CN115572321A - 一种酵母肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种酵母肽及其制备方法和应用。本发明提供的酵母肽含有如下序列肽段:苯丙氨酸‑缬氨酸‑丙氨酸‑亮氨酸‑脯氨酸,缬氨酸‑亮氨酸‑异亮氨酸‑亮氨酸‑赖氨酸和丙氨酸‑甘氨酸‑亮氨酸‑苏氨酸‑亮氨酸。本发明提供的具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性和体内降血压活性。
Description
技术领域
本发明属于食品和药品技术领域,具体涉及到一种可以降血压的酵母肽的制备,以及该肽具体的降血压效果。
背景技术
高血压(收缩压≥140mmHg,舒张压≥90mmHg)是一种常见的心血管疾病,据WHO报道,在中国超过2.7亿人口患有高血压,但只有13.8%的患者得到科学有效的控制。高血压容易引发中风、肾功能衰竭、失明、心肌梗死和脑梗死等疾病。所以高血压的预防和治疗对社会的健康发展具有重要意义。人体血压的调节是通过抑制复杂的机制进行的,涉及到多个相互关联的代谢路径。其中最重要的调节机制是肾素血管紧张素系统和激肽酶激肽系统。血管紧张素转化酶(ACE)在其中其重要作用,ACE可以将非活性形式的血管紧张素I(AngI)转换为具有血管收缩效果的血管紧张素II(Ang II),并使血管舒张肽缓激肽失活。所以ACE抑制剂是在临床中常见的治疗高血压的药物。
现有的ACE抑制剂如赖诺普利等合成药物会导致过敏、头晕和肝毒性等副作用,并且不能用于高血压的预防和轻症患者的治疗。而天然的ACE抑制肽由于其来源广泛、天然低毒等特点,受到研究者的关注。并且近期的研究发现,ACE抑制肽不仅能够通过抑制ACE的活性起到降血压作用,还能够通过缓解机体氧化应激和调节血管内皮质功能等途径,起到降血压作用。此外,大量的研究表明,肠道微生物对宿主的代谢平衡具有重要作用。宿主肠道微生物的改变对高血压、糖尿病、肥胖、高尿酸血症等疾病的发生与改善具有显著影响。未被肠道吸收的食源性蛋白质水解物会调节肠道微生物的组成,进而影响宿主的代谢。有研究表明食源性蛋白水解物可以通过调节肠道微生物的组成,从而促进血压的调节。因此,具有ACE抑制活性、体内抗氧化活性和调节肠道微生物作用的食源性蛋白质水解物具在高血压的预防和治疗中具有巨大潜力。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足,提供一种酵母肽的制备及其应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
一种酵母肽,其特征在于含有如下序列肽段:(苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸)FVALP,(缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸)VLILK,(丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-亮氨酸)AGLTL。
本发明提供一种酵母肽,所述酵母肽含有如下肽:
第一肽:苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸,
第二肽:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸,
和,第三肽:丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-亮氨酸。
优选地,所述酵母肽中第一肽、第二肽和第三肽的质量比为0.3-1:0.3-1:0.3-1;
优选地,所述酵母肽中第一肽、第二肽和第三肽的质量比为0.3-0.5:0.3-0.9:0.5-1。
本发明还提供所述的酵母肽的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:将脱除核酸后的酵母乳利用第一酶使蛋白酶解,分离得到的轻相即为酵母肽,
或将脱除核酸后的酵母乳利用第二酶使细胞壁酶解,分离重相后利用第三酶进行酶解,分离得到的轻相即为酵母肽。
优选地,调节脱除核酸后的酵母乳的pH为8-9,然后利用第一酶进行酶解;
或者,调节脱除核酸后的酵母乳的pH为5-6,然后利用第二酶进行酶解。
优选地,所述制备方法还包括利用膜分离对酵母肽进行纯化。
优选地,所述制备方法还包括利用喷雾干燥或冷冻干燥处理得到粉末状酵母肽。
优选地,以干物质质量计,所述第一酶与脱除核酸后的酵母乳干重的质量比为0.1~0.5%,优选为0.2%-0.3%;
本发明中的脱核酸后的酵母乳可以是发酵完脱核酸的酵母乳,也可以是脱核酸酵母粉加水复配而成,质量浓度为8~15%。
优选地,所述第一酶为嗜热杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物;
优选地,所述第一酶为质量比为1:1的嗜热杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶;
或者优选地,所述第一酶为中性蛋白酶Protin SD-NY 10,或中性蛋白酶ProteaseA 2SD。
优选地,以干物质质量计,所述第二酶与脱除核酸后的酵母乳的质量比为0.1%~1%,优选为0.3%-0.5%;
优选地,所述第二酶为β-葡聚糖酶,甘露聚糖酶或纤维素酶。
优选地,所述第三酶与脱除核酸后的酵母乳的质量比为0.1%~0.5%,优选为0.2%-0.3%;
优选地,所述第三酶为嗜热杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物,或复合蛋白酶(Protin SD-NY),或中性蛋白酶(Protease A 2SD);
优选地,所述第三酶为质量比为1-2:1-2的嗜热杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物。
本发明还提供一种肽,所述肽含有如下序列:苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸。
本发明还提供一种肽,所述肽含有如下序列:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸。
本发明还提供一种肽,所述肽含有如下序列:丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-亮氨酸。
本发明还提供所述的酵母肽或所述的制备方法制备得到的酵母肽或所述的肽在制备血管紧张素转化酶抑制剂、抗氧化剂、降血压剂或调节肠道微生物剂的产品中的应用。
优选地,所述产品为药品、食品或保健品。
本发明还提供一种抑制血管紧张素转化酶活性产品,所述产品中含有所述的酵母肽或所述的制备方法制备得到的酵母肽或所述的肽。
优选地,所述产品中所述的酵母肽或所述的制备方法制备得到的酵母肽或所述的肽的含量为65~85wt%。
在本发明中,利用上述方法得到的酵母肽,在体外对ACE具有显著抑制作用,IC50为0.082mg/mL。
为验证酵母肽的体内降血压作用,通过原发性高血压大鼠(SHR)急性灌胃实验和为期四周的灌胃实验进行验证。
经研究表明,经上述技术方案得到的酵母肽,具有显著的体内降血压效果,其通过如下途径实现降血压效果:抑制SHR体内ACE的活性,并降低血清Ang II的水平;改善SHR的氧化应激,提高ACE2和血管紧张素2型受体(AT2R)的表达水平,降低血管紧张素1型受体(AT1R)的表达水平;提高肠道短链脂肪酸水平,改善因高血压导致的肠道微生物紊乱。
本发明获得食用酵母经复合蛋白酶水解制备的具有降血压效果的酵母肽及其制备方法,水解物作为预防和治疗高血压保健品和药物具有良好的潜力和应用前景。
附图说明
图1为酵母肽对ACE的IC50;
图2所示为酵母肽对SHR肾脏ACE2蛋白质表达水平的影响;注:*表示显著性差异(p<0.05),**表示显著性差异(p<0.01),***表示显著性差异(p<0.001);
图3所示为酵母肽对SHR肾脏AT1R蛋白质表达水平的影响;注:*表示显著性差异(p<0.05),**表示显著性差异(p<0.01),***表示显著性差异(p<0.001);
图4所示为酵母肽对SHR肾脏AT2R蛋白质表达水平的影响;注:*表示显著性差异(p<0.05),**表示显著性差异(p<0.01),***表示显著性差异(p<0.001);
图5所示为酵母肽对SHR肠道微生物的α多样性指数的影响,其中图5A所示为酵母肽对SHR肠道微生物Sobs指数的影响,图5B所示为酵母肽对SHR肠道微生物ACE指数的影响,图5C所示为酵母肽对SHR肠道微生物Shannon指数的影响,图5D所示为酵母肽对SHR肠道微生物Simpson指数的影响;
图6所示为酵母肽对SHR肠道中厚壁菌门与拟杆菌门比值(F/B)的影响。
具体实施方式
本发明提供一种酵母肽,所述酵母肽含有如下肽:第一肽:苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸,第二肽:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸,和,第三肽:丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-亮氨酸。
在本发明提供的一种具体实施方式中,所述酵母肽的制备方法包括以下步骤:
步骤1:食用酵母乳提取核酸,收集脱核酸后的酵母乳或者将食用脱核酸酵母粉加水得到酵母乳;
步骤2:脱核酸后的酵母乳定向酶解蛋白;
步骤3:离心,轻相即为酵母肽,也可进一步膜分离纯化。
步骤4:为易于保存,上述轻相或膜分离透过液可进一步喷雾干燥或冷冻干燥处理得到粉末状酵母肽。
其中,用于本发明中的脱核酸后的酵母乳可以是任意常规食用级别的脱除核酸后的酵母乳或者任意常规方法脱除核酸的酵母粉加水复配得到的酵母乳,也可以是直接商购的任意常规食用级别的脱除核酸的酵母粉加水复配得到的酵母乳。
在本发明提供的一种具体实施方式中,所述酵母肽的制备方法包括以下步骤:
步骤1:食用酵母乳提取核酸,收集脱核酸后的酵母乳;
步骤2:脱核酸后的酵母乳定向酶解细胞壁,并离心;
步骤3:步骤2离心重相用蛋白酶酶解;
步骤4:步骤3离心分离,轻相即为酵母肽,也可进一步膜分离纯化。
步骤5:为易于保存,上述轻相或膜分离透过液可进一步喷雾干燥或冷冻干燥处理得到粉末状酵母肽。
在本发明的一种实施方式中,所述的第一酶可以采用本领域公知的中性蛋白酶。具体来说,本发明中例如可以采用商购的Protin SD-NY 10(阿玛诺天野酶制剂商贸(上海)有限公司出售)。
在本发明的一种实施方式中,所述第一酶可以采用本领域公知的中性蛋白酶酶。具体来说,本发明中例如可以采用商购的Protease A 2SD(阿玛诺天野酶制剂商贸(上海)有限公司出售)。
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
表1实验材料/仪器及生产厂商
实验动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司
实施例1、酵母肽的制备
取脱核酸酵母粉1kg,加入纯化水溶配成质量分数约10%的均匀溶液,调pH8.5,升温至温度75℃搅拌2h,离心取重相。重相加适量水分散后,调pH8.2,加入3g嗜热杆菌蛋白酶(Thermoase C)和木瓜蛋白酶(1:1)的混合物,酶解12h。离心取上清,即为酵母肽。冷冻干燥成粉末。
实施例2、酵母肽的制备
取脱核酸酵母粉1kg,加入纯化水溶配成质量分数约10%的均匀溶液,调pH7.5,升温至90℃保温2h,离心取重相;重相加适量水分散后,调pH5.5,加入4gβ-葡聚糖酶,酶解12h后离心取重相;重相加适量水分散后,调pH8.0,加入2g复合蛋白酶(Protin SD-NY 10),酶解10h。离心取上清,即为酵母肽。喷雾干燥成粉末。
实施例3、酵母多肽的鉴定
分别称取2微克实施例1和实施例2制备得到的样品,60min色谱梯度分离,ThermoOrbitrap-Lumos超高分辨率质谱仪检测。具体的仪器方法参数如下:高效液相色谱仪(EasynLC1200);色谱柱:C18,3μm,100A,75μm×15cm;上样量:2μg。流动相:A:0.1%Formic acidin water;B:0.1%Formic acid in 80%Acetonitrile/H2O。色谱梯度如下表2所示:
表2
质谱采集参数如下:质谱仪Orbitrap-Lumos,喷雾电压:2.0kV。毛细管温度:320℃,S-lens RF Level:40,碰撞能量:35%NCE,Isolation Window:1.2Da,分辨率设置:一级120,000@m/z 200,AGC Target 4e5,一级最大离子注入时间50ms,母离子扫描范围:m/z300-1500;分辨率设置:二级15,000@@m/z200,二级AG C Target 5e4,一级最大离子注入时间22ms,子离子扫描范围:start from m/z 110.
数据分析:样本的质谱数据用PEAKS Studio软件进行分析,分别用酵母物种的数据库(uniport-saccharomyces+cerevisiae.fasta)进行Peaks检索。检索的具体参数设置酶切方式为胰酶半酶切方式,一级母离子窗口为10ppm,二级离子窗口设置为0.05Da,漏切设为2,修饰设定为:C上固定Carbamidomethylation修饰,M上为可变Oxidation修饰,NQ设定为可变Deamidation修饰。
实施例1中得到的肽鉴定结果如下表3所示。实施例2中得到的肽鉴定结果如下表4所示。
表3
表4
如表3和表4所示实施例1和2中制备得到了如下序列肽段FVALP、AGLTL、VLILK。
实施例4、鉴定肽的ACE抑制活性方法
所鉴定的多肽通过BIOPEP活性肽数据库在线检索,分析其中已被收录的ACE(血管紧张素转化酶,降血压靶标)抑制肽。将肽库中的肽与ACE进行分子对接(对接软件Autodock4.2),通过对接得到的结合自由能ΔG(单位为kJ/mol)进行筛选,ΔG越低,肽可能对该靶标具有更高的抑制活性。
所鉴定的肽中,(苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸)FVALPΔG为-13.4KJ/mol,(缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸)VLILKΔG-13.22KJ/mol,(丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-亮氨酸)AGLTLΔG-12.73KJ/mol,为自由能相对较低且含量较高的肽。
对这三个肽进行体外化学合成,然后验证各肽的生物活性,具体方法如下:
用去离子水分别将三种化学合成的肽配置成不同的浓度。兔源的ACE用pH 8.3,0.1M的硼酸盐缓冲液配置成310mU的溶液。底物马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)用硼酸盐缓冲液配置成5mM的溶液。具体的测定方法为:10μL的ACE溶液与25μL的样品溶液(不同浓度的酵母水解物)加入到1.5mL的EP管中,在37℃孵育10min后,加入50μL的HHL溶液,在37℃反应1h。反应结束后加入0.5mL的HCl溶液(0.5M),反应液通过0.22μm的水相膜过滤后,通过高效液相色谱测定产物马尿酸。具体的高效液相条件为:25%的乙腈水溶液(含0.1%的三氟乙酸)作为流动相,流速为0.8mL/min,检测波长为228nm,柱温30℃,上样量10μL。ACE抑制率(X)按下式计算:
X=(A对照–A1)/A对照×100%
式中:X为ACE抑制率(%),A对照为空白对照马尿酸峰面积,A1为实验组马尿酸峰面积。
IC50的计算:IC50是抑制50%ACE活性时抑制剂的浓度,通过测定样品不同浓度时所对应的ACE抑制率获得。
检测结果如表5所示。如表5所示,本发明中的FVALP、VLILK和AGLTL均具有较好的ACE抑制活性,IC50都达到μM级示。尤其是浓度为0.15mg/mL时,抑制率达到最高。
表5合成肽的体外ACE抑制活性
实施例5、酵母肽的体外ACE抑制活性测定
将冻干的实施例2制备的酵母肽,用去离子水配置成不同的浓度。兔源的ACE用pH8.3,0.1M的硼酸盐缓冲液配置成310mU的溶液。底物马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)用硼酸盐缓冲液配置成5mM的溶液。具体的测定方法为:10μL的ACE溶液与25μL的样品溶液(不同浓度的酵母水解物)加入到1.5mL的EP管中,在37℃孵育10min后,加入50μL的HHL溶液,在37℃反应1h。反应结束后加入0.5mL的HCl溶液(0.5M),反应液通过0.22μm的水相膜过滤后,通过高效液相色谱测定产物马尿酸。具体的高效液相条件为:25%的乙腈水溶液(含0.1%的三氟乙酸)作为流动相,流速为0.8mL/min,检测波长为228nm,柱温30℃,上样量10μL。ACE抑制率(X)按下式计算:
X=(A对照–A1)/A对照×100%
式中:X为ACE抑制率(%),A对照为空白对照马尿酸峰面积,A1为实验组马尿酸峰面积。
IC50的计算:IC50是抑制50%ACE活性时抑制剂的浓度,通过测定样品不同浓度时所对应的ACE抑制率获得。
实验结果如图1所示,从图1可以看出随着肽浓度的增加,ACE的抑制活性也越来越强。0.15mg/mL时ACE抑制率约为63%,浓度再继续增加,抑制率增加不明显(0.295mg/mL时ACE抑制率约为73%)。
实施例6、酵母多肽体内降血压效果的测定
一、一次给药对原发性高血压大鼠的影响
实验材料信息:
取24只9周龄的清洁级雄性原发性高血压大鼠(SHR)随机分成四组,分别为模型组(Model),阳性对照组(Lisinopril)、实施例2制备得到的酵母肽低剂量组(YP-200)和实施例2制备得到的酵母肽高剂量组(YP-400)。再取6只清洁级9周龄的雄性Wistar大鼠为正常组(Normal control)。所有实验动物自由进食进水,环境为24±2℃,每日光照12h。动物运输后适应7天,期间通过尾动脉测压法测定血压。所有大鼠在测定血压前,在37℃环境预热15min。实验开始前记录各种大鼠的初始血压,各种给药情况如下:
1)正常组(Normal control):实验周期内每日灌胃同体积的生理盐水;
2)模型组(Model):实验周期内每日灌胃同体积的生理盐水;
3)阳性对照组(Lisinopril):实验周期内每日灌胃剂量为2.5mg/kg BW的赖诺普利(浙江华海药业股份有限公司);
4)酵母肽低剂量组(YP-200)组:实验周期内每日灌胃剂量为200mg/kg BW的酵母肽;
5)酵母肽高剂量组(YP-400)组:实验周期内每日灌胃剂量为400mg/kg BW的酵母肽。
上述所有试剂通过生理盐水进行溶解。对各组进行相应样品进行灌胃,通过尾动脉测压法分别测定灌胃后的第0、1、2、4、6、8h的收缩压(SBP)和舒张压(DBP),分别测定5次,结果取平均值,如表6和表7所示。
表6酵母肽一次给药对SHR收缩压的影响(mmHg)
注:同一组相对于0h的收缩压,*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示p<0.001。
表7酵母肽一次给药对SHR舒张压的影响(mmHg)
注:同一组相对于0h的舒张压,*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示p<0.001。
由表6和表7的结果可以看出,一次给药的急性实验结果表明,灌胃200和400mg/kgBW的酵母肽可以显著的降低SHR大鼠的收缩压和舒张压。YP-200组给药4h后收缩压和舒张压分别降低了12mmHg,YP-400组给药4h后收缩压和舒张压分别降低了17mmHg和16mmHg。说明更高剂量的酵母肽具有更强的急性降血压效果。
二、连续给药对原发性高血压大鼠的影响
完成一次给药的急性实验后,各组继续以相同的样品及剂量每天进行灌胃,持续灌胃4周,在第7、14、21、28天时,在前一次给药24h后测定各组大鼠的收缩压和舒张压,分别测定5次,结果取平均值,如表8和表9所示。
表8酵母肽连续给药对SHR收缩压的影响(mmHg)
注:同一组中相对于第0周的收缩压,*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示p<0.001;不同组相对于同一时间点模型组的收缩压,#表示p<0.05,##表示p<0.01,###表示p<0.001。
表9酵母肽连续给药对SHR舒张压的影响(mmHg)
注:同一组中相对于第0周的舒张压,*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示p<0.001;不同组相对于同一时间点模型组的舒张压,#表示p<0.05,##表示p<0.01,###表示p<0.001。
由表8和表9的结果可以看出,连续给药的实验证明,经连续4周给药200和400mg/kg BW的酵母肽后,相对于模型组的收缩压和舒张压都有显著降低,其中高剂量组第4周的收缩压和舒张压相对于第零周都有显著下降,分别下降了11mmHg和10mmHg,低剂量组第0周的收缩压和舒张压相对于第零周都有一定程度下降,但无显著性。研究表明血压降低10mmHg可以显著降低心血管疾病的风险。
综上所述,一次给药和连续给药的实验都证明,酵母肽具有作为降血压药物或功能保健食品的潜质。
实施例7、酵母多肽对SHR肾素-血管紧张素系统的影响
将实施例6中的模型组、阳性对照、YP-200组和YP-400组大鼠在实验结束后,空腹12h后取血,离心得到血清,之后按实验动物管理规定进行处死,解剖,取大鼠的肾脏、结肠以及肝脏,放入-80℃保存。
一、酵母肽对SHR体内ACE活性及Ang II含量的影响
第四周血清ACE活性的测定:根据酶活的定义,以HHL为底物,进行酶反应测定各组大鼠血清的ACE活性,结果如表8所示。
第四周血清Ang II含量的测定:通过ELISA试剂盒测定各组大鼠血清Ang II的含量,结果如表10所示。
表10酵母肽对SHR体内ACE活性及Ang II含量的影响
注:相对于模型组的血清ACE活性,#表示p<0.05,##表示p<0.01,###表示p<0.001;相对于模型组血清Ang II含量,*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示p<0.001。
由表10血清ACE活性及Ang II含量测定结果表明,SHR经连续4周给药200mg/kg和400mg/kg的酵母肽后,相对于模型对照,血清ACE活性出现显著下降,并进一步使血清AngII水平也显著下降,其中高剂量组效果更显著。表明酵母肽可通过抑制SHR的ACE的活性,降低Ang II的含量,从而实现血压降低。
二、酵母肽对肾素-血管紧张素系统(RAS)关键蛋白表达的影响
肾脏中关键蛋白表达水平的测定:适量的肾脏样品加入9倍质量RIPA,通过组织破碎仪进行破碎,然后以12000rpm的转速对破碎液离心,取上清,即为全蛋白提取液。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参蛋白,通过Western blotting测定肾脏组织破碎液中的血管紧张素转化酶2(ACE2)、血管紧张素1型受体(AT1R)和血管紧张素2型受体(AT2R)的相对蛋白水平。实验结果如图2-图4所示。从电泳结果可以看到,酵母多肽提高了ACE2和血管紧张素2型受体(AT2R)的表达水平(模型组、赖诺普利、酵母肽-200和酵母肽-400四组的ACE2/Actin比值分别为0.75,0.711,0.83,0.99;AT2R/Actin比值分别为0.69,0.56,0.70,0.94),降低血管紧张素1型受体(AT1R)的表达水平(模型组、赖诺普利、酵母肽-200和酵母肽-400四组的AT1R/Actin比值分别为0.975,0.925,0.735,0.755)。其中,图2所示为酵母肽对SHR肾脏ACE2蛋白质表达水平的影响;图3所示为酵母肽对SHR肾脏AT1R蛋白质表达水平的影响;图4所示为酵母肽对SHR肾脏AT2R蛋白质表达水平的影响;*表示显著性差异(p<0.05),**表示显著性差异(p<0.01),***表示显著性差异(p<0.001);
ACE2能够降解Ang II,从而使机体血压降低,AT1R是传递血管收缩信号的受体,而AT2R是传递血管舒张信号的受体。实验结果显示,SHR在连续4周给药200mg/kg和400mg/kg的酵母多肽后,ACE2和AT2R的表达水平升高,AT1R的表达水平下降,其中高剂量组更具有显著性。上述结果说明酵母肽通过调控机体RAS系统中关键的蛋白质表达,从而使血压下降,并且剂量越高,效果更显著。
实施例8、酵母肽对SHR氧化应激水平的影响
氧化应激水平的测定:按照丙二醛(MDA)检测试剂盒、谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒的要求及步骤,测定实施例7中模型组、阳性对照、YP-200组和YP-400大鼠血清中的MDA、GSH及SOD活性,综合判断各组大鼠氧化应激水平,结果如表11所示。
表11酵母肽对SHR体内氧化应激水平的影响
注:相对于模型组,*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示p<0.001。
由表11测定结果显示,SHR经连续4周给药200mg/kg和400mg/kg的酵母肽后,能够显著降低血清中MDA的含量,提高GSH的含量和SOD的活性。MDA是脂质氧化的产物,GSH是机体内源性抗氧化剂,SOD是生物体内一种重要的内源性抗氧化酶。氧化应激会诱发血压升高,而酵母肽能够显著的降低SHR体内的氧化应激,从而有利于血压的降低。
实施例9、酵母肽对SHR肠道短链脂肪酸水平的影响
肠道短链脂肪酸水平的测定:在实验最后2-3天,收集实施例6中各组大鼠的粪便,通过测定新鲜粪便中短链脂肪酸来表征肠道短链脂肪酸水平。具体方法为:1)称取0.1g的粪便样品放入2mL的EP管中,加入1mL去离子水反复涡旋使样品分散;2)涡旋后的样品离心10min,将0.8mL上清液取出加入0.1mL浓盐酸,混匀5min;3)加入5mL乙醚,反复混匀萃取20min,并离心10min使有机相和水相分离;4)将上层的有机相转移到新的10mL EP管中,加入0.5mL 1M的NaOH溶液,混匀萃取20min;5)萃取结束后,进行离心,将下层的水相取出,加入0.1mL浓盐酸,经过0.22μm的滤膜过滤后,用于高效液相色谱测定。高效液相色谱所用的流动相为:乙腈与0.025%的磷酸溶液,比例为5:95;流速为1mL/min,波长为210nm。不同浓度的乙酸、丙酸和丁酸标准品通过液相进行测定,得到标准曲线。通过标准曲线计算得到不同组大鼠粪便中三种短链脂肪酸的浓度,结果如表12所示。
表12酵母肽对SHR肠道短链脂肪酸的影响
注:相对于模型组,*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示p<0.001。
由表12测定结果显示,SHR经连续4周给药200mg/kg和400mg/kg的酵母肽后,肠道中三种主要的短链脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸的水平,都有一定程度的提高。短链脂肪酸对于机体血压的调节具有积极作用,酵母肽可以提高SHR肠道中短链脂肪酸的水平,从而有利于血压的降低。
实施例10、酵母肽对SHR肠道微生物的影响
肠道微生物多样性分析:各组大鼠的结肠内容物取出后,提取其中的微生物基因组,之后对细菌16S rRNA基因的V3-V4区域进行DNA扩增、纯化及定量。纯化后的样品进行上机测序。测序后对低质量Reads进行过滤,然后进行组装和再过滤,得到有效数据进行OTU聚类。获得OTU后,依次进行物种注释、α-多样性分析、主坐标分析(PCoA)及物种组成分析。分析结果如图5-图6所示。其中图5A所示为酵母肽对SHR肠道微生物Sobs指数的影响,图5B所示为酵母肽对SHR肠道微生物ACE指数的影响,图5C所示为酵母肽对SHR肠道微生物Shannon指数的影响,图5D所示为酵母肽对SHR肠道微生物Simpson指数的影响;图6所示为酵母肽对SHR肠道中厚壁菌门与拟杆菌门比值(F/B)的影响。
对各组大鼠肠道微生物进行α-多样性分析发现,模型组的Sobs(Richness)、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数都显著低于正常组,而灌胃酵母肽可以显著提高SHR肠道微生物α-多样性的四个指标。众多研究表明高血压患者及高血压动物模型中肠道微生物α-多样性显著降低,灌胃400mg/kg的酵母肽可以显著提高SHR肠道微生物的α-多样性。PCoA结果表明,YP-200组和YP-400组大鼠的菌群结构与模型组出现显著差异。门水平物种堆叠图显示,灌胃酵母肽可以调节SHR的菌群,使其向正常大鼠菌群组成发展。由图6可以看出,YP-400组的厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)相对于模型组出现显著下降。文献表明F/B值与高血压成正相关,而酵母肽可以通过调节不同菌群的丰度,从而有利于机体血压的调节。
实施例11一种降血压功能食品
将10质量份的实施例2制备得到的酵母肽与5质量份的椰汁粉、5质量份的红葡萄浓缩粉、8质量份的赤藓糖醇溶于71.5质量份的水中,充分溶解后再加入0.5质量粉的食用香精,制备得到1000g具有降血压功能的食品。摇匀后UHT灭菌(135℃,5-8s),罐装至小玻璃瓶中,每份内容物为30ml。
实施例12一种降血压药品
将20质量份的实施例2制备得到的酵母肽与20质量份的银杏叶提取物,59.5质量份的山梨糖醇混合均匀,再加入0.5质量份的硬脂酸镁混合均匀,制备得到1000g具有降血压功能的药品。采用粉末直压的方式将上述物料压成片剂,每片1g。建议每日服用1-2片。
实施例13一种降血压保健食品
将10质量份的实施例2制备得到的酵母肽与20质量份的葛根提取物,69质量份的抗性糊精混合均匀,再加入1质量份的二氧化硅混合均匀,制备得到1000g具有降血压功能的保健食品。在胶囊机上填充为内容物0.5g的硬胶囊产品。每日服用2次,每次2-3粒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种酵母肽,其特征在于,所述酵母肽含有如下肽:
第一肽:苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸,
第二肽:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸,
和,第三肽:丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的酵母肽,其特征在于,所述酵母肽中第一肽、第二肽和第三肽的质量比为0.3-1:0.3-1:0.3-1;
优选地,所述酵母肽中第一肽、第二肽和第三肽的质量比为0.3-0.5:0.3-0.9:0.5-1。
3.权利要求1或2所述的酵母肽的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将脱除核酸后的酵母乳利用第一酶使蛋白酶解,分离得到的轻相即为酵母肽,
或将脱除核酸后的酵母乳利用第二酶使细胞壁酶解,分离重相后利用第三酶进行酶解,分离得到的轻相即为酵母肽。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,调节脱除核酸后的酵母乳的pH为8-9,然后利用第一酶进行酶解;
或者,调节脱除核酸后的酵母乳的pH为5-6,然后利用第二酶进行酶解。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括利用膜分离对酵母肽进行纯化。
优选地,所述制备方法还包括利用喷雾干燥或冷冻干燥处理得到粉末状酵母肽。
6.根据权利要求3-5任意一项所述的制备方法,其特征在于,以干物质质量计,所述第一酶与脱除核酸后的酵母乳干重的质量比为0.1%~0.5%,优选为0.2%-0.3%;
优选地,所述第一酶为嗜热杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物;
优选地,所述第一酶为质量比为1:1的嗜热杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶;
或者优选地,所述第一酶为中性蛋白酶Protin SD-NY 10,或中性蛋白酶Protease A2SD。
7.根据权利要求3-6任意一项所述的制备方法,其特征在于,以干物质质量计,所述第二酶与脱除核酸后的酵母乳的质量比为0.1%~1%,优选为0.3%-0.5%;
优选地,所述第二酶为β-葡聚糖酶,甘露聚糖酶或纤维素酶。
8.根据权利要求3-7任意一项所述的制备方法,其特征在于,所述第三酶与脱除核酸后的酵母乳的质量比为0.1%~0.5%,优选为0.2%-0.3%;
优选地,所述第三酶为嗜热杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物,或复合蛋白酶(ProtinSD-NY),或中性蛋白酶(Protease A 2SD);
优选地,所述第三酶为质量比为1-2:1-2的嗜热杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物。
9.一种肽,其特征在于,所述肽含有如下序列:苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸。
10.一种肽,其特征在于,所述肽含有如下序列:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸。
11.一种肽,其特征在于,所述肽含有如下序列:丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-亮氨酸。
12.权利要求1或2所述的酵母肽或权利要求3-8所述的制备方法制备得到的酵母肽或权利要求9-11任一项所述的肽在制备血管紧张素转化酶抑制剂、抗氧化剂、降血压剂或调节肠道微生物剂的产品中的应用。
13.权利要求12所述的应用,其特征在于,所述产品为药品、食品或保健品。
14.一种抑制血管紧张素转化酶活性产品,其特征在于,所述产品中含有权利要求1或2所述的酵母肽或权利要求3-8任一项所述的制备方法制备得到的酵母肽或权利要求9-11任一项所述的肽。
15.根据权利要求14所述的产品,其特征在于,所述产品中权利要求1或2所述的酵母肽或权利要求3-8任一项所述的制备方法制备得到的酵母肽或权利要求9-11任一项所述的肽的含量为65~85wt%。
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