溶已冻干的样品游离氨基酸，取25 µL样品氨基酸溶液，加入12.5 µL 1 mol/L三乙胺涡旋混合震荡，加入12.5 µL 0.1 mol/L PITC涡旋混合震荡室温静置1 h，加入100 µL正己烷剧烈混合震荡后静置10min，取下层溶液20 µL，加入180 µL流动相A溶液，混合后0.22 µm过滤处理待测试。

2.3 山药蛋白DP1纯度测定

精密称定山药蛋白DP1冻干粉末10 mg置于10 mL具塞试管中，加水10 mL，混匀后，水浴超声60 min，过0.45 µm滤膜，取10 µL样品注入高效液相色谱仪中进行测定，记录各个峰面积，根据峰面积测定其纯度。

2.4山药蛋白DP1热稳定性检测

精密称量5 mg山药蛋白DP1冻干粉末样品，置于铝坩埚中，压实，密封。以不装蛋白样品的空白铝坩埚作为空白对照，氮气流速50 mL/min，用差示扫描量热仪在20-140℃下以10℃/min的加热速率扫描密封的铝坩埚。

2.5 山药蛋白DP1扫描电镜(SEM)分析

使用导电双面胶将少量山药蛋白DP1冻干粉末均匀平铺在金属样品台上，放入真空镀金器中真空镀金后，在20 kV电压、15 Pa低真空模式下，放入扫描电镜后调节不同放大倍数进行拍照观察各组分蛋白表面形态特征。

2.6 山药蛋白DP1透射电镜(TEM)分析

取一定量的山药蛋白DP1冻干粉末样品，溶于纯水中，取10 μl样品滴在铜网上并移至37℃烘箱中烘干。利用TEM观测记录形态。

2.7 山药蛋白DP1圆二色谱(CD)检测

将供试品用空白缓冲液(20 mM PB)稀释至0.2 mg/mL；准备一只干净的比色皿放置在仪器中，先采集背景信号，再加入适量空白缓冲液采集空白数据。最后按照相同参数采集标准品溶液在180-340 nm波长间的远近紫外吸收，按照相同参数采集供试品溶液在190-260 nm波长间的远紫外吸收。

使用软件对原始数据进行数据处理，并用CDNN软件对供试品二级结构进行拟合计算。注：标准品波峰波谷CD值的有效比值范围为2.08±0.06。

2.8 山药蛋白DP1内源性荧光光谱检测

精密称取山药蛋白DP1冻干粉末溶于10 mM的磷酸盐缓冲液中，配制浓度为0.1mg/mL，用1.0 mol/L HCl和1.0 mol/L NaOH溶液，调节溶液pH=5.0、7.0和9.0。未调pH值的溶液作为空白，调节分荧光分光光度计的参数使其激发波长为280 nm，记录波长为300-500nm激发和发射狭缝为5 nm，参数调节完成后开始试验。

2.9山药蛋白DP1红外吸收光谱检测

玛瑙研钵中放置山药蛋白DP1冻干粉末2.0 mg、光谱纯KBr约200.0 mg，研磨成细腻粉末状，取适量混匀后的样品置于压片模具中，放在压片机上，压制成薄片，扫描波数400-4000 cm^-1，分辨率4 cm^-1，扫描20次。

2.10 山药蛋白DP1氨基酸序列分析

取山药蛋白DP1水溶液进行SDS-PAGE变性电泳，用转膜仪将胶上的目的蛋白条带转至PVDF膜上，经考马斯亮蓝染色、脱色，晾干后，使用Edman降解法，在PE ABD ProteinSequence 494A上进行N-端测序分析。

2.11 山药蛋白DP1 MALDI-TOF-MS/MS检测

山药蛋白DP1冻干粉末经过还原和烷基化处理后，加入胰蛋白酶(质量比1:50)，在37℃条件下酶解20 h。酶解产物脱盐后冻干，复溶于0.1% FA溶液中，-20℃保存待用。

A液为0.1%甲酸的水溶液，B液为0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84%)。色谱柱以95%的A液平衡后，样品由自动进样器上样至Trap柱，0.5 h梯度。

多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱。

3. 山药蛋白DP1体内活性研究

3.1 实验动物

SD大鼠：购自亿斯实验动物技术有限公司，SPF级，180-200 g，合格证编号：SCSK(吉)2018-0007。

3.2肾阳虚模型的构建及给药

50只雄性SD大鼠，体重180-200 g，随机分成5组，即对照组、模型组、DP1低剂量组(0.6 mg/kg)、DP1高剂量组(0.9 mg/kg)。大鼠适应环境一周后，连续灌胃25 mg/kg氢化可的松(HCT)10天，构建肾阳虚模型。模型建立后，对照组与模型组给予蒸馏水，其余三组分别给予不同的药物连续治疗10天(给药浓度由预实验结果确认)。

3.3 勃起功能检测

末次给药后，将大鼠放入透明观察笼内，适应环境10 min。皮下注射100 μg/kg 阿扑吗啡(apomorphine，APO)溶液(以含0.2 mg/mL的维生素Ｃ的生理盐水为溶剂，配制浓度40 μg/mL)，通过兴奋中枢多巴胺受体使大鼠阴茎勃起，观察30 min内大鼠勃起潜伏期。阴茎末端完全暴露记为勃起。

3.4 交配实验

末次给药后，在安静的环境中，将雄性大鼠单独放入大鼠饲养笼中，适应5 min后，每笼再放入1只雌鼠，开始计时并在20 min内记录下列指标：①捕捉潜伏期：自放入雌鼠到雄鼠第1次捕捉雌鼠的时间间隔。②射精潜伏期：自放入雌鼠到雄鼠第1次与雌鼠交配时发生射精现象的时间间隔。③射精比例：放入雌鼠后20 min内每组中有射精现象的雄鼠个数与雄鼠总数的比值。

4. 山药蛋白DP1体外活性研究

4.1 基于Matrigel 3D培养体系分离培养小鼠海绵体内皮细胞MCECs

取8周龄C57BL/6小鼠脱颈处死，酒精棉球对其下腹部消毒。用镊子、手术剪做下腹部切口，剥开腹部筋膜及包皮腺，露出海绵体组织。用手术剪分离海绵体置于含10%双抗的HBSS中，镜下除去尿道及神经血管束，获得干净的海绵体组织，在含10%双抗的PSB中清洗3次。利用精细手术剪剪成1-2 mm³小块，置于预冷的24孔板底，每孔2块切块。每孔补加200 μL含50 ng/mL VEGF的基质胶包被切块，培养小鼠海绵体内皮细胞(mouse cavernousendothelial cells，MCECs)并诱导其增殖。于37℃、5% CO₂培养箱中培养14天至长满孔底80%。吸除培养基，每孔加200 μL消化酶于培养箱中消化1 h。加入等体积10 mM EDTA终止消化，离心后沉淀即为细胞。将获得的MCECs置于预先包被0.2%明胶的培养皿中，补加完全培养基进行培养。2-3代进行后续实验。

4.2 MCECs的纯度鉴定

利用免疫荧光法对MCECs的纯度进行鉴定。取密度为5*10⁵细胞/mL的MCECs在6孔板内做细胞爬片处理。贴壁24 h后，吸除培养基，用预冷的PBS洗3次。每孔加4%多聚甲醛500μL室温固定15 min，预冷的PBS洗3次。每孔加500 μL含5%山羊血清的0.5% Triton X-100通透液，室温放置30 min。吸除封闭液，加入一抗(PECAM-1：内皮细胞标记物，1:20；结蛋白(Desmin)：平滑肌细胞标记物，1:200)，4℃孵育过夜。回收一抗，预冷的PBS洗3次。加入Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG及Alexa Fluor 594标记的羊抗大鼠IgG室温孵育1 h，预冷的PBS洗3次。滴加DAPI试剂染细胞核，室温避光5 min，预冷的PBS洗3次.滴加荧光淬灭剂的封片液，并进行封片。荧光显微镜下观察并拍照，Image Pro Plus图像软件分析MCECs纯度。

4.3 MCECs氧化损伤模型的构建

MCECs细胞以密度2×10⁴/mL铺于96孔板中，贴壁后吸出旧培养基，加入M199基础培养基饥饿培养24 h。更换MCECs完全培养基，继续培养24 h。加入不同浓度过H₂O₂(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L)构建氧化损伤模型，培养时间2 h。细胞活力由CCK-8法检测得到：细胞培养结束后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育1 h，于酶标仪A450处测量OD值。

4.4 DP1对MCECs氧化损伤模型细胞活力的影响

MCECs细胞以密度2×10⁴/mL铺于96孔板中，贴壁后吸出旧培养基，加入M199基础培养基饥饿培养24 h。各组分别加入不同浓度的DP1(125、250、500 μg/mL)，继续培养24 h。加入0.5 mmol/L H₂O₂(造氧化损伤模型，培养时间2 h。细胞活力由CCK-8法检测得到：细胞培养结束后，每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃孵育1 h，于酶标仪A450处测量OD值。

4.5 组织贴壁法分离MCSMCs

取8周龄C57BL/6小鼠脱颈处死，酒精棉球对其下腹部消毒。用镊子、手术剪做下腹部切口，剥开腹部筋膜及包皮腺，露出海绵体组织。用手术剪分离海绵体置于含10%双抗的HBSS中，镜下除去尿道及神经血管束，获得干净的海绵体组织，在含10%双抗的PSB中清洗3次。利用精细手术剪剪成1-2 mm³小块，有距离的置于35 mm培养皿底，补加DMEM完全培养基(含20%胎牛血清及1%双抗)至没过组织块但不浮起。组织块贴敷皿底后补加DMEM完全培养基4 mL。培养14 d至长满孔底80%，胰酶消化，离心后沉淀即为细胞。传代后更换成含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，2-3代用于后续实验。

4.6 MCSMCs的纯度鉴定

利用免疫荧光法对MCSMCs的纯度进行鉴定。具体操作步骤同“4.2”项。

4.7 MCSMCs氧化损伤模型的构建

MCECs细胞以密度2×10⁴/mL铺于96孔板中，贴壁后吸出旧培养基，加入M199基础培养基饥饿培养24 h。更换MCECs完全培养基，继续培养24 h。加入不同浓度H₂O₂(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L)构建氧化损伤模型，培养时间2 h。细胞活力由CCK-8法检测得到：细胞培养结束后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育1 h，于酶标仪A450处测量OD值。

4.8 DP1对MCSMCs氧化损伤模型细胞活力的影响

MCECs细胞以密度2×10⁴/mL铺于96孔板中，贴壁后吸出旧培养基，加入M199基础培养基饥饿培养24 h。各组分别加入不同浓度的DP1(62.5、125、250 μg/mL)，继续培养24h。加入0.3 mmol/L H₂O₂构建氧化损伤模型，培养时间2 h。细胞活力由CCK-8法检测得到：细胞培养结束后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育1 h，于酶标仪A450处测量OD值。

4.9 建立MCECs-MCSMCs交互模型

本实验利用0.4 μm孔径的聚碳酸酯膜能够透过由细胞代谢产生的小分子物质，而不能透过细胞的原理，建立MCECs-MCSMCs共培养体系，研究山药蛋白对海绵体内皮及平滑肌之间信息传递的影响作用。具体模型建立方案如下：

(1) 收集1×10⁵个MCECs及0.5×10⁵个MCSMCs细胞分别铺于Transwell(6孔板，0.4μm孔径)的下室和上室。

(2) 贴壁后吸出旧培养基，分别加入M199基础培养基或DMEM基础培养基饥饿培养24 h。

(3) MCECs实验组加入的250 μg/mL DP1，其余组更换MCECs完全培养基。MCSMCs各组更换DMEM完全培养基，继续培养24 h。

(4) MCECs模型组及实验组加入0.5 mmol/L H₂O₂造损伤模型，培养时间2 h。

(5) 收集各组细胞及细胞上清液，待用。

4.10 Western Blot检测蛋白表达水平

每组细胞沉淀加200 μL RIPA裂解液(含1% PMSF)进行裂解。利用BCA法测定蛋白含量并将所有组蛋白提取液的浓度调至一致。取适量体积调平后的蛋白提取液，按1:1比例加入2x蛋白上样缓冲液。沸水浴5 min。蛋白样品进行SDS-PAGE电泳(含5%压缩胶及12%分离胶；程序：70 V，30 min+140 V，1 h)。用一抗稀释液按1:1000比例稀释一抗(GAPDH、p-eNOS、eNOS、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K)原液，4℃孵育相对应的NC膜过夜。回收一抗，PBST洗膜3次，每次5 min。加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育1 h。吸除二抗，PBST洗膜3次，每次5min。显色：均匀滴加ECL发光液，于凝胶成像系统中显影、拍照、分析灰度值。

4.11 cGMP含量检测

利用ELISA法检测MCSMCs胞内cGMP含量。用PBS将收集的MCSMCs沉淀混悬，在液氮中反复冻融6次。3000 rpm离心20 min，取上清，根据小鼠环磷酸鸟苷(cGMP)的ELISA检测试剂盒说明书进行分析。

4.12 Ca²⁺浓度检测

利用Fluo-4 AM钙离子荧光探针分析MCSMCs中Ca²⁺浓度。具体如下：将收集的MCSMCs沉淀用PBS洗2次。每个样本加入200 μL含5 μmol/LFluo-4 AM的PBS溶液混悬。置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育1 h。于流式细胞仪中检测，并分析Ca²⁺浓度。

5. 统计学分析

实验结果以平均值±标准差(means±SD)表示。使用GraphPad Prism v6.0软件，通过one-way ANOVA及Tukey-Kramer分析组间差异。^*P<0.05表示差异具有统计学意义。

二、实验结果

1. SZSP的SDS-PAGE结果分析

SDS-PAGE通常用于蛋白质分子量和亚基组成分析。在还原条件下山药蛋白DP1的电泳模式如图1所示，结果表明，山药蛋白DP1分子量约为11.7 kDa。

2. 山药蛋白DP1氨基酸组成

从表1可见，山药蛋白DP1含有13种氨基酸，其中必需氨基酸与总氨基酸比值(E/T)为32.06%，与FAO提出的(E/T)参考值40%比较接近。山药蛋白DP1非必需氨基酸中Asp(18.08%)和Gly(12.98%)含量最高，因此，山药蛋白DP1具有良好的抗氧化和免疫活性。除此之外，山药蛋白DP1中Arg含量较高，Arg是精子蛋白的主要成分，有促进精子的质量，提高精子运动能量的作用；同时也是鸟氨酸循环中重要组成成分，在一氧化氮合酶作用下，可分解生成NO，是治疗内皮细胞功能障碍的常用药物。综上所述，山药蛋白DP1氨基酸含量丰富，营养价值、药用价值高，未来可作为许多食品或药品中重要的组成成分。

表1 山药蛋白DP1氨基酸组成分析

其中，结果表示为平均值±标准差(n=3)；

^a亲水性氨基酸：Ser, Thr, Cys, Tyr；

^b疏水性氨基酸：Gly, Ala, Val, Leu, Pro, Met, Phe, Ile；

^c酸性氨基酸：Glu, Asp；

^d碱性氨基酸：Lys, Arg, His；

^e芳香族氨基酸：Tyr, Phe；

^f支链氨基酸：Ile, Leu, Val。

3. 山药蛋白DP1纯度结果分析

使用HPLC方法对山药蛋白DP1纯度进行了验证，结果如图2显示，山药蛋白DP1保留时间为15.534 min，根据峰面积百分比确定其纯度为91.5%。

4. 山药蛋白DP1热稳定性结果分析

差示扫描量热法可以用来检测蛋白质热性能的基本信息。具体来说，热变性温度(Td)反映蛋白质的热稳定性：Td值越高，热稳定性越好；ΔH反映二级结构的稳定性：ΔH值越高，键能越大。本研究采用差示扫描量热仪对山药蛋白DP1的热性能进行了检测，结果如图3所示。在加热过程中，随着坩埚温度的升高，山药蛋白DP1的热吸收呈现曲线变化。山药蛋白DP1的最高变性温度为113℃，具有较高的热稳定性。山药蛋白DP1中疏水性氨基酸比例较高可能是其变性温度较高的主要原因。

5. 山药蛋白DP1扫描电镜SEM结果

微观结构是评价蛋白应用潜力的重要因素。SEM用于表征蛋白质的形貌。如图4所示，山药蛋白DP1呈不规则片状和纤维状，表面较为光滑。

6. 山药蛋白DP1 TEM扫描电镜结果

通过TEM研究了山药蛋白DP1的形貌特征。如图5所示，山药蛋白DP1小部分蛋白聚集，分布较为良好，呈单分散球形。

7. 山药蛋白DP1圆二色谱(CD)分析结果

用CDNN软件来预测计算出不同扫描波长下蛋白结构中所含有的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等构型。结果如图6、表2所示，在蛋白质的二级结构分析中，α-螺旋的含量相对较低，表明其不易受静电相互作用，而β-折叠含量较高，表明其易受疏水作用。山药蛋白DP1的无规卷曲含量约为35.0%，在不同扫描波长下无明显变化。

表2 山药蛋白DP1在不同扫描波长下的二级结构的含量

8. 山药蛋白DP1内源性荧光光谱分析结果

为了进一步阐明山药蛋白DP1三级结构的构象变化。用固有荧光法反映了山药蛋白DP1中色氨酸残基的氧化程度和微环境的变化，从而表明蛋白质结构发生的变化。不同pH值(2.0、4.0、6.0和10.0)的山药蛋白DP1的荧光光谱如图7所示。在280 nm的激发波长下，不同pH值的PLP溶液的最大吸收峰均在310 nm左右。在不同pH条件下，山药蛋白DP1的最大吸收峰没有明显的红移，说明在酸性和碱性环境中山药蛋白DP1的三级结构较稳定。

9. 山药蛋白DP1红外吸收光谱FTIR分析结果

在光谱图中可以清楚地观察到五条蛋白质特征带，即酰胺A带(3400-3200 cm^-1)、酰胺B带(2940-2922 cm^-1)、酰胺Ⅰ带(1700-1600 cm^-1)、酰胺Ⅱ带(1575-1480 cm^-1)、酰胺Ⅲ带(135-1220 cm^-1)。其中酰胺Ⅰ带是蛋白质红外图谱中最突出的一个振动带，主要是与双键沿肽键主链的C=O伸缩振动有关。如图8所示，蛋白质在4000-400 cm^-1有多处吸收峰。其中，波数在3300 cm^-1处出现的宽峰是H-O键伸缩振动引起的典型吸收峰，在1539 cm^-1和1646cm^-1处出现了两个明显的吸收峰，前者是由N-H弯曲和C-N伸缩振动引起的，后者是由C=O伸缩振动引起的，这些都是蛋白中酰胺基团的特征峰。综上所述，FTIR光谱结果进一步证明了山药蛋白DP1具有典型的蛋白质结构。

10. 山药蛋白DP1 N-端序列分析

经检测，山药蛋白DP1的N-端序列为DFILYSGESL。

11. 山药蛋白DP1 MALDI-TOF-MS/MS分析结果

山药蛋白DP1的液质图谱如图9所示，通过高效液相色谱可将各肽段分离，质谱仪可测定肽段的质荷比。

12. 山药蛋白DP1对肾阳虚大鼠的改善作用

12.1 对肾阳虚证的影响

HCT造模10天后大鼠出现畏寒、抱团、毛发干枯和弓背等症，表明大鼠出现肾阳虚证。给药10天后，与模型组相比，DP1低、高剂量组大鼠畏寒、抱团、毛发干枯和弓背等现象均显著缓解。表明DP1对HCT诱导所致的大鼠肾阳虚证具有改善作用。

12.2 对大鼠勃起功能的影响

由表3可知，与对照组比较，模型组大鼠勃起潜伏期显著延长(P＜0.0001)。与模型组比较，DP1组大鼠勃起潜伏期显著降低(P＜0.05，P＜0.001)，且呈剂量依赖。表明DP1可提高肾阳虚大鼠勃起功能。

表3 山药蛋白DP1对肾阳虚大鼠勃起功能的影响( s，n=10)

注：与对照组相比，^####P<0.0001；与模型组相比，^*P<0.05，^***P<0.001。

12.3 对大鼠交配能力的影响

由表4可知，与对照组比较，模型组大鼠捕捉潜伏期、射精潜伏期均显著延长(P＜0.01或P＜0.05)，射精比例显著降低(P＜0.01)。与模型组比较，DP1高剂量组大鼠捕捉潜伏期、射精潜伏期均显著降低(P＜0.05)，射精比例显著升高(P＜0.05)。表明DP1可提高肾阳虚大鼠交配能力。

表4 山药蛋白DP1对肾阳虚大鼠勃起功能的影响( s，n=10)

注：与对照组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组相比，^*P<0.05。

13. 山药蛋白DP1对体外细胞模型的改善作用

13.1 DP1对MCECs氧化损伤模型的细胞活力恢复作用

(1) 免疫荧光技术分析MCECs纯度

为了鉴定原代细胞的真实属性，验证分离方法是否可行，免疫荧光技术是目前检测原代细胞类型和纯度最常用的分析方法。在阴茎海绵体中除内皮细胞外，平滑肌细胞含量最丰富，因此本实验以血小板和内皮细胞粘附分子(PECAM-1)标记阳性细胞MCECs，以肌肉组织肿瘤表达的结蛋白标记MCSMCs作为阴性对照，分析所得原代细胞的类型及MCECs纯度。结果可知，MCECs阳性率能达到90%以上(见图10)。

(2) H₂O₂诱导MCECs氧化应激损伤

以原代MCECs为体外模型，首先考察H₂O₂诱导MCECs氧化损伤的最佳作用浓度及时间。利用不同浓度H₂O₂(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L)作用MCECs 2 h后检测细胞活力。CCK-8结果如图11所示，与对照组相比，0.3 mmol/L H₂O₂作用2 h时细胞活力均无显著性差异。随着作用浓度的增加，MCECs的细胞活力表现出时间-剂量依赖趋势。当浓度达到0.6、0.7 mmol/L时，镜下观察细胞多呈坏死状态。在综合考虑细胞存活率及细胞状态的前提下，最终选择0.5 mmol/L H₂O₂作为最佳造模浓度。

(3) DP1改善H₂O₂诱导所致的MCECs氧化损伤

采用CCK-8法考察DP1干预氧化损伤MCECs细胞后细胞活力的变化。结果如图12所示，与对照组相比，H₂O₂作用2 h后细胞活力显著降低。给与药物干预后，250 μg/mL DP1对氧化损伤MCECs细胞的恢复作用最为显著，可提高约25%。后续实验以250 μg/mL作为DP1的最佳作用浓度。

13.2 DP1对MCSMCs氧化损伤模型的细胞活力恢复作用

(1) 免疫荧光技术分析MCSMCs纯度

在阴茎海绵体中除平滑肌外，内皮细胞含量最丰富，因此本实验以结蛋白标记阳性细胞MCSMCs，以PECAM-1标记MCECs作为阴性对照，分析所得原代细胞的类型及MCSMCs纯度。结果可知，MCSMCs阳性率能达到90%以上(见图13)。

(2) H₂O₂诱导MCSMCs氧化应激损伤

以原代MCSMCs为体外模型，首先考察H₂O₂诱导MCSMCs氧化损伤的最佳作用浓度及时间。利用不同浓度H₂O₂(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L)作用MCSMCs 2 h后检测细胞活力。CCK-8结果如图14所示，与对照组相比，0.1 mmol/L H₂O₂作用2 h时细胞活力均无显著性差异。随着作用浓度的增加，MCSMCs的细胞活力表现出时间-剂量依赖趋势。当浓度达到0.4、0.5 mmol/L时，镜下观察细胞多呈坏死状态。在综合考虑细胞存活率及细胞状态的前提下，最终选择0.3 mmol/L H₂O₂作为最佳造模浓度。

(3) DP1改善H₂O₂诱导所致的MCSMCs氧化损伤

采用CCK-8法考察DP1干预氧化损伤MCSMCs后细胞活力的变化。结果如图15所示，与对照组相比，H₂O₂作用2 h后细胞活力显著降低。给与药物干预后，125 μg/mL DP1对氧化损伤MCSMCs细胞的恢复作用最为显著，可提高约22%。

13.3 山药蛋白对MCECs-MCSMCs共培养体系的影响

利用Transwell构建MCECs-MCSMCs共培养体系，体外模拟海绵体内皮细胞与海绵体平滑肌细胞之间的交互作用关系，阐释山药蛋白通过调控NO/cGMP信号通路，改善肾阳虚大鼠勃起功能。MCECs-MCSMCs共培养体系如图16所示。

利用Western blot检测手段分析共培养体系中MCECs内p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-eNOS及eNOS的蛋白表达量，结果可知，与对照组相比，模型组共培养体系中MCECs内p-PI3K、p-AKT及p-eNOS的蛋白表达量均显著降低，表明在H₂O₂的诱导下，PI3K/AKT信号通路被抑制，进而影响eNOS蛋白的激活，内皮细胞不能充足供应的NO。给予DP1干预后，显著提高了p-PI3K、p-AKT及p-eNOS的蛋白表达量，激活PI3K/AKT/eNOS级联反应(见图17)。

在确证DP1能够激活MCECs-MCSMCs共培养体系中PI3K/AKT/eNOS信号通路后，为明确DP1是否影响MCECs-MCSMCs的交互作用，进一步分析MCSMCs内cGMP含量及Ca²⁺浓度。结果可知，与对照组相比，模型组共培养体系中MCSMCs的cGMP含量显著降低，Ca²⁺浓度显著升高，表明MCECs在H₂O₂的诱导下，能够通过共培养体系影响MCSMCs中cGMP和Ca²⁺水平。在DP1干预后，显著恢复由于H₂O₂诱导所致的cGMP和Ca²⁺水平异常(见图18、19)。

以上结果证明，山药蛋白DP1能够增强体外勃起损伤模型中NO/cGMP信号传导，且这种促进作用是通过恢复海绵体内皮细胞与海绵体平滑肌细胞之间的交互作用实现的，具体表现为：激活内皮细胞中PI3K/AKT/eNOS级联反应，进一步增加平滑肌细胞中cGMP含量，并减少Ca²⁺浓度，从而发挥改善肾阳虚性ED的作用。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应对理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种山药蛋白DP1的分离纯化方法，其特征在于，其包括：

(1) 使用Tris-HCl缓冲液对山药进行浸提，得到山药总蛋白，其中，所述山药与Tris-HCl缓冲液的料液比为1:(1-50)；

(2) 使用所述缓冲液配制山药总蛋白溶液，并调节至合适的pH值，其中，调节所述山药总蛋白溶液的pH值与Buffer A的pH值一致；

(3) 采用柱层析对所述溶液分别进行蛋白的分离和脱盐处理，得到所述山药蛋白DP1，其中，采用层析介质DEAE Sepharose FF进行分离，采用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行脱盐。

2.根据权利要求1所述的山药蛋白DP1的分离纯化方法，其特征在于，浸提后收集上清液，加入硫酸铵，收集沉淀，得到山药总蛋白。

3. 根据权利要求2所述的山药蛋白DP1的分离纯化方法，其特征在于，采用柱层析法对蛋白进行分离，其中，层析介质为DEAE Sepharose FF (XK 26/40)，平衡液Buffer A包括Tris-HCl缓冲液，洗脱液Buffer B包括Tris-HCl和NaCl溶液，样品流速为2-10 mL/min，洗脱程序为：上样后用Buffer A洗脱0.5-3 CV，随后Buffer B的比例由0%增加至50%，当Buffer B的比例为50%后没有继续出峰时，将比例改为100%继续洗脱，直至没有新的蛋白峰出现。

4. 根据权利要求1所述的山药蛋白DP1的分离纯化方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10-100 mmol/L，pH为6.8-9.2。

5. 根据权利要求1所述的山药蛋白DP1的分离纯化方法，其特征在于，采用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行脱盐，柱床体积为50-500 mL，平衡液为超纯水，样品流速为2-10 mL/min，洗脱液为超纯水。

6.一种山药蛋白DP1，其特征在于，其由权利要求1-5任一项所述的分离纯化方法得到。

7.根据权利要求6所述的山药蛋白DP1，其特征在于，其在流动相A为三氟乙酸-水，流动相B为乙腈，洗脱程序如下所示的HPLC程序中，保留时间为14-17 min：

。

8.根据权利要求7所述的山药蛋白DP1在制备促进或提高生殖功能的药物中的应用。