CN104531816A

CN104531816A - 酶法联产绿豆ace抑制肽和免疫活性肽的工艺方法

Info

Publication number: CN104531816A
Application number: CN201510000269.4A
Authority: CN
Inventors: 刁静静; 张建强; 陈洪生; 张丽萍
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2015-01-04
Filing date: 2015-01-04
Publication date: 2015-04-22

Abstract

本发明涉及的是酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法，这种酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法：将绿豆蛋白粉溶解于小分子活化水，配置成质量百分比浓度为7%-40%的蛋白溶液，将绿豆蛋白酶解，灭活，移出上清液；绿豆降血压肽的制备：分子量分别为1kDa和3kDa的绿豆肽超滤膜进行处理，将截留后的1kDa-3kDa的滤过液经冷冻干燥即得绿豆ACE 抑制肽粉末产品；绿豆免疫活性肽的制备：将剩余溶液采用中性蛋白酶和风味蛋白酶继续进行水解2~3h，移出上清液；将制备得到的上清液采用1kDa的超滤膜截留分子量小于1kDa的绿豆肽，采用纳滤膜进行脱盐处理，将处理后的滤液经冷冻干燥即可得到绿豆免疫活性肽。本发明用一套工艺条件下制备出具有不同生物功能的绿豆肽，工艺简单、高效，资源利用率高。

Description

酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法

一、技术领域

本发明涉及的是杂粮深加工领域，具体涉及的是酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法。

二、背景技术

心脑血管疾病、癌症、糖尿病、关节炎、阿尔茨海莫氏病和自身免疫缺陷等慢性病的发生已成为危害人类健康的杀手，尤其是心脑血管疾病和自身免疫缺陷等疾病的发生，仅2013年我国成年人高血压患病率就高达19.3%，因自身免疫疾病而导致的癌症、关节炎、肺部疾病等患病率约为2.7%。目前对于高血压疾病的治疗多采用合成药物，这些合成药物需要长期服用，存在明显的副作用，还会使机体产生药物依赖性；另外，在现代生活中，各种应激所致的免疫力降低是目前人类普遍处于免疫力低下的“亚健康”状态，因此如何预防和治疗高血压、提高机体免疫调节能力已成为全社会共同关注的焦点。目前科学家们正在积极寻求和研究天然、安全的保证身体健康、降压效果好、以及调节人体疲劳、增强免疫力的保健功能食品。

绿豆为药食两用的豆科植物种子，其含有丰富蛋白质、淀粉、矿物质、维生素及人体必需氨基酸，其蛋白质含量达19.5%-33.1%，主要是球蛋白。绿豆具有清热解毒、消暑止渴、利尿消肿、解毒保肝等功效，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、调节免疫、降血脂等作用，因此具有良好的食用和药用价值。研究发现绿豆中的蛋白质内服可保护胃肠粘膜，绿豆蛋白还可与有机磷农药、汞、砷、铅化合物结合形成沉淀物，使之减少或失去毒性。但是目前我国对于绿豆的加工，大多数生产厂家都侧重于绿豆淀粉的生产加工，而忽略绿豆蛋白的开发，把它作为生产废料或牲畜饲料，造成绿豆资源的浪费，增加了绿豆淀粉的生产成本。

肽是蛋白质的酶解产物，肽在原蛋白序列中没有生物活性，在食品加工过程或胃肠消化过程中这部分肽被释放出来后显示出一定的生物活性。有关研究表明蛋白质经可控酶解作用可制备出具有促进钙吸收、降血压、降胆固醇、抗氧化等作用的功能肽，而且食物源蛋白质制备得到的肽具有天然、安全的特点。Gardner（1978）等人的研究表明在机体中小分子肽能够在肠道被大量吸收，吸收后能够更容易、更快的被人体利用合成所需的蛋白质。因此对于生物活性肽的开发是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的项目。

在目前报道中，采用生物酶法作用于绿豆蛋白质生产功能肽是目前应用较多的方法，而且随着对不同功能生物活性肽的制备方法、机理方面研究的深入，绿豆生物活性肽的开发已逐步显现出了极大的应用前景。但目前对于绿豆生物活性肽的开发多是局限于具有某一种功能的活性肽的生产，生产工艺单一，这对原料和能源造成了极大的浪费。目前没有同时生产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的报道。

三、发明内容

本发明的目的是提供酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法，这种酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法用于解决现有技术中绿豆生物活性肽的开发只局限于以生产某一种功能活性肽为目标，生产工艺单一，资源和能源浪费大的问题。

本发明采用的技术方案是：这种酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法：

（1）将绿豆蛋白粉溶解于小分子活化水，配置成质量百分比浓度为7%-40%的蛋白溶液；将蛋白溶液置于90℃恒温水浴锅中预热10~15 min后再冷却至40℃~50℃；

（2）绿豆蛋白的酶解：将冷却后的绿豆蛋白溶液用1mol/L NaOH 调节，使pH值在8.0~9.5；加入酶用量与底物蛋白质量之比为1% - 3%的碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的酶活力200000U，于45℃~55℃水浴下水解2-4h，反应过程中不断加入1 mol/L的NaOH，使pH保持恒定，待水解结束后调节pH到7.0， 95℃~100℃灭活10min，移出上清液；

（3）绿豆降血压肽的制备：将步骤（2）制备的绿豆肽采用截留分子量分别为1kDa和3kDa的超滤膜进行处理，将截留后的1kDa-3kDa的滤过液经冷冻干燥即得绿豆ACE 抑制肽粉末产品；

（4）绿豆免疫活性肽的制备：将步骤（3）处理后的剩余溶液采用中性蛋白酶和风味蛋白酶继续进行水解2~3h，移出上清液；中性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:2；

（5）将步骤（4）制备得到的上清液采用1kDa的超滤膜截留分子量小于1kDa的绿豆肽，采用纳滤膜进行脱盐处理，将处理后的滤液经冷冻干燥即可得到绿豆免疫活性肽。

上述方案步骤（4）中的中性蛋白酶的酶用量与底物蛋白质量之比为0.5%~1.5%，风味蛋白酶的酶用量与底物蛋白质量之比为1%~2% 。

上述方案中步骤(4）得到的绿豆ACE抑制肽得率为47.14%。

上述方案中步骤(5）得到的绿豆免疫肽得率为32.8%。

有益效果：

1、本发明以绿豆淀粉生产的副产物绿豆蛋白为原料，分别采用不同蛋白酶先后进行水解，一套工艺条件下制备出具有不同生物功能的绿豆肽，生产工艺简单、高效，资源利用率高，达到了真正意义上的节能减排。

2、本发明中的溶剂采用的是小分子活化水，可提高绿豆肽的得率。小分子活化水作用于绿豆蛋白，可改变绿豆蛋白的四级结构，从而使连接氨基酸的肽键结构发生重组，也使得蛋白质大分子长肽链结构变为小分子短肽链，多肽链的氨基酸分子由数目大的结构变为数目小的短键。

3、本发明得到的绿豆ACE 抑制肽ACE活性抑制率高，采用ACE抑制活性的测定方法测定绿豆肽的ACE活性抑制率，图2说明，ACE活性抑制率越高说明绿豆肽的降血压效果越好。

四、附图说明：

图1是本发明提供的酶法联产绿豆ACE抑制肽和绿豆免疫活性肽的工艺方法流程图；

图2是不同级分绿豆肽的ACE抑制活性；

图3是不同级分绿豆免疫活性肽的活性。

五、具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明：

实施例1：

如图1所示，这种酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法，具体步骤如下：

（1）绿豆蛋白粉溶解于小分子活化水，配置成20%的蛋白溶液；将蛋白溶液置于90℃恒温水浴锅中预热10 min；将预热后的绿豆蛋白溶液冷却至50℃。

（2）绿豆蛋白的酶解。将冷却后的绿豆蛋白溶液用1mol/L NaOH 调节pH值在9.0；加入1.5% ([E]/[S]) 碱性蛋白酶（酶活力200000U，酶添加量为底物蛋白质量的1.5%），于50℃水浴下水解3 h，反应过程中不断加入1 mol/L的NaOH，使pH保持恒定，待水解结束后调节pH到7.0， 95℃灭活10min，移出上清液。

（3）绿豆降血压肽的制备。按步骤2）的方法制备的绿豆肽采用截留分子量分别为1kDa和3kDa的超滤膜进行处理，将截留后的1kDa-3kDa的滤过液经冷冻干燥即得绿豆ACE 抑制肽粉末产品，绿豆ACE抑制肽得率为47.14%。

（4）绿豆免疫活性肽的制备。将步骤3）处理后的剩余溶液采用0.5%（[E]/[S]）中性蛋白酶和1.0%（[E]/[S]）风味蛋白酶（中性蛋白酶与风味蛋白酶的质量配比为1:2）继续进行水解3 h，移出上清液。

（5）将步骤4）制备得到的上清液采用1kDa的超滤膜截留分子量＜1kDa的绿豆肽，采用纳滤膜进行脱盐处理，将处理后的滤液经冷冻干燥即可得到绿豆免疫活性肽。

（6）按步骤5）制备的绿豆免疫肽得率为32.8%。

实施例2：

这种酶法联产绿豆制备ACE 抑制肽和绿豆免疫活性肽的方法，具体步骤如下：

（2）绿豆蛋白的酶解。将冷却后的绿豆蛋白溶液用1mol/L NaOH 调节pH值在9.0；加入2.0 % ([E]/[S]) 碱性蛋白酶（酶活力200000U，酶添加量为底物蛋白质量的2.0%），于50℃水浴下水解2.5 h，反应过程中不断加入1 mol/L的NaOH，使pH保持恒定，待水解结束后调节pH到7.0， 95℃灭活10min，移出上清液。

（3）绿豆降血压肽的制备。按步骤2）的方法制备的绿豆肽采用截留分子量分别为1kDa和3kDa的超滤膜进行处理，将截留后的1kDa-3kDa的滤过液经冷冻干燥即得绿豆ACE 抑制肽粉末产品，绿豆ACE抑制肽得率为45.2%。

（4）绿豆免疫活性肽的制备。将步骤3）处理后的剩余溶液采用1.0%（[E]/[S]）中性蛋白酶和2.0%（[E]/[S]）风味蛋白酶（中性蛋白酶与风味蛋白酶的质量配比为1:2）继续进行水解2 h，移出上清液。

（6）按步骤5）制备的绿豆免疫肽得率为33.1%。

有关的研究发现机体中高含量的NO会促进炎症反应的发生，还具有致癌作用，免疫活性的测定主要是通过抑制NO生成量来体现的，NO生成量越小说明机体的免疫功能越强。如图3， NO生成量可以体现绿豆肽的免疫功能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法，其特征在于：这种酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法：

（2）绿豆蛋白的酶解：将冷却后的绿豆蛋白溶液用1mol/L NaOH 调节，使pH值在8.0~9.5；加入酶用量与底物蛋白质量之比为1% - 3%的碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的酶活力200000U，于45℃~55℃水浴下水解2-4 h，反应过程中不断加入1 mol/L的NaOH，使pH保持恒定，待水解结束后调节pH到7.0， 95℃~100℃灭活10min，移出上清液；

2.根据权利要求1所述的酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法，其特征在于：所述的中性蛋白酶的酶用量与底物蛋白质量之比为0.5%~1.5%，风味蛋白酶的酶用量与底物蛋白质量之比为1%~2% 。

3.根据权利要求2所述的酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法，其特征在于：所述的步骤（4）得到的绿豆ACE抑制肽得率为47.14%。

4.根据权利要求2所述的酶法联产绿豆ACE抑制肽和免疫活性肽的工艺方法，其特征在于：所述的步骤（5）得到的绿豆免疫肽得率为32.8%。