CN103980347A - 一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途，该降压肽的氨基酸序列为Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1），ESI-MS检测给出分子量为497.65Da（[M+H]+498.48Da）。制备时蒸馏水洗净大黄鱼鱼鳔，用高速组织捣碎机匀浆，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液抽提，硫酸铵分级沉淀得粗蛋白；粗蛋白经胰蛋白酶和碱性蛋白酶依次酶解，酶解物经离心、超滤和色谱精制，得到降压肽。本发明降压肽的制备工艺科学合理，双酶酶解过程易于控制，制备的降压肽对血管紧张素转化酶（ACE）具有显著的抑制作用，且具有易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作药物和保健食品。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼类活性肽及其制备方法和用途，尤其涉及一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途。
背景技术
人体血压受多种因素的调节，其中最重要的因素是升压系统（肾素－血管紧张素系统，RAS)和降压系统（激肽释放酶－激肽系统，KKS)之间的平衡。而血管紧张素转化酶（ACE）是影响升压系统和降压系统平衡的重要因素。ACE主要通过三种方式升高人体血压：（1）将无活性的血管紧张素I（AngI）碳端的His-Leu切除，使血管紧张素I转换为具有很强血管收缩活性的血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），引起血压升高；（2）使KKS系统中的降血压物质缓激肽失活，导致血压升高；（3）通过刺激肾上腺皮质释放醛固酮，减少肾脏对水分和盐的排泄，增加了细胞外液量和血浆量，加大静脉回流量，间接引起血压升高。因此，如果抑制了ACE的活性，就可能有效防治高血压。
降血压肽（ACEIP），又称为ACE抑制肽，可通过酶解食源蛋白获得，其突出优点是只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用，不会有降压过度现象发生。除降压功能，ACEIP食用安全性高，较化学降压药物（如赖诺普利、培哚普利等）副作用小，还具有易消化吸收、免疫促进，抗凝血和抗肿瘤等功能。基于食源蛋白降压肽具有的独特优点，已成为目前研究的热点。
但是，申请人研究发现，以大黄鱼鱼鳔为原料，利用酶解技术制备大黄鱼鱼鳔降压酶解产物的工艺研究处于空白阶段，而以鱼鳔酶解产物为材料制备降压肽及其应用更是未见报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种大黄鱼鱼鳔降压肽，该降压肽降压作用强、安全无毒副作用，易于消化吸收。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种大黄鱼鱼鳔降压肽的制备方法，该工艺科学合理。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种大黄鱼鱼鳔降压肽的应用。
本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼鳔降压肽，其特征在于该降压肽的氨基酸序列为Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1），ESI-MS检测给出分子量为m/z 497.65 Da（[M+H]+ 498.48 Da）。
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼鳔降压肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）大黄鱼鱼鳔蒸馏水洗净、破碎匀浆，按料液比1g:8～10 ml的比例加入NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（0.2mol/L，pH 7.0），于 0～4 ℃下振荡抽提24～48 h，以8000～12000 rpm的转速离心15～25 min，得上清液；上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵浓度（重量/体积百分比）达到30%，静置1～3 h后，以8000～12000rpm的转速离心15～25 min，去除沉淀物，上清液中继续加入硫酸铵，使其浓度达到60%（重量/体积百分比），静置1～3 h后，以8000～12000 rpm的转速离心15～25 min，得沉淀物并置于透析袋中用蒸馏水透析18～24 h，透析液冷冻干燥，得鱼鳔粗蛋白；
2）取鱼鳔粗蛋白，按照料液比1 g:15~20 mL加入双蒸水，调节pH值至7.5~8.0，于35~40℃保温10~15 min；按照鱼鳔湿重的1.0~1.5%加入第一种蛋白酶，于35~40℃温度下酶解3~5 h；酶解液调pH值至9.0~10.0，于40~50℃保温10~15 min；按照鱼鳔湿重的1.0~1.5%加入第二种蛋白酶，于40~50℃温度下酶解2~4 h；
3）将酶解液加热到90~95℃灭活10~15 min，4500~5000 rpm离心15~20 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到降压肽。
作为优选，所述步骤2）中的第一种蛋白酶为胰蛋白酶，酶活力≥1.85×105 U/g。
作为优选，所述步骤2）中的第二种蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.90×105 U/g。
作为改进，所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：
超滤：将上清液调至pH 6.5~7.5，于0.12~0.15 MPa的工作压力和25~30 ℃的工作温度下采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa组分，得超滤酶解液；
层析：将上述超滤酶解液用双蒸水配成10~15 mg/mL的溶液，经过大孔树脂分离，用双蒸水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和90%乙醇梯度洗脱，分别收集相应梯度的洗脱溶液，干燥，得四个组分；其中，ACE抑制活性最强组分为大孔树脂纯化酶解物；将上述大孔树脂酶解物用双蒸水配成10~15 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，ACE抑制活最强组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据ACE抑制活性得1个高活性降压肽Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1）。
优选，所述大孔树脂为DA 201-C，所述凝胶为Sephadex LH-20。
再优选，所述反相高效液相色谱条件为：进样量15~20 μL；色谱柱为Waters Spherisorb ODS-2 C18；柱温为25~30 ℃；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈；梯度洗脱：0~10 min乙腈浓度为10%；11~40 min乙腈浓度从10匀速升至60%；洗脱速度0.8~1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm。
本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼鳔降压肽的应用，其特征在于大黄鱼鱼鳔降压肽Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1）对ACE具有显著的抑制作用，可用作降压药品和保健食品。
与现有技术相比，本发明的优点在于：（1）本发明采用的原料是大黄鱼鱼鳔，经过本发明的技术转化可有效提高大黄鱼的加工附加值，对大黄鱼产业的可持续发展具有重要意义；（2）本发明选用胰蛋白酶和碱性蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，使降压肽最大程度地释放；制备的降压肽是鱼鳔蛋白经酶水解制得，安全、无毒副作用，并且抑制ACE作用显著，可用作降压药品和保健食品。
附图说明
图1是本发明的大孔树脂分离组分（F2）的凝胶Sephadex LH-20层析图；
图2 是本发明的Sephadex LH-20凝胶制备酶解物（F23）的RP-HPLC图；
图3是本发明的降压肽Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1）的RP-HPLC图；
图4是本发明的Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1）的质谱（ESI-MS）图和结构式。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：一种大黄鱼鱼鳔降压肽的制备方法，制备工艺流程如下：大黄鱼鱼鳔"组织捣碎"缓冲液提取粗蛋白"双酶酶解"酶解物"超滤"大孔树脂分段"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"降压肽。
1）大黄鱼鱼鳔洗净、破碎匀浆，按料液比1g:10 ml的比例加入NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（0.2mol/L，pH 7.0），于 4 ℃下振荡抽提48 h，以12000rpm的转速离心15 min，得上清液；上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵浓度（重量/体积百分比）达到30%，静置1 h后，以12000 rpm的转速离心15 min，去除沉淀物，上清液中继续加入硫酸铵，使其浓度达到60%（重量/体积百分比），静置2 h后，以12000rpm的转速离心15 min，得沉淀物并置于透析袋中用蒸馏水透析24 h，透析液冷冻干燥，得鱼鳔粗蛋白；
2）取鱼鳔粗蛋白，按照料液比1 g: 20 mL加入双蒸水，调节pH值至8.0，于35℃保温10 min；按照鱼鳔湿重的1.0 %加入胰蛋白酶，于35 ℃温度下酶解4 h；酶解液调pH值至9.5，于45℃保温10 min；按照鱼鳔湿重的1.5%加入碱性蛋白酶，于45℃酶解3 h；
3）将酶解液加热到90 ℃灭活15 min，5000rpm离心20 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到降压肽。
①超滤：将酶解上清液调至pH 7.0，于0.12 MPa的工作压力和30 ℃的工作温度下采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液；
②DA 201-C大孔树脂分段：将上述超滤酶解液用双蒸水配成10~15 mg/mL的溶液，经过DA 201-C大孔树脂分离，用双蒸水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和90%乙醇梯度洗脱，分别收集相应梯度的洗脱溶液，干燥，得四个组分（F1-F4），其中，50%乙醇洗脱组分的ACE抑制活性最强，记为大孔树脂纯化酶解物(F2)；
③Sephadex LH-20凝胶层析：将上述大孔树脂纯化酶解物(F2)用双蒸水配成15 mg/mL的溶液，经过Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，ACE抑制活性最强组分为凝胶层析酶解物（F23）（图1）。
表1大黄鱼鱼鳔蛋白制备降压肽时各制备组分的ACE抑制活性（n = 3）
| 制备方法 | EC50 （mg/mL） |
| 粗蛋白酶解物 | 1.457±0.023 |
| 超滤分段组分（MW < 1 kDa） | 0.572±0.013 |
| DA201-C大孔树脂分段组分F2（50%乙醇洗脱组分） | 0.103±0.009 |
| 凝胶纯化组分F23 | 0.078±0.003 |
| Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1） | 0.024±0.0001 |
④高效液相色谱精制：将上述凝胶制备酶解物（F23）用双蒸水配成50 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化（条件：进样量15~20 μL；色谱柱为Waters Spherisorb ODS-2 C18；柱温为30 ℃；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈；梯度洗脱：0~10 min乙腈浓度为10%；11~40 min乙腈浓度从10匀速升至60%；洗脱速度0.8 mL/min；紫外检测波长220 nm），根据ACE抑制活性得1个高活性降压肽（见图2）。
⑤结构检测：收集ACE抑制活性最高的1个降压肽经检测为单一峰（见图3），利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1），ESI-MS检测给出分子量为m/z 497.65 Da（[M+H]+ 498.48 Da）（见图4）。
将上述制得的大黄鱼鱼鳔降压肽Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1）进行ACE抑制活性实验。实验结果表明：Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1）对ACE具有显著的抑制活性（EC50 0.024±0.0001）。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋学院
<120> 一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途
<130> 2014
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Leu Arg Pro Ile
1
Claims (7)
1.一种大黄鱼鱼鳔蛋白降压肽，其特征在于该降压肽的氨基酸序列为Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1），分子量为497.65 Da。
2.一种权利要求1所述的大黄鱼鱼鳔降压肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）大黄鱼鱼鳔洗净、破碎匀浆，按料液比1g:8～10 ml的比例加入NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（0.2mol/L，pH 7.0），于 0～4 ℃下振荡抽提24～48 h，以8000～12000rpm的转速离心15～25 min，得上清液；上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵浓度（重量/体积百分比）达到30%，静置1～3 h后，以8000～12000rpm的转速离心15～25 min，去除沉淀物，上清液中继续加入硫酸铵，使其浓度达到60%（重量/体积百分比），静置1～3 h后，以8000～12000rpm的转速离心15～25 min，得沉淀物，并置于透析袋中用蒸馏水透析18～24 h，透析液冷冻干燥，得鱼鳔粗蛋白；
2）取鱼鳔粗蛋白，按照料液比1 g:15~20 mL加入双蒸水，调节pH 值至7.5~8.0，于35~40℃保温10~15 min；按照鱼鳔湿重的1.0~1.5%加入第一种蛋白酶，于35~40℃温度下酶解3~5 h；酶解液调pH 值至9.0~10.0，于40~50℃保温10~15 min；按照鱼鳔湿重的1.0~1.5%加入第二种蛋白酶，于40~50℃温度下酶解2~4 h；
3）将酶解液加热到90~95℃灭活10~15 min，4500~5000 rpm离心15~20 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到降压肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的第一种蛋白酶为胰蛋白酶，酶活力≥1.85×105 U/g。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的第二种蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.90×105 U/g。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：
超滤：将上清液调至pH 6.5~7.5，于0.10 ~ 0.15 MPa的工作压力和25~30℃的工作温度下采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解物；
层析：将上述超滤酶解物用双蒸水配成10~15 mg/mL的溶液，经过大孔树脂分离，用双蒸水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和90%乙醇梯度洗脱，分别收集相应梯度的洗脱溶液，干燥，得四个组分，其中，ACE抑制活最强组分为大孔树脂纯化酶解物；将上述大孔树脂酶解物用双蒸水配成10~15 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，ACE抑制活最强组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据ACE抑制活性得1个高活性降压肽Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1）。
6.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述大孔树脂为DA 201-C，所述凝胶为葡聚糖凝胶Sephadex LH-20；所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 μL；色谱柱为Waters Spherisorb ODS-2 C18；柱温为25~30 ℃；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈；梯度洗脱：0~10 min乙腈浓度为10%；11~40 min乙腈浓度从10匀速升至60%；洗脱速度0.8~1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm。
7.一种权利要求1所述的大黄鱼鱼鳔降压肽的应用，其特征在于Leu-Arg-Pro-Ile（SEQ ID No：1）对ACE具有显著的抑制作用，且具有易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作降压药品和保健食品。
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