CN102887940A

CN102887940A - 来源于贝类加工副产物的生物活性肽及其制备方法

Info

Publication number: CN102887940A
Application number: CN2011102058234A
Authority: CN
Inventors: 孙媛霞; 管于平; 曾艳
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2013-01-23

Abstract

本发明公开了一类以贝类加工固、液副产物为原料制备的具有血管紧张素转移酶抑制活性及具有抗氧化活性的多肽及其制备方法。采用复合酶催化技术对贝类加工副产物进行分步水解，水解物经分离纯化，得到具体不同生理活性功能的多肽。本发明得到的是一类肽类水解物，具有很高血管紧张素转移酶抑制活性，具有清除自由基的能力、并具有很强的还原力；可广泛用于保健食品、功能性食品、辅助降压药物等产品中，具有广阔的市场前景。而且本发明工艺简单可行，易于工业化生产。

Description

来源于贝类加工副产物的生物活性肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生化技术领域，更具体地说是涉及一种来源于贝类的具有生理活性的功能肽及其制备方法。

背景技术

高血压病是一种全球性常见多发病，对人类健康危害极大。由于药物治疗高血压病会引起多种不良反应，因而从天然蛋白质中提取具有抗高血压活性的多肽，具有食物安全性高、无副作用等优点而将成为今后高血压非药物治疗的重要部分。

血管紧张素转移酶(Angiotensin I-converting Enzyme，ACE，EC 3.4.15.1)是作用于血管紧张素I的一种酶，血管紧张素I是通过利用血管紧张肽原酶消化血管紧张素原生成的，并通过释放其C-末端的两个氨基酸将其转化为血管紧张素II。血管紧张素转移酶的作用不仅能产生具有增强血压作用的血管紧张素II，还能使具有降血压效果的缓激肽失活。由于这些作用，一直将血管紧张素转移酶抑制剂用作高血压的治疗剂或辅助治疗剂。

自1970年以来发现第一个自然产生的从毒蛇的毒液中分离得到的ACE抑制物以来，不断有新的抗高血压活性肽被研究和发现。目前很多ACE抑制剂已上市销售，尽管这类合成药物对降低高血压的作用显著，但长期使用出现的不良反应。因此，无副作用的降血压治疗剂或非药物辅助治疗制剂亟待研究与开发。

具有血管紧张素转移酶抑制作用的肽存在于自然产物，例如，来自小麦、稻米和玉米等植物蛋白，酪蛋白、卵蛋白、鱼蛋白和明胶等动物蛋白的酶降解产物中。所以，从天然蛋白中分离提取具有血管紧张素转移酶抑制作用的肽具有原料来源方便、成本低等优点，而且提取的多肽安全性高、没有副作用，已成为一种发展趋势。

目前利用微生物酶催化技术获得生物活性肽产品已经成为健康保健食品添加剂领域的开发热点。日本对来自水产品的生物活性多肽进行了大量的研究，发现其序列中含有降血压、促进生长、提高免疫力、抗衰老、抗肿瘤等活性的多种肽段。(1)日本早在10年前就开始着手研究从鱼体废弃物中提取生物活性蛋白，1993年日本化成公司开发了从鱼鳞(日本专利：JP593000和JP5155900)及从鲑鱼鱼皮中提取生物活性肽的工艺(日本专利：JP2001200000)；(2)美国专利US2002164681使用木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等对鱼皮蛋白进行酶解后得到生物相容性很高的生物活性蛋白肽；(3)欧洲专利EP682873使用胃蛋白酶、胰蛋白酶从鱼肉加工废弃物中制得生物活性肽。也有许多来源食品蛋白的ACE抑制肽，包括鱼类(欧洲专利第1094071号)，动物乳蛋白(国际申请公开号WO99/65326)，植物(中国专利公开号CN1731934)。

自古以来，海洋生物资源就是人类食物的重要来源。贝类动物是除鱼类外的又一大类供人类使用的海洋水产品。目前在我国台湾、沿海城市大量繁殖养育，主要有扇贝、淡水蛤等品种。贝类产品在加工时，一般是用水蒸煮后加工成各种各样的美食。但是，煮沸后剩下的汤汁以及取出肉体后剩余的外套膜大多数是直接废弃，然而，在废弃的汤汁及外套膜中含大量优质的蛋白质。

本专利利用贝类加工液体与固体副产物-汤汁及外套膜为原料，根据底物的特性和对水解产物品质、生物活性的要求，对食品蛋白酶进行高活性定向催化的筛选与优化，以专一高效的多酶复合体建立先进的生物催化及转化技术体系，用以开发具有抑制ACE活性的肽及具有抗氧化活性的多肽，用于开发高血压的治疗辅助剂及抗氧化的功能性保健食品。

发明内容

本发明的第一个目的是提供来源于贝类的生物活性功能肽(ACE抑制活性肽及抗氧化活性肽)。

本发明以廉价易得的贝类加工副产物(汤汁及外套膜)为原料，采用复合酶体系催化技术分步水解原料，经过分离纯化后得到具有ACE抑制活性的多肽、清除自由基能力及还原力的生物活性多肽。

得到的ACE抑制活性肽可以用于高血压的辅助治疗，分离的生物活性功能肽进一步可加工成口服液、胶囊、片剂等，达到变废为宝、综合高效利用海洋资源的目的。

本发明的第二个目的是提供一种简单有效的制备上述功能肽的方法。

详细内容如下：

一、原料的准备

首先将扇贝去壳后取出贝柱，将剩下的外套膜组织取出，用研磨仪粉碎成肉泥；然后加入一定量的去离子水，煮沸约20min左右，冷却至室温；

或者以河蚌、贝柱煮沸加工的汤汁为原料(冷冻保存，由企业提供)，加酶水解前加热浓缩。

原料煮沸一是可以杀死微生物，二是煮熟后的原料更易被水解，有利于提高回收率。

二、复合酶催化反应

1、初级水解

将煮沸冷至室温的样品分组，第一组不加入任何酶作为对照；第二组加入肽酶G、肽酶R、蛋白酶R、蛋白酶A中的一种或几种，在30～60℃条件下反应6～18h，酶∶底物＝1∶1000～2500(W/W)；

反应结束，水解液在沸水浴中处理10min终止酶的反应；

然后10000～20000g冷冻离心20～30min，得到的上清液无菌过滤后冷冻干燥，即得到初级水解物。

2、二级水解

取一定量的初级水解物，用pH2.0～4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，加入胃蛋白酶，在30～60℃条件下反应2～6h，酶∶底物＝1∶50～200(W/W)；

或者取一定量的初级水解物，用pH7.0～9.0的磷酸盐缓冲液溶解，加入胰蛋白酶，在30～60℃条件下反应2～6h，酶∶底物＝1∶50～200(W/W)；

反应结束，水解液在沸水浴中处理10min终止酶的反应；

然后10000～20000g冷冻离心20～30min，得到的上清液无菌过滤后，冷藏保存备用。

三、水解物的分离与纯化

1、凝胶过滤层析

采用GE healthcare AKTA Purifier快速蛋白纯化系统，对二级水解物进行初步分离纯化，用紫外检测器检测洗脱液的吸收值，并收集不同峰的洗脱液；

测定不同峰的洗脱液的清除自由基能力、还原能力ACE抑制活性。

清除自由基能力的测定：采用ABTS法，Trolox作为标准进行测定。

还原能力的测定：采用FRAP(Ferric-reducing antioxidant power)法测定。

ACE抑制活性：采用分光光度法，Captopril作为标准测定不同峰的洗脱液的ACE抑制活性。

2、RP-HPLC法分离纯化

采用Agilent 1200型高效液相反相色谱，用乙腈溶液梯度洗脱，将经凝胶过滤层析分离获得的具有高抑制ACE活性的多肽进一步分离纯化，用紫外检测器检测洗脱液的吸收值，并收集不同峰的洗脱液；

采用分光光度法，Captopril作为标准测定不同峰的洗脱液的ACE抑制活性。

将具有高抑制ACE活性的多肽重新上样纯化，用乙腈溶液浓度梯度洗脱，收集洗脱液，无菌过滤后保存备分析检测用。

技术效果

在贝类加工过程中存在大量的汤汁及外套膜组织，目前这些下脚料大多直接废弃，不仅造成环境的污染，还造成大量优质蛋白质资源的浪费。

1、本发明以水产加工下脚料贝类的外套膜组织及加工煮沸汤汁为原料，原料廉价易得；实现水产生物资源的高效增值利用，节约了成本；

2、本发明所使用的酶属于食品级的酶，安全性高；

3、本发明采用复合酶催化技术，分步水解，实现对酶解过程和时间的控制，产物的转化率与生物活性功能大大提高；

4、本发明工艺简单，成本低，易于工业化生产；

具体实施方式

实施例1：

下面以扇贝加工过程中产生的副产物——外套膜组织为例对本发明做进一步的描述。

1、首先将冷冻的外套膜组织解冻，洗净，用研磨仪粉碎均质成糜；

2、加入1倍外套膜组织湿重的去离子水，煮沸20min，然后冷却至室温；样品分两组，第一组加酶，第二组不加酶作为对照；

3、调节两组样品的pH值至7.5，第一组按照原料湿重∶酶＝1∶8000(W/W)加入复合酶(包括蛋白酶、肽酶)；

4、45℃反应12h，反应结束后，沸水浴处理10min，终止反应；

5、将水解液20000g离心20min，将得到的上清冻干得到初级水解物；

6、得到的初级水解物加入胃蛋白酶或胰蛋白酶进一步水解；水解条件如下：

(1)用pH2.2的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解初级水解物，酶∶底物＝1∶100(W/W)加入胃蛋白酶，37℃反应3小时，反应结束后，沸水浴处理10min，终止反应；

(2)用pH8.0的磷酸盐缓冲液溶解初级水解物，酶∶底物＝1∶100(W/W)加入胰蛋白酶，37℃反应3小时，反应结束后，沸水浴处理10min，终止反应；

7、将水解液20000g离心20min，得到的上清液采用凝胶过滤层析，层析条件如下：

(1)采用GE healthcare AKTA Purifier快速蛋白纯化系统，Sephadex G-25柱；

(2)分别在280nm和215nm处检测洗脱液的吸收率，并收集不同峰的洗脱液；

(3)不同峰的洗脱液各取1mL，冷冻干燥后分别检测ACE活性、抗氧化活性及还原力的测定；

8、将得到的高抑制ACE活性的多肽用RP-HPLC进行进一步纯化，纯化条件如下：

(1)采用Agilent 1200型高效液相色谱，TSK-gel ODS-80TS柱；

(2)220nm处检测洗脱液的吸收率，并收集不同峰的洗脱液；

(3)不同峰的洗脱液各取1mL，冷冻干燥后分别检测ACE活性；

(4)将得到的高抑制ACE活性的多肽重新上样纯化，然后用16％～30％乙腈梯度洗脱30min。

经过上述步骤的分离纯化，分离出具有较高抑制ACE活性的多肽。

对得到的不同的多肽进行分析检测：

1、多肽含量测定：采用Lowry法和OPA(o-phthaldialdehyde)法，BSA和甘氨酸作为标准物测定水解液中多肽含量；

2、抑制ACE活性的测定：采用分光光度法，Captopril作为标准进行测定；

3、质谱分析：MALDI-TOF/MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry)分析多肽的分子量。

根据ACE抑制活性测定结果，分离纯化获得活性肽的IC₅₀最高能达到58.51μM，属于竞争性抑制类型。

纯化后活性肽质谱分析图谱表明，具有较高ACE抑制活性的小肽分子主要分布在500～1000Da之间(见说明书附图1)。

实施例2：

下面以河蚌加工过程中产生的副产物-煮沸汤汁为例对本发明做进一步的描述。

1、首先将冷冻的河蚌煮沸汤汁解冻，煮沸10min，冷却至室温；样品分两组，第一组加酶，第二组不加酶作为对照；

2、调节两组样品的pH值至7.5，第一组按照原料固形物含量干重∶酶＝1∶8000(W/W)分步加入复合蛋白酶(包括蛋白酶和肽酶)；

3、45℃、100rpm反应6h；

4、反应结束后，沸水浴处理10min，终止反应；

5、20000g离心20min，得到的上清液采用凝胶过滤层析，层析条件如下：

(2)样品先用0.22μm滤膜过滤(Millipore)；

(3)上样0.5mL，其蛋白含量10mg/mL，用Milli Q水作为流动相洗脱，洗脱速率1mL/min；

(4)分别在280nm和215nm处检测洗脱液的吸收率，并收集不同峰的洗脱液；

(5)不同峰的洗脱液各取1mL，冷冻干燥后分别检测所得水解物的清除自由基能力和还原能力；

经过上述步骤的分离纯化，最终分离出四个不同峰(Frac I、Frac II、Frac III和FracIV)的肽类水解物。

对得到的不同的肽类水解物进行分析检测：

1、肽含量测定：采用Lowry法和OPA(o-phthaldialdehyde)法，BSA和甘氨酸作为标准物测定水解液中肽含量；

2、清除自由基能力的测定：采用ABTS法，Trolox作为标准进行测定；

3、还原能力的测定：采用FRAP(Ferric-reducing antioxidant power)法测定；

4、质谱分析：MALDI-TOF/MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry)分析肽的分子量。

各项检测结果如下：

1、加工副产物水解前后清除自由基和还原力的比较见说明书附图中的图2

2、各Fraction的肽含量如下：

FracI：0.12mM/mg/ml

FracII：0.62mM/mg/ml

FracIII：0.86mM/mg/ml

FracIV：0.07mM/mg/ml

3、肽类水解物的清除自由基和还原力的测定见说明书附图中的图3

4、肽类水解物的质谱分析见说明书附图中的图4

根据分析检测结果得到：Frac II具有很强的还原力，其分子量主要分布在1000～5000Da；Frac III具有很强的清除自由基的能力，其分子量小于1000Da。

附图说明：

1)图1是实施例1中具有高ACE抑制活性小肽的质谱分析；

2)图2中，左图是实施例2水解前后清除自由基能力的测定的图，右图是还原力测定的图；

3)图3中，左图是实施例2所得水解产物经分离纯化后ABTS法测定清除自由基能力的图，右图是FRAP法测定还原力的图；

4)图4是实施例2中分离纯化后所得到的肽类水解物的质谱分析的图谱(上面为Frac II，下面为Frac III)；

Claims

1.一类生物活性功能肽；

2.权利要求1所述的生物活性功能肽包括具有很高ACE抑制活性，或者具有很强的清除自由基能力，或具有很强的还原力；

3.权利要求1所述的生物活性功能肽来源贝类加工副产物；

4.权利要求2所述的生物活性功能肽，所用原料来自贝类加工处理后的残留外套膜及煮沸汤汁；

5.权利要求2所述的具有很高ACE抑制活性的多肽，其分子量在500～1000Da之间；

6.权利要求2所述的具有很强的清除自由基能力的生物活性功能肽的分子量小于1000Da；

7.权利要求2所述的具有很强的还原力的生物活性功能肽分子量范围主要分布在1000～5000Da。