CN116854774B - 衍生肽、端粒长度调节剂及其在抗衰老中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肉桂活性成分技术领域，尤其涉及衍生肽、端粒长度调节剂及其在抗衰老中的应用。该衍生肽来自肉桂（Cinnamomum aromaticum）籽，经过对肉桂籽脱脂、碱处理、酸处理、酶解和纯化得到寡肽，再对寡肽进行脂化处理得到该衍生肽。该衍生肽能够减缓细胞端粒缩短速度，对抗氧化应激作用，提高端粒酶逆转录因子和端粒酶逆转录酶活性，减少端粒磨损。
Description
技术领域
本发明涉及肉桂活性成分技术领域，尤其涉及衍生肽、端粒长度调节剂及其在抗衰老中的应用。
背景技术
肉桂（Cinnamomum aromaticum）为樟科樟属植物，其干燥树皮、干燥嫩枝为中医临床常用药材，具有补火助阳、温里散寒的功效。《中国药典》2020年版规定肉桂、桂枝分别为肉桂的干燥树皮及干燥嫩枝。关于肉桂的植物化学研究，目前共分离鉴定出160多种成分，肉桂不同部位的化学成分相似，但在种类和含量上仍有一定差异。其中，肉桂醛（cinnamaldehyde，CA）被认为是该植物的代表性成分，通常以反式肉桂醛（transcinnamaldehyde，TCA）存在于肉桂挥发油中，是《中国药典》中肉桂和桂枝药材的标示成分，为浅黄色油状液体，具有抗炎、解热镇痛、抗肿瘤、降糖等药理活性。除肉桂醛外，2′-羟基肉桂醛（2′-hydroxycinnamaldehyde，HCA）、2′-苯甲酰氧肉桂醛（2′-benzoyloxycinnamaldehyde，BCA）等也具有良好抗炎活性。而对于肉桂的蛋白类激活性成分，利于多肽或者小分子肽的活性研究甚少。
发明内容
为解决或缓解上述部分技术问题，本发明提供了一种延缓端粒长度缩短的衍生肽，其通过来源于肉桂的多肽进行脂化得到，具有应用于抗衰老和抗癌领域的前景。为此，本发明至少公开了以下技术方案：
第一方面，一种延缓端粒长度缩短的衍生肽，选自CH3-(CH2)8-YALYTAFGQ-CONH2、CH3-(CH2)8-VRWLAVHG-CONH2和CH3-(CH2)8-YLQYRRGD-CONH2中的至少一项，其中，多肽YALYTAFGQ、VRWLAVHG和YLQYRRGD来自于肉桂（Cinnamomum aromaticum）籽。
在一些实施例中，所述衍生肽是将YALYTAFGQ、VRWLAVHG和YLQYRRGD中的至少一项分别进行脂化得到的脂肽。
第二方面，本发明公开了第一方面所述的衍生肽的制备方法，包括：
获取肉桂籽粉，用石油醚脱脂处理；
取肉桂籽脱脂粉经碱液处理和酸液处理，得到肉桂籽粗蛋白；
将肉桂籽粗蛋白经酶解处理和纯化，得到多肽YALYTAFGQ、VRWLAVHG和YLQYRRGD；
将多肽YALYTAFGQ、VRWLAVHG和YLQYRRGD分别与正癸酸反应，收集反应物，纯化得到所示衍生肽。
在一些实施例中，所述酶解的步骤包括：
将所述肉桂籽粗蛋白粉经酸性蛋白酶、蛋白酶K和无花果蛋白酶酶解。
在一些实施例中，所述肉桂籽粗蛋白粉经酸性蛋白酶的步骤包括：
配置含有5%(w/v)的肉桂籽粗蛋白粉溶液，用1M盐酸水溶液调节pH至3.5，加入酸性蛋白酶，于40℃水浴酶解4h后，100℃灭酶10min，10000rpm离心5min，取上清液，过滤，冷冻干燥，得到第一酶解粉。
在一些实施例中，经所述蛋白酶K酶解的步骤包括：
取所述第一酶解粉分散在0.05mM氯化钠溶液中，加入蛋白酶K，置于水浴37℃酶解3h，100℃灭酶10min，10000rpm离心5min，取上清液，过滤，冷冻干燥，得到第二酶解粉。
在一些实施例中，经所述无花果蛋白酶酶解的步骤包括：
取所述第二酶解粉溶解在去离子水中，加入无花果蛋白酶，，置于水浴37℃酶解0.5h，100℃灭酶10min，10000rpm离心5min，取上清液，过滤，冷冻干燥，得到第三酶解粉。
第三方面，本发明公开了一种端粒长度调节剂，包含第一方面所述的衍生肽。
第四方面，本发明公开了第一方面所述的衍生肽在制备抗衰老药物中的应用。
第五方面，本发明公开了第一方面所述的衍生肽在制备抗癌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点及积极效果至少如下：
本发明通过对市售的肉桂籽进行脱脂、碱液提取和酸液提取，并继续进行酶解和纯化，得到四种寡肽A1~A4。其中A1~A3经过细胞实验和动物实验证实对LO2细胞无毒性作用，能够缩短细胞端粒缩短速度，对抗氧化应激作用，提高端粒酶逆转录因子（c-Myc）和端粒酶逆转录酶（TERT）活性，延缓端粒磨损。
本发明进一步将四种寡肽A1~A3进行脂化，发现缩短细胞端粒缩短、抗氧化应激作用和延缓端粒磨损作用均强于寡肽A1~A3。
本发明还进行了动物实验证实了，该寡肽A1~A3的衍生肽能够较佳地保持小鼠外周血白细胞端粒长度，并保护小鼠肝脏细胞对抗衰老。
另外，本发明还通过细胞实验发现，寡肽A1~A3及其衍生肽能够促使A549细胞活性降低，并破坏该细胞的细胞膜，提示其具有抑制或者杀灭肺癌细胞的作用。
附图说明
图1为本发明提供的寡肽A1~A4的质谱图。
图2为本发明提供的寡肽B1~B2的质谱图。
图3为本发明提供的脂肽A1-C10~A4-C10的质谱图。
图4为本发明提供的寡肽B1-C10~B2-C10的质谱图。
图5为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10对LO2细胞的细胞活力实验结果图。
图6为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10对LO2细胞的细胞相对端粒长度实验结果图。
图7为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10对LO2细胞的GSH-Px实验结果图。
图8为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10对LO2细胞的CAT实验结果图。
图9为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10对LO2细胞的SOD实验结果图。
图10为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10对LO2细胞的ROS实验结果图。
图11为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10对LO2细胞的MDA实验结果图。
图12为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10对LO2细胞的c-Myc实验结果图。
图13为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10对LO2细胞的TERT实验结果图。
图14为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10对A549细胞的细胞存活率实验结果图。
图15为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10对A549细胞的细胞LDH释放率实验结果图。
图16为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10作用衰老模型小鼠外周血白细胞的相对端粒长度实验结果图。
图17为本发明提供的寡肽A1~A4、寡肽B1~B2、脂肽A1-C10~A4-C10和脂肽A1-C10~A4-C10作用衰老模型小鼠肝脏组织的阳性信号颗粒实验结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
1、肉桂籽脱脂粉的制备：
市售肉桂籽药材，粉碎，过60目筛，得肉桂籽粉。取适量肉桂籽粉，加5倍量的石油醚，室温下搅拌24h后，离心后取沉淀，重复三次后，将离心所得沉淀，置于通风橱挥干溶剂后，用粉碎机粉碎，过60目筛，于4℃冰箱中贮藏备用。
2、肉桂籽粗蛋白的提取
取肉桂籽脱脂粉100g，用20倍量蒸馏水，用1mol/LNaOH调节PH至pH=10，50℃水浴，搅拌提取50min，离心取上清，上清液用1mol/LHCl调节pH值至4.5，离心取沉淀，沉淀用蒸馏水溶解，透析，冷冻干燥，得到肉桂籽粗蛋白。
3、酶解
一个实施例1提供的酶解步骤包括：
（1）配置含有5%(w/v)的肉桂籽粗蛋白粉溶液（其中含有0.05M的氯化镁），用1M盐酸水溶液调节pH至3.5，取5L，加入20000U的酸性蛋白酶（50u/mg，S10012-250g，AcidicProtease），于40℃水浴酶解4h后，100℃灭酶10min，10000rpm离心5min，取上清液，过滤，冷冻干燥，得到第一酶解粉。
（2）取第一酶解粉500mg，分散在0.05mM的500ml氯化钠溶液中，加入3g蛋白酶K（用去离子水配制成600mU/ml溶液加入，货号70663，Millipore），置于水浴37℃酶解3h，100℃灭酶10min，10000rpm离心5min，取上清液，过滤，冷冻干燥，得到第二酶解粉345mg。
（3）取第二酶解粉300mg，溶解在500ml去离子水中，加入200mg无花果蛋白酶（≥1.0 units/mg，F6008，Sigma-Aldrich，用去离子水配制成10mU/ml溶液加入），置于水浴37℃酶解0.5h，100℃灭酶10min，10000rpm离心5min，取上清液，过滤，冷冻干燥，得到第三酶解粉236mg。
在一个对比例中，经采用了如上述步骤（1）的步骤进行了3次酶解，均采用酸性蛋白酶处理，同样得到第三酶解粉125mg。
4、纯化
精密称取第三酶解粉溶解于去离子水中配置成10 mg/ml。采用截留分子量(MWCO)分别为10 kDa超滤离心管（Millipore，默克公司）超滤，取滤液10000rpm离心5min，取上清液再次进行截留分子量(MWCO)分别为3kDa超滤离心管（Millipore，默克公司）进行超滤，取滤液4500 rpm离心30 min，重复稀释洗涤截留液3次，冷冻干燥，得到粗纯品。
称取25g琼葡糖凝胶G15(分离分子量100~1500，货号BTR209Q，bersee博尔西），加入500m去离子水，搅拌均匀，室温溶胀72h，去除上层未沉淀颗粒，装入1.6×60cm的玻璃层析柱中，静置1h，用纯水洗脱至平衡。将超滤分离所得的粗纯品用去离子水配制成20mg/ml的样品溶液，经过0.45µm微孔滤膜过滤，上样量3ml，流速为0.5ml/min，利用自动部位收集器对洗脱液进行收集，每2min收集一管，在220nm下测定吸光度，根据收集管和吸光度制作洗脱曲线，根据洗脱峰合并收集管，并对收集管进行冷冻干燥。其中，实施例1共得到4个组分A1~A4，对比例1共得到2给组分B1~B2。
6、A1~A4组分和B1~B2组分的中各组分分子量测定
称取人血管紧张素II(1360 Da，CAS：4474-91-3，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司)、甲硫氨酸脑啡肽（573.66 Da，CAS：58569-55-4，上海源叶生物科技有限公司）、谷胱甘肽(307 Da，CAS：70-18-8，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司)适量，用去离子水分别配置成10mg/mL标准溶液。分别上样3mL，记录最大吸收峰出现时的洗脱体积，洗脱体积与相对分子质量对数(1gMW)绘制分子量分布标准曲线。标准曲线经拟合所得标准方程为：y=-10.034x+93.62，R2=0.9843。
组分A1~A4用去离子水配制成20mg/mL的样品溶液，经过0.45µm微孔滤膜过滤，上样量3mL，记录不同洗脱峰的洗脱体积，并代入分子量标准曲线中计算出洗脱峰大致分子量范围。经过计算得知A1的分子量大致为1000~1100Da，A2的分子量大致为900~1100Da，A3的分子量大致为900~1100Da，A4的分子量大致为1400~1500Da。B1的分子量大致为1000~1200Da。B2的分子量大致为1400~1500Da。
7、UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS质谱鉴定氨基酸序列
组分A1~A4溶于超纯水中，配置成2mg/mL的样品溶液，过0.22µm微孔滤膜，进行UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS质谱分析。采用沃特世Waters CORTECS UPLC C18 色谱柱(1.6 µm，2.1 mm×100 mm,)，流动相A相为乙睛，流动相B相为含0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序为0~15min，93→70%B；15-25min，70→20%B；25-35min，20%B；35-36min，20→93%B；36-45min，93%B。流速为0.2mL/min，柱温45℃，进样量10µL。采用ESI离子化方式，雾化温度550℃，碰撞能为45V，质量扫描范围50-2000m/z，正离子模式采集数据。数据采集完成后，利用其一级与二级质谱信息，结合PEAKSStudio软件对多肽的氨基酸序列进行分析。结果图1所示，A1~A4的分子量依次为1033.132Da、937.108Da、1070.158Da、1407.77Da。如图2所示，B1~B2的分子量依次为 1129.206Da和 1419.568Da。
借助PEAKS Studio软件对质谱采集得到的数据进行解析，通过DB serach对Uniprot angelica sinensis 202103进行数据库（例如NCBI）搜索，匹配结果采用101gP可信度最大序列。结果依次可知，A1~A4的氨基酸序列依次为A1: YALYTAFGQ（SEQ ID NO.1所示，参考序列>QMQ98743.1），A2:VRWLAVHG（SEQ ID NO.2所示，参考序列>QMQ98745.1），A3:YLQYRRGD（SEQ ID NO.3所示，参考序列>QMQ98746.1），A4:RLIRRRGRIIV（SEQ ID NO.4所示，参考序列>QMQ98747.1）。B1: SALHSSSFFF（SEQ ID NO.5所示，参考序列>QMQ98740.1），B2:SCVRNGLNKESRG（SEQ ID NO.6所示，参考序列>QMQ98737.1）。
8、组分A1~A4和组分B1~B2改性成脂肽
分别取组分A1~A4和组分B1~B2分别取0.5g放入不同的5mL EP管中。分别称取HATU(0.22g)、HOBT(0.059g)和正癸酸(0.10g，CAS：334-48-5纯度：>99%，南京东德化工科技有限公司)，分别溶解于800µL5%N-甲基吗啉-DMF混合液，然后将HATU和HOBT溶液加入含正癸酸溶液的5mL EP管中，用旋转混匀器混匀。将混合溶液加入反应柱里，混匀反应2h。用DMF多次洗涤(2mL/次)，再用甲醇洗涤8次(约2mL/次)，边洗涤边抽干。配制10mL含90%TFA、5%苯甲硫醚、3%二巯基乙烷、2%苯甲醚的裂解液，加入反应柱中进行裂解，反应2.5h。反应结束后收集裂解液，加入40mL冰乙醚重结晶，用低温离心机离心3min，弃上清液，再加入35mL冰乙醚离心3min。自然风干，收集得到白色固体沉淀，即为组分A1~A4和组分B1~B2改性成的脂肽。
9、脂肽的分离纯化及质谱分析
用双蒸水溶解合成所得到的粗品，用冷冻高速离心机以10000rpm离心3min并过滤。用C18RP-HPLC(C18反相柱，LAGV-17126-054630，50×4.6mm，2.6µm)进行分离纯化。洗脱流速为1mL/min，流动相A相 为含0.1% TFA的水溶液，流动相B相为含0.1% TFA的乙腈溶液。洗脱程序为：0~5min，20%B；5-35min，20→90%B；35-40min，90%B；40-40.1min，90→10%B；40.1-45min，10%B。在25℃下，280nm处监测并收集所有色谱峰。通过质谱确定所收集的色谱峰的相对分子质量，与目标产物相对分子质量比对，确定目的峰。将所得样品放入-80℃冰箱冷冻，然后放入冷冻干燥机中冻干，得到白色粉末状样品，再将所得样品分装到1.5mLEP管中，置于-20℃冰箱，以备后续实验使用。
称取10mgα-氰基-4-羟基肉桂酸(CCA)溶于1mL含50%乙腈(含0.1%TFA)和50%双蒸水(含0.1%TFA)的混合液中，配置浓度为10mg/mL的基质饱和溶液。待固体完全溶解后，12000rpm离心10min取上清液。取0.5µL待测样品滴于质谱点样板，自然风干后，再取0.5µL基质溶液覆盖在样品上，待自然风干后，采用MALDI-TOFMS检测样品的相对分子量。结果如表1所示，
表1
| 名称 | 序列 | Mw |
| A1-C10 | CH3-(CH2)8-YALYTAFGQ-CONH2 | 1203.056 |
| A2-C10 | CH3-(CH2)8-VRWLAVHG-CONH2 | 1107.123 |
| A3-C10 | CH3-(CH2)8-YLQYRRGD-CONH2 | 1240.115 |
| A4-C10 | CH3-(CH2)8-RLIRRRGRIIV-CONH2 | 1577.431 |
| B1-C10 | CH3-(CH2)8-SALHSSSFFF-CONH2 | 1297.175 |
| B2-C10 | CH3-(CH2)8-SCVRNGLNKESRG-CONH2 | 1589.317 |
9、细胞实验
（1）抗衰老细胞实验
体外实验中，利用叔丁基过氧化氢（t-BHP，458139，Sigma-Aldrich）处理LO2细胞（购自中国科学院上海细胞库）制备衰老细胞模型，检测不同浓度t-BHP干预6h后的细胞活力，选择细胞活力抑制率为50%时对应的t-BHP浓度（40μmol/L）为最适建模浓度。使用组分A1~A4和组分B1~B2，以及该六种组分对应的衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10、A4-C10、B1-C10和B2-C10分别以1μg/ml干预LO2细胞24h，。如图5所示，各多肽及衍生肽对LO2细胞活性无影响，即对其生长无毒性作用。实验分组为正常组、模型组（t-BHP）、多肽组（A1、A2、A3、A4、B1和B2）和衍生多肽组（A1-C10、A2-C10、A3-C10、A4-C10、B1-C10和B2-C10）。
qPCR法为相对端粒长度测量的常用方法，对药物干预后的各组小鼠外周血白细胞和LO2细胞提取DNA进行PCR扩增，以36B4为内参检测指标基因TeLo的相对表达量即可反应细胞中的相对端粒长度，每个样本重复检测三次，利用2-△△Ct法计算基因相对表达量。其中，内参基因36B4-F: cagcaagtgggaaggtgtaatcc，SEQ ID NO.7所示；36B4-R:cccattctatcatcaacgggtacaa，SEQ ID NO.8所示。检测指标基因TeLo-F: cggtttgtttgggtttgggtttgggtttgggtt，SEQ ID NO.9所示；TeLo-R: ggcttgccttacccttacccttacccttaccct，SEQ ID NO.10所示。实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析。结果如图6所示，图中，“＊”表示与模型组相比具有统计学显著差异（P<0.01），例如多肽A1、A2和A3相对分别与模型组相比，其相对端粒长度均显著升高；例如衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10相对分别与模型组相比，其相对端粒长度均显著升高。“#”表示，多肽A1分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或者多肽A2分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或多肽A3分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A1-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A2-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A3-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01）。“&”表示，衍生肽A1-C10与多肽A1相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A2-C10与多肽A2相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A3-C10与多肽A3相比均具有统计学显著差异（P<0.05）。
氧化应激检测试剂盒（碧云天）检测抗氧化酶活性和氧化应激代谢产物水平各组小鼠和LO2细胞经相应干预处理后，按照试剂盒说明书操作，于酶标仪检测并计算小鼠组织匀浆和LO2细胞抗氧化酶GSH-Px、CAT和SOD活性以及氧化应激代谢产物ROS和MDA生成水平。实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析。如图7~11所示，多肽A1、A2、A3和衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10均相对于模型组能够显著提升LO2细胞GSH-Px、CAT和SOD活性，降低LO2细胞ROS和MDA生成水平，衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10分别对应相对于多肽A1、A2、A3仍然能够提升LO2细胞GSH-Px、CAT和SOD活性，降低LO2细胞ROS和MDA生成水平。其中，“＊”表示与模型组相比具有统计学显著差异（P<0.01）。“#”表示多肽A1分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或者多肽A2分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或多肽A3分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A1-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A2-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A3-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01）。“&”表示，衍生肽A1-C10与多肽A1相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A2-C10与多肽A2相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A3-C10与多肽A3相比均具有统计学显著差异（P<0.05）。
Western蛋白印迹法检测蛋白表达水平LO2细胞经相应干预处理后，提取总蛋白并测定其浓度，以每组40μg的蛋白上样量进行电泳，转膜、封闭后孵育一抗（1∶1000），室温孵育二抗（1∶3000），于化学发光成像系统进行显影曝光，利用ImageJ软件对灰度值进行计算分析。实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析。如图12~13所示，多肽A1、A2、A3和衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10均相对于模型组能够显著提升LO2细胞c-Myc和TERT相对表达量，衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10分别对应相对于多肽A1、A2、A3仍然能够提升LO2细胞c-Myc和TERT相对表达量。其中，“＊”表示与模型组相比具有统计学显著差异（P<0.01）。“#”表示多肽A1分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或者多肽A2分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或多肽A3分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A1-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A2-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A3-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01）。“&”表示，衍生肽A1-C10与多肽A1相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A2-C10与多肽A2相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A3-C10与多肽A3相比均具有统计学显著差异（P<0.05）。
由此抗衰老细胞实验结果表明，多肽A1、A2、A3和衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10均对细胞无毒性作用，并且能够缩短细胞端粒缩短速度，对抗氧化应激作用，提高端粒酶逆转录因子（c-Myc）和端粒酶逆转录酶（TERT）活性，延缓端粒磨损。而衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10对细胞抗氧化应激作用，提高端粒酶活性及延缓端粒磨损作用显著高于多肽A1、A2、A3。由此表明，本发明提供的衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10具有抗衰老作用。
（2）抗癌细胞实验
采用CCK-8法检测多肽（A1、A2、A3、A4、B1和B2）和衍生多肽（A1-C10、A2-C10、A3-C10、A4-C10、B1-C10和B2-C10）对A549细胞增殖的影响。具体步骤如下：
将A549细胞（货号：CL-0016，武汉普诺赛）浓度培养至80-90%，收集细胞并计数，准备接种。将生长密度及状态良好的细胞用培养基稀释到适当浓度，取100µL(约1×104个细胞)细胞悬浮液加入到96孔板中，边缘孔用无菌水或PBS填充。在倒置显微镜下观察细胞生长和分布状况，再将其放置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育24h。待细胞密度达到80%左右时，分别向96孔板中的不同组别中加入100µL含2μM的多肽（A1、A2、A3、A4、B1和B2）和衍生多肽（A1-C10、A2-C10、A3-C10、A4-C10、B1-C10和B2-C10）溶液的培养基，并分别放置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育24小时。并将无细胞悬液孔作为空白组，而有细胞不加药孔作为对照组，每组设置3组重复。每孔加入10µLCCK-8溶液，继续孵育4h后，使用酶标仪在450nm处测定各孔的吸收值，重复孔取平均OD值。根据公式计算：细胞存活率百分比(%)=(加药细胞OD值-空白OD值/对照细胞OD值-空白OD值)×100%。实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析。结果如图14所示，多肽A1、A2、A3和衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10均相对于对照组能够显著降低A549细胞的细胞活性，衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10分别对应相对于多肽A1、A2、A3仍然能够降低A549细胞的细胞活性，说明本发明提供的衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10还具有抑制癌细胞生长的作用。其中，“＊”表示与对照组相比具有统计学显著差异（P<0.01）。“#”表示多肽A1分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或者多肽A2分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或多肽A3分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A1-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A2-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A3-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01）。“&”表示，衍生肽A1-C10与多肽A1相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A2-C10与多肽A2相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A3-C10与多肽A3相比均具有统计学显著差异（P<0.05）。
将A549细胞接种于96孔板中，放置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育24小时。加入100µL含2μM的多肽（A1、A2、A3、A4、B1和B2）和衍生多肽（A1-C10、A2-C10、A3-C10、A4-C10、B1-C10和B2-C10）溶液的培养基再孵育24h后，将50 µL反应混合液(编号: C0016，乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，碧云天，按照试剂盒说明书配制)加入到每个孔中，在25℃下反应30分钟，然后加入50µL终止溶液。未加样品的孔作为空白对照组，用1% Triton X-100处理的孔(表示100% 乳酸脱氢酶释放)，作为阳性对照组。使用酶标仪在490 nm处测定各孔的OD值。根据所得数据进行计算，LDH释放率(%)=(加药组OD值一空白组OD值/标准组OD值一标准空白组OD值)\标准品浓度(mU/mL)。实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析。结果如图15所示，多肽A1、A2、A3和衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10均具有LDH释放率，而且衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10的LDH释放率分别高于多肽A1、A2、A3的LDH释放率，说明本发明提供的衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10能够破坏癌细胞的细胞膜，从而实现杀灭癌细胞的作用。其中，“#”表示多肽A1分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或者多肽A2分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或多肽A3分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A1-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A2-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A3-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01）。“&”表示，衍生肽A1-C10与多肽A1相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A2-C10与多肽A2相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A3-C10与多肽A3相比均具有统计学显著差异（P<0.05）。
10、体内实验
（1）实验动物
5周龄昆明雄性小鼠，体重（18±2）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。动物于温度20~25℃，相对湿度65%～70％，明暗交替周期为12h，通风良好的环境中饲养。
（2）模型构建和实验分组
通过持续6周皮下注射80mg/kg D-半乳糖制备衰老小鼠模型，第6周末，小鼠出现反应迟缓，活动量减少，毛发枯黄无光泽，精神萎靡等现象，表明衰老模型构建成功。将5周龄雄性昆明小鼠随机分为正常组，模型组、阳性组、多肽组（A1、A2、A3、A4、B1和B2）和衍生多肽组（A1-C10、A2-C10、A3-C10、A4-C10、B1-C10和B2-C10）。除正常组外，其余四组均进行建模处理，待模型构建成功后，给予阳性组维生素E 100mg（/kg·d）、多肽组和衍生多肽组20ml（/kg·d）持续8周每日灌胃相应剂量的供试品，模型组灌胃等量无菌生理盐水。
实验8周抽取小鼠外周血采用上述相同的qPCR检测其中白细胞相对端粒长度。实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析。结果如图16所示，图中，“＊”表示与模型组相比具有统计学显著差异（P<0.01），例如多肽A1、A2和A3相对分别与模型组相比，其相对端粒长度均显著升高；例如衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10相对分别与模型组相比，其相对端粒长度均显著升高。“#”表示，多肽A1分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或者多肽A2分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或多肽A3分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A1-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A2-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01），或衍生肽A3-C10分别与多肽A4、B1、B2相比均具有统计学显著差异（P<0.01）。“&”表示，衍生肽A1-C10与多肽A1相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A2-C10与多肽A2相比均具有统计学显著差异（P<0.05），或衍生肽A3-C10与多肽A3相比均具有统计学显著差异（P<0.05）。
剖取肝脏制备成10%组织匀浆。小鼠肝脏组织切片染色检测β-gal活性剖取药物干预后的各组小鼠肝脏组织，利用多聚甲醛固定24h，以蔗糖浸泡过夜后制备冰冻切片，经孵育液显色过夜，中性红复染后于油镜下观察各组切片蓝色阳性信号颗粒数量。实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析。结果如图17所示，多肽A1、A2、A3和衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10均相对于模型组能够显著降低蓝色信号颗粒数量，并且衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10的蓝色信号颗粒数量分别对应显著低于多肽A1、A2、A3，说明本发明提供的衍生肽A1-C10、A2-C10、A3-C10能够显著降低小鼠肝脏细胞衰老。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种延缓端粒长度缩短的衍生肽，其特征在于，选自CH3-(CH2)8-YALYTAFGQ-CONH2、CH3-(CH2)8-VRWLAVHG-CONH2和CH3-(CH2)8-YLQYRRGD-CONH2中的至少一项，其中，多肽YALYTAFGQ、VRWLAVHG和YLQYRRGD来自于肉桂（Cinnamomum aromaticum）籽。
2.根据权利要求1所述的衍生肽，其特征在于，所述衍生肽是将YALYTAFGQ、VRWLAVHG和YLQYRRGD中的至少一项分别进行脂化得到的脂肽。
3.权利要求1或2所述的衍生肽的制备方法，其特征在于，包括：
获取肉桂籽粉，用石油醚脱脂处理；
取肉桂籽脱脂粉经碱液处理和酸液处理，得到肉桂籽粗蛋白；
将肉桂籽粗蛋白经酶解处理和纯化，得到多肽YALYTAFGQ、VRWLAVHG和YLQYRRGD；
将多肽YALYTAFGQ、VRWLAVHG和YLQYRRGD分别与正癸酸反应，收集反应物，纯化得到所示衍生肽；
其中，所述酶解的步骤包括：将所述肉桂籽粗蛋白粉经酸性蛋白酶、蛋白酶K和无花果蛋白酶酶解；
所述肉桂籽粗蛋白粉经酸性蛋白酶酶解的步骤包括：配置含有5%(w/v)的肉桂籽粗蛋白粉溶液，用1M盐酸水溶液调节pH至3.5，取5L加入20000U的酸性蛋白酶，于40℃水浴酶解4h后，100℃灭酶10min，10000rpm离心5min，取上清液，过滤，冷冻干燥，得到第一酶解粉；
经所述蛋白酶K酶解的步骤包括：取500mg所述第一酶解粉分散在0.05mM、500mL氯化钠溶液中，加入3g蛋白酶K，置于水浴37℃酶解3h，100℃灭酶10min，10000rpm离心5min，取上清液，过滤，冷冻干燥，得到第二酶解粉；
经所述无花果蛋白酶酶解的步骤包括：取300mg所述第二酶解粉溶解在500mL去离子水中，加入200mg无花果蛋白酶，置于水浴37℃酶解0.5h，100℃灭酶10min，10000rpm离心5min，取上清液，过滤，冷冻干燥，得到第三酶解粉；
其中，所述纯化的步骤包括：
用去离子水配制含10 mg/ml的所述第三酶解粉溶液，采用截留分子量为10 kDa的超滤离心管超滤，取滤液10000rpm离心5min，取上清液再次采用截留分子量分别为3kDa超滤离心管进行超滤，取滤液4500 rpm离心30 min，重复稀释洗涤截留液3次，冷冻干燥，得到粗纯品；
称取25g琼葡糖凝胶G15，加入500m去离子水，搅拌均匀，室温溶胀72h，去除上层未沉淀颗粒，装入1.6×60cm的玻璃层析柱中，静置1h，用纯水洗脱至平衡；
用去离子水配制成含20mg/ml所述粗纯品的样品溶液，经过0.45µm微孔滤膜过滤，上样所述层析柱，上样量3ml，流速为0.5ml/min，利用自动部位收集器对洗脱液进行收集，每2min收集一管，在220nm下测定吸光度，根据收集管和吸光度制作洗脱曲线，根据洗脱峰合并收集管，并对收集管进行冷冻干燥。
4.一种延缓端粒长度缩短的制剂，其特征在于，包含权利要求1或2所述的衍生肽。
5.权利要求1或2所述的衍生肽在制备抗衰老药物中的应用。
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- 2023-03-27 CN CN202310305561.1A patent/CN116854774B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116854774A (zh) | 2023-10-10 |
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