CN102787154B - 一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段分离、鉴定方法 - Google Patents

Abstract

一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段的分离、鉴定方法，属于生物医药技术领域。具体步骤为：将白条乌鸡绞碎、加水、加热、去脂等前处理，然后加入Protamex酶解，再经过离心、超滤、浓缩和喷雾干燥等工序，制得乌鸡低聚肽。经检测，乌鸡低聚肽的分子量小于1000Da的组分占85％以上。乌鸡低聚肽具有较高的DPPH自由基清除活性，其IC₅₀值为4.52mg/mL。而且乌鸡低聚肽具有较强的ACE抑制活性，其IC₅₀值为2.86mg/mL。采用RP-HPLC法和Q-TOF2法分离鉴定出部分活性肽段，其中2个抗氧化活性肽段，即LWR和NM；5个降血压活性肽段，即LER、GAGP、KPGV、LH和NM。

Description

一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段分离、鉴定方法

本发明涉及一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段分离、鉴定方法，属生物医药技术领域。

乌鸡是我国家禽品种中的珍禽，具有特殊的营养滋补与药用价值。乌鸡营养价值丰富，主要化学成分为蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、镁、维生素B1、B2等，含有组成人体蛋白质所需要的20多种氨基酸，对人体有特殊的滋补作用。《本草纲目》中记载，乌鸡有补虚劳羸弱、治消渴、益产妇、治妇人崩中带下及一些虚损诸病的功用。传统乌鸡制品在提高生理机能、延缓衰老、强筋健骨以及对防治骨质疏松、佝偻病、妇女缺铁性贫血症等方面的功效更是得到了现代科学研究的普遍证实。研究表明，乌鸡所含20种氨基酸中，必需氨基酸齐全，其含量均高于其他鸡种，如谷氨酸含量达14.75％、天门冬氨酸8.97％、赖氨酸8.08％、亮氨酸7.61％、丙氨酸5.37％、酪氨酸5.37％、精氨酸5.25％等。此外，乌鸡含胆固醇较低，是老年人和心脑血管疾病患者最理想的滋补保健食品之一。乌鸡在我国广泛养殖，我国目前乌鸡存栏数已超过5000万只。然而，乌鸡制品的生产仍多以初加工为主，缺乏深度加工和利用。市场上的乌鸡制品，如乌鸡精、乌鸡口服液、虫草乌鸡王等，其生产工艺大多是通过水煮(如公开号CN101133859A；CN1682977A)或加酸水解的方法对乌鸡肌肉组织进行消解，使蛋白质溶出，再经过浓缩、过滤、中药配伍等步骤，制成口服液、膏状制剂等不同剂型的产品。乌鸡制品的传统生产工艺多有不足之处，影响产品的品质和功效。水煮法只能破坏肌肉组织，使蛋白质溶出，蛋白质分解程度小，不能使活性肽段充分释放出来，制得的乌鸡肉汁杂质多，外观混浊。酸水解法采用高浓度的盐酸对乌鸡蛋白长时间的加压水解，虽然能使蛋白质水解成易吸收的氨基酸，但很少生产活性肽段，而且在高酸性条件下，氨基酸的结构极易被破环，使其丧失营养价值。另外，蛋白质的酸水解过程中，极易产生一种叫做氯丙醇的致癌物。针对传统工艺的不足，后来的研究者采用酶解法开发乌鸡新产品，如公开号为1093912A的发明专利提供了一种乌鸡口服液的制备方法，将乌鸡肉绞碎，加水搅拌，在一定温度和pH条件下，用1398蛋白酶水解，水解液精制后，与枸杞提取液和蜂蜜混配乌鸡口服液。另一项发明专利CN1404764A公开了一种乌鸡营养成分的提取新工艺，将乌鸡肉加热煮烂，降温，加入木瓜蛋白酶水解，制成乌鸡营养液。以上这些研究发明，虽对乌鸡传统工艺有所改进，但对乌鸡低聚肽及其营养保健功能缺乏深度了解和开发。

现代营养学研究证实，食源性低聚肽(相对分子质量小于1000Da)与原蛋白质和相同比例的混合氨基酸相比具有更多优点，低聚肽在肠道中的吸收率最好，吸收速度最快。一些小肽如二肽、三肽的吸收速度比同一组成的氨基酸快，不受消化功能障碍影响，在临床营养上有极其重要的意义。食源性肽类，尤其是低聚肽还具有低抗原、促进脂质代谢、降低胆固醇、促进矿物质吸收、降血压、抗氧化等生理功能，一些食源性低聚肽具有强化机体免疫、促进人体新陈代谢的作用。

乌鸡肉蛋白氨基酸组成全面，含有丰富的活性肽段。谢明勇等采用液质(HPLC-MS)联用技术证明了乌鸡肌肉中存在较高含量的肌肽，研究推测乌鸡富含肌肽可能是乌鸡鸡种决定的，并认为乌鸡富含肌肽可能是乌鸡“滋阴清热”、“治消渴”等药用和补益作用的重要物质基础之一。林霖等对乌鸡活性肽进行了研究，发现其具有较强的体外清除羟自由基、超氧自由基的活性，随着浓度的增加，清除率逐渐增高，呈剂量关系。吴光杰等的研究表明乌鸡活性肽对体外非酶糖基化反应及其终产物的生成均有较强的抑制作用，在同等浓度条件下，乌鸡活性肽对非酶糖基化反应终产物生成抑制的效能要强于肌肽。该结果可初步认为，传统中医药认为乌鸡在治疗糖尿病(消渴)中发挥的作用可能与其所含的活性肽具有抗非酶糖基化能力有关。

目前所报道的乌鸡研究中，仅对乌鸡活性肽进行了初步的探索，分子量均较大，大多集中在2000～5000Da，未见对其中的特效活性肽段进行系统研究和开发。研究表明，肽的生物活性与分子量大小有关，能在体内起活性作用的肽大多是1000Da以下的低聚肽。因此，制备小分子量的乌鸡低聚肽，对乌鸡的精深加工和传统乌鸡制品工艺改进有着重要的意义。

为了弥补传统乌鸡制品生产工艺及乌鸡深度利用方面的不足，本发明采用复合酶解技术，有控制地对乌鸡蛋白进行定向水解，达到适当的水解度，最大程度地获得低聚肽，减少游离氨基酸的生成；采用微滤和超滤相结合进行分离纯化，最终精制成高纯度的乌鸡低聚肽，可作为一种高营养、多活性的功能配料。本发明对所制得的乌鸡低聚肽进行了特效活性肽段分离、鉴定，发现数种抗氧化和降血压的活性肽段，并采用体外功能评价方法证实了这些肽段的生理活性。

本发明的目的在于提供一种具有抗氧化和降血压的乌鸡低聚肽；本发明的另一个目的在于提供一种利用酶解法制备高纯度的乌鸡低聚肽的方法；本发明的目的还在于提供一种从乌鸡低聚肽中分离、鉴定特效活性肽段的方法。

本发明所述的乌鸡低聚肽其粗蛋白质含量87.30％，脂肪为0.34％，灰分为3.21％，水分为5.98％，分子量分布见表1：

表1.乌鸡低聚肽的相对分子质量分布

本发明所述的乌鸡低聚肽的DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼)自由基清除活性，即IC₅₀值为4.52mg/mL。

样品的DPPH自由基清除活性，即IC₅₀值的定义为：在一定条件下DPPH自由基清除率为50％时所需要的样品浓度。

本发明所述的乌鸡低聚肽的降血压活性，即ACE(Angiotensin-convertingEnzyme，血管紧张素转化酶)抑制活性，IC₅₀值为2.86mg/mL。

样品(抑制剂)的降血压活性，即IC₅₀的定义为：在一定的条件下ACE抑制率为50％时所需要的样品浓度。

从乌鸡低聚肽中分离鉴定出2个DPPH自由基清除活性较强的肽段，其一级结构(氨基酸序列)和IC₅₀值分别是：

LWR：Leu-Trp-Arg，IC₅₀值：2.80mg/mL；

NM：Asn-Met，IC₅₀值：6.01mg/mL。

从乌鸡低聚肽中分离鉴定出2个ACE抑制活性较强的肽段，其一级结构和IC₅₀值分别是：

LER：Leu-Glu-Arg，IC₅₀值：0.19mg/mL，

GAGP：Gly-Ala-Gly-Pro，IC₅₀值：0.76mg/mL。

本发明的目的的实现方式为，一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段的分离、鉴定方法，其具体步骤为：

1.乌鸡低聚肽的制备：

为了改变传统乌鸡制品生产工艺与产品品质方面的缺陷，用现代酶解技术改进传统工艺，提升乌鸡制品的营养及保健功能。本发明对乌鸡进行斩切、蒸煮、细化、除脂等，然后加入复合蛋白酶进行酶解、精制纯化、浓缩干燥，最终制成粗蛋白含量在85％以上，分子量在1000Da以下的乌鸡低聚肽。

蛋白质水解度的测定：

取二份10mL酶解前的蛋白液样品，即样品S0、S1，另取一份10mL酶解后的蛋白酶解液样品S₂。按照GB5009.5“食品中蛋白质的测定”中规定的方法测定S₀的总氮N₀；在样品S₁和S₂分别中加入10mL15％的TCL(三氯乙酸)溶液，混合均匀，静置5min。将溶液定量转移，在4000r/min下离心10min，取全部上清液，按照上述方法测定样品中的酸溶氮N₁和N₂。按照如下公式计算乌鸡蛋白的水解度：

DH＝(N₂-N₁)/(N₀-N₁)×100％

式中：DH为乌鸡蛋白水解度(％)；N₂为酶解后乌鸡蛋白酶解液在10％TCL溶液中的可溶性氮(g/L)；N₁为酶解前乌鸡蛋白液在10％TCL溶液中的可溶性氮(g/L)；N₀为酶解前乌鸡蛋白液的总氮(g/L)。

2.乌鸡低聚肽的理化性能的测定

(1)依据GB/T 5009.5-2003、GB/T 5009.6-2003、GB/T 5009.3-2003、GB/T5009.4-2003，对乌鸡低聚肽样品中蛋白质、脂肪、水分、灰分含量进行测定。结果为：蛋白质87.30％，脂肪0.34％，水分5.98％，灰分3.21％。

(2)依据GB/T 5009.124-2003，对乌鸡低聚肽样品的氨基酸组成进行分析。结果见表2。

表2.乌鸡低聚肽的氨基酸组成

(3)采用高效液相凝胶色谱法对乌鸡低聚肽样品的分子量分布进行测定。操作步骤为：用流动相配制样品溶液1mg/mL，经孔径0.2μm聚四氟乙烯过滤膜过滤后，用高效液相色谱仪进行凝胶过滤，用紫外检测器进行检测，使用GPC软件处理色谱数据。同时配制0.1％(M/V)肽标准品溶液，过膜后进样，制作相对分子量校正曲线。四种肽标准品为：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子量451)、杆菌酶(分子量1450)、细胞色素C(分子量12500)。色谱条件为：色谱柱：TSKgel G2000SWXL 300×7.8mm；流动相：V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)＝45∶55∶0.1；流速：0.5mL/min；进样体积：10μL；检测波长：220nm；柱温：30℃。结果见附图1和表3。

表3.乌鸡低聚肽分子量分布

3.特效活性肽段的分离

将乌鸡低聚肽样品经RP-HPLC(反相高效液相色谱)进行分离和收集，操作步骤为：样品制备→上样→梯度洗脱→组分收集。色谱柱条件：XBridgeBEH130C18柱(4.6×250mm)；流动相A：V(水)∶V(三氟乙酸)＝100∶0.1；流动相B：V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)＝80∶20∶0.1；检测波长：UV220nm；流速：0.6mL/min；柱温：32℃。

4.特效活性肽段的结构鉴定

将经RP-HPLC分离和收集的组分样品利用质谱仪进行结构鉴定，质谱仪为Q-TOF2(四级杆飞行时间串联质谱仪)，质谱条件为：离子化方式为纳升电喷雾正离子，雾化气体为N₂，碰撞气体为Ar，源温为80℃，锥孔电压为50V，TOF加速电压为9.1kV，MCP检测器电压为2150V，毛细管电压为800V，MS和MS/MS的质量准确度为0.1Da。

5.体外抗氧化活性评价

采用DPPH自由基清除法对乌鸡低聚肽样品及其分离鉴定出的特效活性肽段进行抗氧化活性评价。DPPH法：1，1-二苯基-2-苦基肼(1，1-diphenyl-2-pycryl-hydrazyl，DPPH)自由基是一个稳定的以氮为中心的自由基，接受电子或氢基变成稳定的反磁性分子。DPPH在有机溶剂(通常为乙醇)中非常稳定，其孤对电子在517nm附近有强吸收(显深紫色)。当有机清除剂存在时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度，即可评价抗氧化剂对DPPH自由基清除能力。因此，通常以DPPH为底物，通过测定抗氧化剂对其清除能力来评价其抗氧化活性。

6.体外降血压活性评价

采用RP-HPLC法测定乌鸡低聚肽样品及其分离鉴定出的特效活性肽段的降血压活性，即ACE抑制活性，其原理为：ACE催化分解HHL(马尿酰组氨酰亮氨酸，即催化血管紧张素I(Ang I)的模拟物)，产生马尿酸，当加入降血压物质时，ACE对HHL的催化分解作用受到抑制，马尿酸的生成量减少。在RP-HPLC图谱中，马尿酸的洗脱峰的峰面积与马尿酸的量呈很好的线性关系，通过测定加入降血压肽前后马尿酸峰面积的差别即可反映它的ACE抑制活性的大小。

对本发明的乌鸡低聚肽制备工艺有以下几点说明。

1.将乌鸡肉骨斩切、绞碎成肉泥，加水蒸煮、冷却、用胶体磨处理，使肉骨组织细化，使蛋白质充分溶出，便于酶解，提高产率。

2.采用离心法，使液料在离心力的作用下实现油水分离，充分除去油脂，保证了乌鸡低聚肽的品质。

3.在复合酶制剂的作用下，实现对乌鸡蛋白质多位点的定向酶解，水解度大，产率高，又能使更多的活性肽段释放出来，增大乌鸡低聚肽的营养和生物价值。

4.本发明的乌鸡低聚肽的制备工艺中，采用微滤和超滤多级分离纯化新方法，除去了未水解的大分子蛋白质，充分富集小分子的低聚肽，保证了样品的纯度。

本发明的乌鸡低聚肽制备工艺，可将乌鸡专门加工成使用方便的高营养新型功能配料，改变传统上使用乌鸡作为原料制备乌鸡口服液、乌鸡精等制品的历史，为制药、保健品开发新产品带来极大的益处。采用酶解技术，将生物中大分子的蛋白质转化为小分子的低聚肽(多数为二肽、三肽)，可在人体胃肠中不经消化，直接吸收，提高了乌鸡制品的营养价值，尤其是为有消化障碍的病患者带来福音。

用斩切机和绞肉机将白条乌鸡连骨带肉斩切为肉泥，加4～5倍的水，煮沸0.5h，冷却至室温。将液料用胶体磨进行细化处理后，加热至80℃，降至室温，离心去掉油脂，保留下层液料。将液料加温至50～60℃，调pH至6～9，加入液料固含量的3～5％的Protamex酶，酶解至水解度达到70％左右，灭酶，将液料冷却到室温。用孔径50～100μm的微滤装置过滤，保留滤液。将滤液再用截留分子量为1000～3000Da的超滤装置过滤，保留滤液。在滤液中加入其固含量的4～8％的活性碳，加热至80℃，搅拌1h，过滤除去活性碳。将液料真空浓缩至液料固含量为35％左右，再经喷雾干燥，制得乌鸡低聚肽粉。用RP-HPLC对乌鸡低聚肽样品进行分离，共收集5个组分。然后用四级杆飞行时间串联质谱仪(Q-TOF2)对每个组分中的肽段的一级结构，即氨基酸序列进行鉴定，共鉴定出46个肽段。与生物活性肽数据库进行比对，预测出12个肽段具有不同的生理活性。用DPPH自由基清除法对乌鸡低聚肽及相应肽段标准品进行体外抗氧化活性评价；用RP-HPLC法进行体外降血压活性评价。结果表明，乌鸡低聚肽具有一定的抗氧化活性和降血压活性，其DPPH自由基清除活性IC₅₀值为4.52mg/mL；ACE抑制活性IC₅₀值为2.86mg/mL。分离/鉴定出的Leu-Trp-Arg三肽和Asn-Met二肽具有较高的抗氧化活性，其DPPH自由基清除活性IC₅₀值分别是2.80mg/mL和6.01mg/mL。分离鉴定出的Leu-Glu-Arg三肽和Gly-Ala-Gly-Pro四肽具有较高的降血压活性，其ACE抑制活性IC₅₀值分别为0.19mg/mL和0.76mg/mL。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

一是本发明以乌鸡为原料，采用前处理、酶解、分离提纯、浓缩干燥等生产步骤，制得高纯度的乌鸡低聚肽粉，可形成独立的工业化生产。乌鸡低聚肽作为各种乌鸡制品的新型原料，使制药、保健品企业缩短了乌鸡精、乌鸡口服液生产工艺，减少了建设投资和生产成本。

二是本发明对乌鸡进行斩切、水煮、细化、除脂等前处理，使乌鸡肉骨中的蛋白质充分溶出，提高了乌鸡低聚肽的品质和产率。

三是本发明采用定向酶解技术，水解充分，所得的低聚肽的分子量更小，活性肽段尽可能多地从蛋白中释放出来，丰富了乌鸡低聚肽的营养价值和保健功能。

四是本发明采用微滤和超滤结合的多级过滤、真空浓缩、喷雾干燥等分离纯化，精制出乌鸡低聚肽，提高了乌鸡低聚肽的纯度和品质。

五是本发明采用体外活性评价方法，证实乌鸡低聚肽具有一定的抗氧化活性和降血压活性。同时采用RP-HPLC和Q-TOF2等先进分离鉴定技术从乌鸡低聚肽中分离鉴定出多种特效活性肽段，并用体外活性评价予以证实，其中Leu-Trp-Arg三肽和Asn-Met二肽具有较高的抗氧化活性；Leu-Glu-Arg三肽和Gly-Ala-Gly-Pro四肽具有较高的降血压活性。

实施例一

将1.83kg白条乌鸡用斩切机和绞肉机制成肉泥，转移至水解锅中，加入5L去离子水，搅拌均匀，加热煮沸0.5h，冷却至常温。将液料用胶体磨处理后，加热至90℃，静置冷却至室温。将液料在3000r/min的转速下离心处理15min，静置5min，弃去液料上层油脂，保留下层液料。将液料返回水解釜中，加热至50℃，用NaOH溶液调节液料至pH7.5，加入液料固含量3.0％的Protamex酶，酶解至液料蛋白质水解度达到70％左右。将液料通过高温瞬时杀菌(UHT)系统进行灭酶。在液料中加入离交水至固含量5％，降温至40℃左右后，用孔径50μm的微滤装置过滤。在截留液中加入离交水稀释至液料固含量为5％左右，用微滤装置过滤，收集两次处理的透过清液。将透过清液再用截留分子量为1000Da的超滤装置过滤，在清液中加入其固含量4％的活性碳粉末，搅匀，煮沸，过滤，得到澄清的低聚肽液。将低聚肽液浓缩，喷雾干燥，得到203g乌鸡低聚肽粉，得率为11.1％。

实施例二

将1902.3kg白条乌鸡用斩切机和绞肉机制成肉泥，转移至水解罐中，加入6000L离交水，搅拌均匀，加热煮沸0.5h，冷却至常温。将液料用胶体磨细化处理后，加热至90℃，静置冷却至室温。将液料用碟片离心机进行处理，除去油脂，保留蛋白液料。将液料返回水解罐中，加热至55℃，用NaOH溶液调节液料至pH8.5，加入液料固含量5.0％的Protamex酶，酶解至液料蛋白质水解度达到70％左右。将液料通过高温瞬时杀菌(UHT)系统进行灭酶。在液料中加入离交水至固含量5％，降温至40℃左右后，用孔径100μm的微滤装置过滤。在截留液中加入离交水稀释至液料固含量为5％左右，用微滤装置过滤，收集两次处理的透过清液。将透过清液再用截留分子量为3000Da的超滤装置过滤，收集透过清液。在清液中加入其固含量8％的活性碳粉末，搅匀，煮沸，过滤，得到澄清的低聚肽液。将低聚肽液浓缩，喷雾干燥，得到243.6kg乌鸡低聚肽粉，得率为12.8％。

实施例三

用RP-HPLC对乌鸡低聚肽成分进行分离，操作步骤为：(1)样品制备：称取1g乌鸡低聚肽干粉，将其用流动相A定容至100mL容量瓶，超声振荡10min，使样品充分溶解混匀，配成0.1mg/mL的乌鸡低聚肽溶液。将样品溶液用孔径为0.2μm聚四氟乙烯过滤膜过滤。(2)上样：上样量为50μL。(3)梯度洗脱：色谱柱：XBridge BEH130C18柱(4.6×250mm)；流动相A：V(水)∶V(三氟乙酸)＝100∶0.1；流动相B：V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)＝80∶20∶0.1；检测波长：UV220nm；流速：0.6mL/min；柱温：32℃；梯度洗脱程序：0-20min，流动相B：0％-5％；20-30min，流动相B：5％-5％；30-80min，流动相B：5％-25％；80-90min，流动相B：25％-80％；90-100min，流动相B：80％-80％。(4)组分收集：选择5个主要组分峰进行收集，自动收集器为：岛津Fraction Collecter10A。收集组分峰见附图2，分别命名为1#、2#、3#、4#、5#。将收集的组分利用氮吹仪除去乙腈、三氟乙酸等有机溶剂，冷冻干燥后得到粉末状组分样品。

实施例四

将实施例三收集的组分样品利用质谱仪进行结构鉴定，质谱仪为四级杆飞行时间串联质谱仪(Q-TOF2)，质谱条件为：离子化方式为纳升电喷雾正离子，雾化气体为N₂，碰撞气体为Ar，源温为80℃，锥孔电压为50V，TOF加速电压为9.1kV，MCP检测器电压为2150V，毛细管电压为800V，MS和MS/MS的质量准确度为0.1Da。质谱鉴定结果见表4。

实施例五

参考生物活性肽数据库，从鉴定出的肽段中筛选出12个预测可能具有活性的肽段即LH、LWR、VE、EVR、KPGV、EHPT、DAPR、DVAK、LER、GAGP、NM、LT，以其标准品，分别进行体外抗氧化和降血压活性评价。

1.抗氧化活性评价

配制5mg/mL的肽段标准品溶液，以DPPH自由基清除活性为指标，评价其抗氧化活性，同时测定等浓度的乌鸡低聚肽的DPPH自由基清除活性。

测定方法如下：于96孔酶标板中加入样品溶液100μL和0.1mmol/L DPPH溶液100μL。震荡30s后，避光反应30min，用Spectra MR酶标仪于517nm下测定吸光度A_S，同时测定100μL 0.1mmol/L DPPH溶液与100μL乙醇混合液的吸光度A_C，以及100μL样品溶液与100μL乙醇混合液的吸光度A_B。计算公式为：清除率(％)＝[1-(A_S-A_B)/A_C]×100％。结果见附图3。

对样品进行IC₅₀值分析，IC₅₀值的定义为在一定条件下DPPH自由基清除率为50％时所需要的样品浓度。浓度为5mg/mL时，12个肽段中，有2个抗氧化活性较高的肽段，即LWR和NM，其DPPH自由基清除活性IC₅₀值分别为2.80mg/mL、6.01mg/mL；LWR的DPPH自由基清除活性比乌鸡低聚肽高，乌鸡低聚肽的IC₅₀值为4.52mg/mL，LWR的DPPH自由基清除活性大约是乌鸡低聚肽的1.6倍。

表4乌鸡低聚肽5个组分的一级结构

2.降血压活性评价

配制1mg/mL的肽标准品溶液，以ACE抑制活性为指标，评价其降血压活性。同时测定等浓度的乌鸡低聚肽的ACE抑制活性。

使用反相高效液相色潽仪，色谱柱为Inertsil ODS-SP C18柱(4.6×150mm)。方法如下：配制0.05mol/L的硼酸缓冲液(含0.3mol/L NaCl)，pH为8.3。用硼酸缓冲液配制50mU/mL的ACE溶液，用硼酸缓冲液配制7.6mmol/L的HHL溶液。将20μL的待检测样品(空白对照为硼酸缓冲液)与30μL ACE溶液混合，37℃水浴预热5min。加入50μL底物HHL液于37℃水浴30min。反应结束后加入100μL 1M的HCl终止反应，最终加入400μL硼酸缓冲液，混匀后用孔径为0.2μm聚四氟乙烯过滤膜过滤，上机进样。

色谱条件为：流动相A：70％水，30％甲醇(含0.1％三氟乙酸，0.05％乙酸)；流动相B：20％水，80％甲醇(含0.1％三氟乙酸，0.05％乙酸)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积：100μL；检测波长：UV227nm；梯度程序：0-2.50min，流动相B：0％-0％；2.51-4.50min，流动相B：100％-100％；4.51-15min，流动相B：0％-0％。

计算公式为：ACE抑制率(％)＝(M-N)/N×100％。其中，M为空白对照组中马尿酸的峰面积(mAU·s)；N为添加抑制剂组中马尿酸的峰面积(mAU·s)，结果见附图4。

浓度为1mg/mL时，12个肽段中，有5个降血压活性较高的肽段，即LER、GAGP、KPGV、LH和NM，其ACE抑制活性均好于乌鸡低聚肽，其中LER、GAGP为高降血压活性肽段。IC₅₀值的定义为在一定条件下ACE抑制率为50％时所需要的样品浓度。经IC₅₀值测定，LER、GAGP、乌鸡低聚肽的IC₅₀值分别为0.19mg/mL、0.76mg/mL、2.86mg/mL，LER和GAGP的抑制能力大约是乌鸡低聚肽的15.1倍和3.8倍。

Claims (1)

1.一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段分离、鉴定方法，其特征在于所述方法包括下述步骤： 

(1)乌鸡低聚肽的制备 

用斩切机和绞肉机将白条乌鸡连骨带肉斩切为肉泥，加4～5倍的水，煮沸0.5h，冷却至室温，将料液用胶体磨进行细化处理后，加热至80℃，降至室温，离心去掉油脂，保留下层液料然后将液料加温至50～60℃，调pH至6～9，加入液料固含量3～5％的Protamex酶，酶解至水解度达到70％左右，灭酶，将液料冷却到室温，用孔径50～100μm的微滤装置过滤，保留滤液，将滤液再用截留分子量为1000～3000Da的超滤装置过滤，保留滤液，在滤液中加入其固含量4～8％的活性碳，加热至80℃，搅拌1h，过滤除去活性碳，将液料真空减压浓缩至液料固含量为35％左右，将浓缩液料喷雾干燥； 

(2)活性肽段的分离、鉴定 

用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对乌鸡低聚肽进行分离，色谱条件为：色谱柱∶XBridge BEH130C18柱，规格为4.6×250mm；流动相A∶V_水∶V_三氟乙酸＝100∶0.1；流动相B∶V_乙腈∶V_水∶V_三氟乙酸＝80∶20∶0.1；进样体积：50μL；检测波长：UV220nm；流速：0.6mL/min；柱温：32℃，用四级杆飞行时间串联质谱仪(Q-TOF2)对在上述分离条件下分离出的5个组分中肽段的氨基酸序列进行鉴定，质谱条件为：离子化方式为纳升电喷雾正离子，雾化气体为N₂，碰撞气体为Ar，源温为80℃，锥孔电压为50V，TOF加速电压为9.1kV，MCP检测器电压为2150V，毛细管电压为800V，MS和MS/MS的质量准确度为0.1Da，对鉴定出一级结构的肽段标准品进行体外功能评价，结果表明，鉴定出两个抗氧化活性较强的肽段即Leu-Trp-Arg三肽和Asn-Met二肽，其DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼)自由基清除能力IC₅₀值分别是2.80mg/mL和6.01mg/mL；鉴定出两个降血压活性较强的肽段即Leu-Glu-Arg三肽和Gly-Ala-Gly-Pro四肽，其ACE(Angiotensin-converting Enzyme，血管紧张素转化酶)抑制活性IC₅₀值分别为0.19mg/mL和0.76mg/mL。 

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