CN101856367A - 一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法 - Google Patents
一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法，能够获得有效清除DPPH自由基、羟自由基及具有还原性的酶解物，属于生物酶解技术领域。该方法是将鸡骨进行粉碎，制成骨泥，配制鸡骨泥悬浮液，在80～100℃下加热预处理20～30分钟，冷却至酶反应的最适温度，调整pH，加入蛋白酶，反应一定时间后，升温到85℃～90℃保持10～20分钟灭酶，得到淡黄色粉状物，即为鸡骨蛋白酶解物。本发明所获得的鸡骨蛋白酶解物具有清除DPPH自由基、羟自由基及还原的能力，是潜在的天然抗氧化剂和功能性食品，且安全性高，具有有效地保护人体细胞组织、心脑血管循环系统及抗癌、延缓衰老等生理作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法，属于生物酶解技术领域。
背景技术
生物体在生命活动的代谢过程中，会不断的产生多种自由基，DPPH自由基（DPPH·）、羟自由基（OH·）是两种具有代表性的自由基。自由基过多，会导致生物机体中许多生物大分子如核酸、蛋白质、多糖及膜多聚不饱和脂肪酸发生过氧化反应，使生物大分子出现交联或断裂，引起细胞结构和功能损害。虽然合成抗氧化剂曾在清除活性氧、食物保鲜等方面做出了巨大贡献，但人工合成抗氧化剂存在直接或间接的致癌作用，具有潜在的不安全性。目前天然的抗氧化剂取得了很大的进展，而且天然抗氧化剂已从单纯作为油脂和含脂食品的抗氧化剂，发展到作为体内氧自由基的清除剂，以达到保护人体细胞组织、心脑血管循环系统及抗癌、延缓衰老等生理作用。
我国是禽肉生产和消费的大国。2008年我国鸡肉产量达1015万吨，位居世界第二，约占鸡总重25%的鸡骨产量也相当可观。目前，鸡骨大部分只作为动物饲料，产品附加值低，利用率很低。然而，鸡骨中含有丰富的优质蛋白质和人体所需的微量元素以及磷脂、软骨素、维生素和矿物质等多种营养素。若是能将鸡骨泥进行酶解，提取其抗氧化活性肽，开发成为天然抗氧化剂和功能性食品，将带来重要的经济与社会意义。
发明内容
本发明目的是提供一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法。以廉价的下脚料——鸡骨为原料，利用生物酶解技术，开发出一种具有清除DPPH自由基、羟自由基能力以及还原能力的酶解物。
本发明的技术方案包括下列步骤：
（1）原料预处理：将鸡骨进行粉碎，制成80～100目的骨泥（由福建圣农食品有限公司提供），加水配制鸡骨泥悬浮液，浓度为5～9%（重量，以下百分比类同），80～100℃加热20～30分钟；
（2）用盐酸或氢氧化钠调整步骤（1）所述悬浮液的pH值，添加蛋白酶进行水解；
（3）对步骤（2）制得的溶液灭酶：升高反应体系温度至85℃～95℃，保持10～20分钟；
（4）将步骤（3）灭酶后的溶液进行过滤：采用离心机，4000～4800转/分钟离心8～15分钟；
（5）干燥：取步骤（4）所述离心后的上清液，干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。干燥可以采用冻干、喷雾干燥、真空干燥或加热干燥等。
其中水解的蛋白酶为复合风味蛋白酶Flavourzyme（购自丹麦NOVE公司）、复合蛋白酶Protamex（购自丹麦NOVE公司）、胰酶（购自苏州天绿制药有限公司）、水解蛋白酶Alcalase（购自丹麦NOVE公司）、胰蛋白酶（购自北京华美公司）、AS.1398中性蛋白酶（购自无锡星达生物有限公司）或木瓜蛋白酶（购自上海旭梅公司）。
选用复合风味蛋白酶加入时，复合风味蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0.75%～1.25%，控制反应温度为45～65℃，用盐酸或氢氧化钠调整pH为6～8，反应20～120分钟；
选用复合蛋白酶加入时，复合蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的1.0%～1.5%，控制温度为45～55℃，用盐酸或氢氧化钠调整pH为6.5～7.5，反应20～100分钟；
选用胰酶加入时，胰酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0.5%～1.5%，控制温度为50～60℃，用氢氧化钠调整pH为8.0～9.0，反应20～100分钟；
选用水解蛋白酶加入时，水解蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0.75%～1.5%，控制反应温度为60～65℃，用氢氧化钠调整pH为8.0～9.0，反应20～90分钟；
选用胰蛋白酶加入时，胰蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0.5%～1.5%，控制温度为45～55℃，用氢氧化钠调整pH为8.0～9.0，反应20～100分钟；
选用AS.1398中性蛋白酶加入时，AS.1398中性蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0.5%～1.5%，控制温度为50～60℃，用氢氧化钠调整pH为7.0～9.0，反应10～100分钟；
选用木瓜蛋白酶加入时，木瓜蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0.5%～1.5%，控制温度为50～70℃，用盐酸或氢氧化钠调整pH为6.0～8.0，反应20～120分钟。
本发明具有以下优点：
1、本发明采用价格低廉的鸡骨泥为原料，利用生物酶解技术生产鸡骨蛋白
酶解物。酶解物具有良好的风味且含有大量短肽和游离氨基酸，易于人体吸收，并且具有抗氧化活性。
2、热反应条件较为温和，对营养成分破坏力低，同时使骨骼中的营养物质
在产品中得以充分保留，有益于人体健康。
3、本发明为天然的抗氧化剂，安全性高，具有有效地保护人体细胞组织、心脑血管循环系统及抗癌、延缓衰老等生理作用。
4、制备过程简单，原料为肉鸡加工的下脚料，可以有效地节约资源、降低成本，产品具有明显的市场竞争力。
具体实施方式
实施例一利用复合风味蛋白酶Flavourzyme水解得到鸡骨酶解物
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为5%（重量，以下百分比类同），于80℃下加热30分钟。
（2）水解：控制反应温度为45℃，用0.5mol/L的盐酸调整pH为6，加入复合风味蛋白酶Flavourzyme，加酶量为原料鲜重的0.75%，反应120分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至85℃保持20分钟。
（4）过滤：采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例二
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为7%，于90℃下加热25分钟。
（2）水解：控制反应温度为55℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为7，加入复合风味蛋白酶Flavourzyme，加酶量为原料鲜重的1%，反应70分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至90℃保持15分钟。
（4）过滤：采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液喷雾干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例三
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为9%，于100℃下加热20分钟。
（2）水解：控制反应温度为65℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入复合风味蛋白酶Flavourzyme，加酶量为原料鲜重的1.25%，反应20分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至95℃保持10分钟。
（4）过滤：采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液真空干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例四利用复合蛋白酶Protamex水解得到鸡骨酶解物
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为5%，于100℃下加热20分钟。
（2）水解：控制反应温度为45℃，用0.5mol/L盐酸调整pH为6.5，加入复合蛋白酶Protamex，加酶量为原料鲜重的1.25%，反应60分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至95℃保持10分钟。
（4）过滤：采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液真空干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例五
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为9%，于90℃下加热25分钟。
（2）水解：控制反应温度为55℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为7，加入复合蛋白酶Protamex，加酶量为原料鲜重的1.5%，反应20分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至90℃保持15分钟。
（4）过滤：采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液喷雾干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例六
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为7%，于80℃下加热30分钟。
（2）水解：控制反应温度为50℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为7.5，加入复合蛋白酶Protamex，加酶量为原料鲜重的1%，反应100分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至85℃保持20分钟。
（4）过滤：采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例七利用胰酶水解得到鸡骨酶解物
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为5%，于100℃下加热20分钟。
（2）水解：控制反应温度为50℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为9，加入胰酶水解蛋白酶，加酶量为原料鲜重的1%，反应60分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至95℃保持10分钟。
（4）过滤：采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液真空干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例八
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为9%，于90℃下加热25分钟。
（2）水解：控制反应温度为55℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入胰酶水解蛋白酶，加酶量为原料鲜重的1.5%，反应20分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至90℃保持15分钟。
（4）过滤：采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液加热干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例九
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为7%，于80℃下加热30分钟。
（2）水解：控制反应温度为60℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为8.5，加入胰酶水解蛋白酶，加酶量为原料鲜重的0.5%，反应100分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至85℃保持20分钟。
（4）过滤：采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例十利用水解蛋白酶Alcalase水解得到鸡骨酶解物
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为9%，于100℃下加热20分钟。
（2）水解：控制反应温度为60℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为9，加入水解蛋白酶Alcalase，加酶量为原料鲜重的1%，反应55分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至95℃保持10分钟。
（4）过滤：采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液喷雾干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例十一
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为5%，于90℃下加热25分钟。
（2）水解：控制反应温度为65℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入水解蛋白酶Alcalase，加酶量为原料鲜重的1.5%，反应20分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至90℃保持15分钟。
（4）过滤：采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液加热干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例十二
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为1%，于80℃下加热30分钟。
（2）水解：控制反应温度为62.5℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为8.5，加入水解蛋白酶Alcalase，加酶量为原料鲜重的0.5%，反应90分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至85℃保持20分钟。
（4）过滤：采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例十三利用胰蛋白酶水解得到鸡骨酶解物
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为5%，于100℃下加热20分钟。
（2）水解：控制反应温度为50℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为9，加入，加酶量为原料鲜重的1%，反应60分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至95℃保持10分钟。
（4）过滤：采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液喷雾干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例十四
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为9%，于90℃下加热25分钟。
（2）水解：控制反应温度为55℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入胰蛋白酶，加酶量为原料鲜重的1.5%，反应20分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至90℃保持15分钟。
（4）过滤：采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液加热干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例十五
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为7%，于80℃下加热30分钟。
（2）水解：控制反应温度为45℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为8.5，加入胰蛋白酶，加酶量为原料鲜重的0.5%，反应100分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至85℃保持20分钟。
（4）过滤：采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例十六利用AS.1398中性蛋白酶水解得到鸡骨酶解物
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为7%，于100℃下加热20分钟。
（2）水解：控制反应温度为50℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为9，加入，加酶量为原料鲜重的1%，反应60分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至95℃保持10分钟。
（4）过滤：采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液真空干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例十七
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为5%，于90℃下加热25分钟。
（2）水解：控制反应温度为55℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入AS.1398中性蛋白酶，加酶量为原料鲜重的1.5%，反应20分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至90℃保持15分钟。
（4）过滤：采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液加热干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例十八
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为9%，于80℃下加热30分钟。
（2）水解：控制反应温度为60℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为7，加入AS.1398中性蛋白酶，加酶量为原料鲜重的0.5%，反应100分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至85℃保持20分钟。
（4）过滤：采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例十九利用木瓜蛋白酶水解得到鸡骨酶解物
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(80目)。加水至底物浓度为7%，于100℃下加热20分钟。
（2）水解：控制反应温度为50℃，用0.5mol/L盐酸调整pH为6，加入木瓜蛋白酶，加酶量为原料鲜重的1%，反应70分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至95℃保持10分钟。
（4）过滤：采用离心机，4800转/分钟离心8分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液真空干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例二十
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(90目)。加水至底物浓度为5%，于90℃下加热25分钟。
（2）水解：控制反应温度为70℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为8，加入木瓜蛋白酶，加酶量为原料鲜重的1.5%，反应20分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至90℃保持15分钟。
（4）过滤：采用离心机，4400转/分钟离心11分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液喷雾干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例二十一
（1）原料预处理：取1Kg鸡骨剔肉、清洗，进行粉碎(100目)。加水至底物浓度为9%，于80℃下加热30分钟。
（2）水解：控制反应温度为60℃，用0.5mol/L氢氧化钠调整pH为7，加入木瓜蛋白酶，加酶量为原料鲜重的0.5%，反应120分钟。
（3）灭酶：升高反应体系温度至85℃保持20分钟。
（4）过滤：采用离心机，4000转/分钟离心15分钟。
（5）干燥：取离心后的上清液冷冻干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物。
实施例二十二 七种蛋白酶的鸡骨酶解物的体外抗氧活性
按所述的相同步骤重复进行实施例一、实施例四、实施例七、实施例十、实施例十三、实施例十六以及实施例十九。将制得的复合风味蛋白酶Flavourzym的鸡骨酶解物、复合蛋白酶Protamex的鸡骨酶解物、胰酶的鸡骨酶解物、水解蛋白酶Alcalase的鸡骨酶解物、胰蛋白酶的鸡骨酶解物、AS.1398中性蛋白酶的鸡骨酶解物和木瓜蛋白酶的鸡骨酶解物溶于水配制成相同的蛋白质浓度（3mg/mL），分别采用DPPH显色法、Fenton反应测定羟自由基法、铁氰化钾测定法，进行体外清除DPPH自由基、清除羟自由基以及还原能力的实验。如表1所示，复合风味蛋白酶Flavourzyme的鸡骨酶解物的DPPH自由基清除率最高，达91.37±0.68%，而复合蛋白酶Protamex和AS.1398中性蛋白酶的鸡骨酶解物的DPPH自由基清除率均高于85%。复合风味蛋白酶Flavourzyme的鸡骨酶解物的羟自由基清除能力最强，达到35.5±1.09%；木瓜蛋白酶的鸡骨酶解物的还原性最强，达到0.36±0.01(700nm处吸光值)。可见，7种蛋白酶的鸡骨酶解物均具有较强的DPPH自由基、羟自由基的清除能力及还原性，其中对DPPH自由基的清除能力最显著。因此，鸡骨酶解物是一种潜在的天然抗氧化剂和功能性食品。
表1：七种鸡骨酶解物的体外抗氧化活性测定结果
Claims (3)
1.一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
（1）原料预处理：将鸡骨进行粉碎，制成80～100目的骨泥，加水配制成鸡骨泥悬浮液，浓度为5%～9%（重量，以下百分比类同），在80～100℃下加热20～30分钟；
（2）对步骤（1）制得的悬浮液进行酶解：添加蛋白酶进行水解；
（3）对步骤（2）制得的溶液灭酶：升高反应体系温度至85℃～95℃，保持10～20分钟；
（4）将步骤（3）灭酶后的溶液进行过滤：采用离心机，4000～4800转/分钟离心8～15分钟；
（5）干燥：取步骤（4）所述离心后的上清液，干燥至淡黄色粉末，得到鸡骨蛋白酶解物，所述干燥采用冻干、喷雾干燥、真空干燥或加热干燥。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法，其特征在于：在加入蛋白酶进行水解的过程中，选用复合风味蛋白酶Flavourzyme、复合蛋白酶Protamex、胰酶、水解蛋白酶Alcalase、胰蛋白酶、AS.1398中性蛋白酶或木瓜蛋白酶进行水解。
3.根据权利要求2所述的一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法，其特征在于：按以下任意一种方法选用蛋白酶进行水解
选用复合风味蛋白酶Flavourzyme加入时，复合风味蛋白酶Flavourzyme用量为鸡骨泥原料鲜重的0.75%～1.25%，控制反应温度为45～65℃，用盐酸或氢氧化钠调整pH为6～8，反应20～120分钟；
选用复合蛋白酶Protamex加入时，复合蛋白酶Protamex用量为鸡骨泥原料鲜重的1.0%～1.5%，控制温度为45～55℃，用盐酸或氢氧化钠调整pH为6.5～7.5，反应20～100分钟；
选用胰酶加入时，胰酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0.5%～1.5%，控制温度为50～60℃，用氢氧化钠调整pH为8.0～9.0，反应20～100分钟；
选用水解蛋白酶Alcalase加入时，水解蛋白酶Alcalase用量为鸡骨泥原料鲜重的0.75%～1.5%，控制反应温度为60～65℃，用氢氧化钠调整pH为8.0～9.0，反应20～90分钟；
选用胰蛋白酶加入时，胰蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0.5%～1.5%，控制温度为45～55℃，用氢氧化钠调整pH为8.0～9.0，反应20～100分钟；
选用AS.1398中性蛋白酶加入时，AS.1398中性蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0.5%～1.5%，控制温度为50～60℃，用氢氧化钠调整pH为7.0～9.0，反应10～100分钟；
选用木瓜蛋白酶加入时，木瓜蛋白酶用量为鸡骨泥原料鲜重的0.5%～1.5%，控制温度为50～70℃，用盐酸或氢氧化钠调整pH为6.0～8.0，反应20～120分钟。
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